白藜蘆醇對過氧化氫誘導巨噬細胞炎性衰老的抑制作用及機制

蘇雙，阮云軍，馬懿，馮騫，石靈，林捷琪，吳賽珠

(1南方醫科大學南方醫院，廣州5140000；2遵義醫學院附屬醫院)

白藜蘆醇對過氧化氫誘導巨噬細胞炎性衰老的抑制作用及機制

蘇雙1，阮云軍1，馬懿2，馮騫1，石靈1，林捷琪1，吳賽珠1

(1南方醫科大學南方醫院，廣州5140000；2遵義醫學院附屬醫院)

目的觀察白藜蘆醇(Res)對過氧化氫(H2O2)誘導的THP-1巨噬細胞炎性衰老的抑制作用，并探討其作用機制。方法用160 nmol/L佛波酯誘導人單核細胞THP-1巨噬細胞，將其隨機分為四組，空白對照組給予培養基培養；H2O2組給予培養基培養1 h后再加300 μmol/L H2O2培養24 h；Res+H2O2組給予40 μmol/L Res培養1 h，再加300 μmol/L H2O2培養24 h；Res組給予 40 μmol/L Res培養24 h。用衰老相關β-半乳糖苷酶染色法檢測衰老THP-1巨噬細胞比例，用Western blotting法檢測THP-1巨噬細胞內視網膜細胞瘤蛋白(Rb)、磷酸化視網膜細胞瘤蛋白(pRb)、自噬微管相關蛋白1清鏈3(LC3)、Bcl-2同源結構域蛋白(Beclin1)、泛素結合蛋白(p62)表達；ELISA法檢測THP-1巨噬細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結果與空白對照組比較，H2O2組衰老細胞比例高(P<0.05)；與H2O2組比較，Res+H2O2組衰老細胞比例低(P<0.05)。與空白對照組比較，H2O2組Rb蛋白表達高、p-Rb蛋白表達低(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組Rb蛋白表達低、p-Rb蛋白表達高(P均<0.05)。與空白對照組比較，H2O2組，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低，p62蛋白表達高(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高，p62蛋白表達低(P均<0.05)。與空白對照組比較，H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平高(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低(P均<0.05)。空白對照組與Res組以上指標比較，P均>0.05。結論白藜蘆醇可能通過促進細胞自噬來抑制H2O2誘導的THP-1巨噬細胞炎性衰老。

炎性衰老；巨噬細胞；白藜蘆醇；細胞自噬

衰老是一個復雜的生理病理過程。在衰老過程中大量細胞和分子發生變化，加速炎性疾病的發生發展。這種現象在老年人中被稱作“炎性衰老”[1]。炎性衰老是指衰老進程中機體呈現的低水平慢性促炎狀態，其中巨噬細胞、細胞應激和遺傳因素在炎性狀態中起了主要作用。越來越多研究表明，炎性衰老的促炎細胞對動脈粥樣硬化(AS)的發生發展起一定作用[1，2]。白藜蘆醇(Res)是一種多酚類植物抗毒素，是作用最強的沉默信息調節因子2相關酶1激活劑[3]，并具有廣泛的生物活性及藥理作用，能夠抵抗或延緩與衰老及氧化等相關的疾病。研究表明，Res能保護血管內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞，延緩細胞衰老，減少炎性因子的釋放，對抗AS病變[3，4]。巨噬在AS疾病發生發展中發揮重要作用[5]。2016年1月～2017年7月，本研究觀察Res對過氧化氫(H2O2)誘導的THP-1巨噬細胞的衰老及炎癥的干預作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人單核細胞株THP-1購自中國科學院；RPMI1640細胞培養基、胎牛血清培養基購自Gibco；Res、佛波酯(PMA)、3-甲基腺嘌呤購自Sigma；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、BCA檢測蛋白試劑盒購自北京碧云天；巨噬細胞內視網膜細胞瘤蛋白(Rb)、磷酸化視網膜細胞瘤蛋白(pRb)、自噬微管相關蛋白1清鏈3(LC3)、p62/SQSTMI、Bcl-2同源結構域蛋白(Beclin1)、泛素結合蛋白(p62)、β-actin抗體均購自美國CST公司；羊抗兔二抗購自杭州弗德生物科技有限公司；ECL發光液購自Thermo公司；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒購自深圳晶美生物有限公司。

