環形鐵粒幼細胞水平變化與MDS患者染色體核型、基因突變及預后的關系

謝宇端，郭潔，董國偉，韓艷，李延偉，肖林娜，孫磊

(中國中醫科學院望京醫院，北京100102)

環形鐵粒幼細胞水平變化與MDS患者染色體核型、基因突變及預后的關系

謝宇端，郭潔，董國偉，韓艷，李延偉，肖林娜，孫磊

(中國中醫科學院望京醫院，北京100102)

目的探討環形鐵粒幼細胞(RS)水平變化與骨髓增生異常綜合征(MDS)患者染色體核型、基因突變及預后的關系。方法取203例MDS患者的血液及骨髓樣本，檢測血紅蛋白、白細胞、血小板；行骨髓細胞形態學檢查，觀察紅系增生、病態造血(紅系巨幼變)，計算RS占有核紅細胞比例。RS計數<15%者為非RS增高MDS組(n=139)、≥15%者為RS增高MDS組(n=64)；骨髓原始細胞計數<5%分為低原始細胞非RS增高MDS組(n=47)、低原始細胞RS增高MDS組(n=53)，骨髓原始細胞數≥5%分為非RS增高難治性貧血伴原始細胞增多(RAEB)組(n=92)、RS增高RAEB組(n=11)。用染色體圖像自動分析系統進行染色體核型分析；用實時定量PCR法檢測基因突變率。通過電話、門診復診等方式對患者進行隨訪，記錄生存時間。采用COX回歸模型分析MDS患者預后影響因素。結果與非RS增高MDS組比較，RS增高MDS組年齡、白細胞計數、血小板計數、紅系增生程度及巨幼變陽性率、基因突變率高(P均<0.05)；與低原始細胞非RS增高MDS組比較，低原始細胞RS增高MDS組以上指標高(P均<0.05)；與非RS增高RAEB組比較，RS增高RAEB組白細胞計數、紅系增生程度高，核型分布較差(P均<0.05)。伴RS增高組的中位生存時間短于非RS增高組(P<0.05)。采用COX回歸模型分析結果顯示，RS是MDS患者預后的獨立影響因素。結論RS水平升高的MDS患者染色體核型分布差、基因突變率高、預后差。

骨髓增生異常綜合征；環形鐵粒幼細胞；染色體核型；基因突變率；預后

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一種后天疾病，由造血干細胞、祖細胞發育異常引起，最早起源于某個造血干細胞、祖細胞，故稱為克隆性造血異常。此種造血細胞的發育異常導致無效造血，即造血質量差。骨髓中發育異常的血細胞形態異常，統稱為病態造血[1]。其病因至今未明。MDS患者存在染色體異常、癌基因和抑癌基因突變及骨髓造血干細胞、祖細胞體外培養生長異常、多種免疫功能異常[2]。部分MDS患者緩慢地向急性白血病轉化[3]，故MDS又稱為白血病前期。鐵粒幼細胞性貧血是一組鐵利用障礙性疾病。鐵粒幼細胞性貧血患者骨髓出現大量環形鐵粒幼細胞(RS)，紅細胞無效生成，組織鐵儲量過多，外周血呈小細胞低色素性貧血。RS也是MDS分型的一個重要指標[4]。本研究探討環形鐵粒幼細胞水平變化與MDS患者染色體核型、基因突變及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年3月～2017年3月我院初診為MDS的患者203例，男118例、女85例；年齡14～82(54.90±10.37)歲，14～40歲19例、41～50歲27例、51～60歲44例、61～79歲83例，80～82歲30例；起病表現為頭昏乏力184例，其他表現主要為出血傾向；均行骨髓穿刺和骨髓活檢確診，符合法國、美國、英國協作組關于MDS的診斷標準；排除繼發性MDS及患其他引起血細胞病態造血疾病的患者。

1.2 血常規檢測 入院次日晨抽取患者空腹靜脈血，檢測血紅蛋白、白細胞、血小板。

1.3 骨髓形態檢查 骨髓穿刺或骨髓活檢時收集骨髓標本。取標本，油鏡下計數骨髓涂片細胞，原始細胞計數為髓系原始細胞在有核細胞中的占比。以紅系所占比≥35%為紅系增生活躍。參照《協和血液病學》，油鏡下計數粒系、紅系及巨核系細胞，每系細胞中存在的病態細胞≥10%認為是病態造血，如紅系巨幼變。取骨髓涂片行骨髓內鐵染色，骨髓片置甲醛蒸氣中固定，3 min后將等量亞鐵氰化鉀和鹽酸溶液混合，加熱至56 ℃，放入骨髓片，30 min后流水沖洗，用堿性復紅應用液復染5 min，用蒸餾水。無水乙醇。蒸餾水沖洗，干燥后顯微鏡下檢查，計算細胞內鐵水平。沉積于胞質鐵顆粒≥5個并環核周≥1/3為鐵染色RS[4]。計算RS占有核紅細胞比例。根據RS比例對患者進行分組，RS比例<15%者為非RS增高MDS組(n=139)、≥15%者為RS增高MDS組(n=64)。依據骨髓原始細胞比例<5%，分為低原始細胞非RS增高MDS組(n=47)、低原始細胞RS增高MDS組(n=53)；骨髓原始細胞比例≥5%，分為非RS增高難治性貧血伴原始細胞增多(RAEB)組(n=92)、RS增高RAEB組(n=11)。

1.4 染色體核型檢測 取骨髓標本3 mL，按照白細胞1.5×109/L接種于培養液培養24 h，加入終濃度0.1 μg/mL秋水仙堿、0.075 mol/mL氯化鉀溶液低滲30 min，以甲醇冰乙酸溶液固定，4 ℃過夜。用染色體圖像自動分析系統進行染色體核型分析。將染色體核型根據文獻[5]分為預后好、中、差三型。

1.5 基因突變檢測 取骨髓標本3 mL，提取其RNA，反轉錄合成cDNA。實時定量PCR擴增目的基因特異引物。分析GATA1基因及預后不良基因(N-RAS、MLL、FLT3、EVI-1等基因)突變情況[5]。

1.6 預后觀察 通過電話、門診復診等方式對患者進行隨訪，隨訪至患者死亡或至2017年3月1日。

2 結果

2.1 各組年齡及血常規指標比較 非RS增高MDS組與RS增高MDS組血紅蛋白水平比較，P>0.05；RS增高MDS組年齡、白細胞計數、血小板計數高于非RS增高MDS組(P均<0.05)。低原始細胞非RS增高MDS組與低原始細胞RS增高MDS組血紅蛋白水平比較，P>0.05；低原始細胞RS增高MDS組年齡、白細胞計數、血小板計數高于低原始細胞非RS增高MDS組(P均<0.05)。非RS增高RAEB組與RS增高RAEB組年齡、血紅蛋白水平、血小板計數比較，P均>0.05；RS增高RAEB組白細胞計數高于非RS增高RAEB組(P<0.05)。見表1。

表1 各組年齡及血常規指標比較

2.2 各組骨髓細胞形態及基因變化比較 非RS增高MDS組與RS增高MDS組染色體核型比較，P>0.05；RS增高MDS組紅系增生程度及巨幼變陽性率、基因突變率高于非RS增高MDS組(P均<0.05)。低原始細胞非RS增高MDS組與低原始細胞RS增高MDS組染色體核型比較，P>0.05。低原始細胞RS增高MDS組紅系增生程度及巨幼變陽性率、基因突變率高于低原始細胞非RS增高MDS組(P均<0.05)。非RS增高RAEB組