1.2 細胞培養、誘導及分組 THP-1細胞復蘇后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養，待細胞長至80%～90%時行下一步實驗。用含160 nmol/L PMA及10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養基刺激36 h，誘導為THP-1巨噬細胞。細胞接種于96孔培養板(1×104/孔)，每孔加含160 nmol/L PMA的培養液100 μL，置于含5% CO2培養箱中誘導貼壁36 h。棄培養液，每孔加入培養液100 μL。根據預實驗獲得H2O2的最佳刺激濃度為300 μmol/L、最佳時間為24 h，Res分別為40 μmol/L、24 h。隨機將細胞分為四組，空白對照組給予培養基培養；H2O2組于培養基培養1 h后再加300 μmol/L H2O2100 μL培養24 h；Res+H2O2組給予40 μmol/L Res 100 μL培養1 h，再加300 μmol/L H2O2100 μL培養24 h；Res組給予40 μmol/L Res 100 μL培養24 h。

1.3 THP-1巨噬細胞衰老情況檢測 采用衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-GA)染色。收集各組細胞按照1×104/孔接種于六孔板中培養。按SA-β-GA染色試劑盒說明書進行操作。各組經藥物干預24 h后PBS漂洗2次，半乳糖染色固定液固定15 min。吸凈固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3 min。吸凈PBS，每孔加入工作液1 mL，37 ℃、隔絕CO2孵育過夜。顯微鏡下觀察細胞。鏡下觀察體積增大，胞質和胞核出現藍色沉淀物的細胞為陽性細胞，即為衰老細胞。每次隨機挑選100個細胞，計算衰老細胞比例。

1.4 THP-1巨噬細胞內Rb、pRb、LC3、Beclin1、p62蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集細胞孵育24 h后去上清培養液，用冰冷的PBS漂洗3次，加入細胞裂解液(RIPA∶PMSF∶PI=100∶1∶1)，冰上靜置30 min，收集細胞裂解產物，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清蛋白于-80 ℃保存備用(1個月內檢測)。按試劑盒BCA法測定蛋白濃度。各取蛋白30 μg，加5×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，凝膠電泳分離，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，PVDF膜與一抗(1∶1 000)4 ℃孵育14～16 h，TBST漂洗3×10 min，加羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫下孵育1.5 h，TBST漂洗3×10 min，用化學發光液顯色。以β-actin為內參照，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶積分吸光度(OD)值，以靶蛋白OD值與β-actin OD值的比值作為靶蛋白相對表達量。

1.5 THP-1巨噬細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 收集各組細胞，將其接種于96孔板中培養24 h，收集上清液。按ELISA試劑盒說明書進行操作，制作標準樣本，標準品孔加標準品50 μL、鏈霉親和素-HRP 50μL；樣品孔加入樣品40 μL、生物素標記的抗炎因子抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL。輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每次3 min，洗凈PBS，依次加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光孵育5 min，加入終止液50 μL，用酶標儀測波長450 nm處OD值，根據標準品濃度及對應OD值計算各樣品濃度。以上實驗均重復3～5次，取平均值。

2 結果

2.1 各組衰老細胞比例比較 培養24 h，空白對照組、H2O2組、Res+H2O2組、Res組衰老細胞比例分別為13%、80%、50%、12%。與空白對照組比較，H2O2組衰老細胞比例高(P<0.05)；與H2O2組比較，Res+H2O2組衰老細胞比例低(P<0.05)。

2.2 各組細胞Rb、p-Rb、LC3B、Beclin-1、p62蛋白表達比較 與空白對照組比較，H2O2組Rb蛋白表達高、p-Rb蛋白表達低(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組Rb蛋白表達低、p-Rb蛋白表達高(P均<0.05)。與空白對照組比較，H2O2組，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低，p62蛋白表達高(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高，p62蛋白表達低(P均<0.05)。空白對照組與Res組以上指標比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組細胞p-Rb、Rb、LC3B、Beclin-1、p62蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

2.3 各組細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與空白對照組比較，H2O2組TNF-α、IL-1β、IL-6水平高(P均<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+Res組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低(P均<0.05)；空白對照組與Res組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，P均>0.05。見表2。

3 討論

大量細胞和分子在衰老過程中發生了變化，加速了炎癥性疾病的發生發展，如AS。AS發生發展過程中的核心因素之一是炎癥。炎癥不僅參與AS的形成過程，而且引發急性血栓、斑塊破裂等并發癥[6]。單核源性巨噬細胞作為AS中重要的炎性細胞在AS的發生發展中起重要作用，不僅參與泡沫細胞的形成，且合成、分泌大量的炎性物質，如TNF-α、IL-1β、IL-6[5]。前期研究已成功用氧化應激誘導心肌細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞衰老[7，8]。另外相關研究表明，氧化低密度脂蛋白可促進THP-1巨噬細胞增殖[9]。AS中巨噬細胞隨著慢性氧化應激的累積發生衰老，最終壞死，導致斑塊破裂誘發急性心腦血管事件，提示抗氧化劑可延緩衰老。細胞衰老過程受控于細胞信號傳遞系統，Rb蛋白調控著細胞周期中最關鍵的調控點G1/S期，Rb蛋白磷酸化后失活，釋放核轉錄因子E2F，游離的E2F啟動G1/S期轉換相關基因表達，推動細胞周期的進程[10]。本研究發現，與空白對照組相比，H2O2組Rb蛋白表達高，p-Rb蛋白表達低。說明本研究所設計的衰老細胞模型可靠。

表2 各組細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

Res具有廣泛的生物活性及藥理作用，能夠抵抗或延緩與衰老以及氧化等相關的疾病[11]。但目前Res對巨噬細胞衰老的影響研究還較少。本研究發現，與H2O2組比較，40 μmol/L的Res能上調pRb蛋白表達、下調Rb蛋白表達，說明Res可減輕H2O2誘導的THP-1巨噬細胞衰老。

自噬是真核細胞中普遍存在的一種保護機制，通過自噬可以清除細胞中損傷或衰老的細胞器及生物大分子，來維持細胞的穩態[12]。研究表明，抑制細胞自噬可導致早衰；而衰老的組織和細胞中自噬減少，例如正常老化的人腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ等蛋白表達下調[13]，提示衰老的機制之一可能是細胞自噬功能下調。本研究發現，與空白對照組比較，H2O2組細胞Becin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達低，p62蛋白表達高；而給予40 μmol/L的Res干預后，Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達上調，p62蛋白表達下調，表明Res可能通過調控細胞自噬來干預H2O2誘導的巨噬細胞衰老，維持細胞穩態。研究發現，巨噬細胞通過自噬在AS中起保護作用[14]。在AS中，炎癥的激活可導致蛋白酶分泌，組織破壞和斑塊破裂[6]。TNF-α、IL-1β、IL-6都是典型的炎性因子，Ida等[15]研究發現，巨噬細胞通過自噬可明顯抑制炎性因子的分泌。本研究發現，與H2O2組比較，H2O2+Res組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低，說明通過自噬可以抑制巨噬細胞炎性因子的分泌。

綜上所述，本研究Res通過誘導自噬反應抑制了H2O2誘導的THP-1巨噬細胞衰老，至于其相關信號通路需進一步進行探討。這可能是治療AS和其他炎癥疾病的一種新思路。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.012

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吳賽珠(E-mail:wusaizhuDr@126.com)

2017-07-03)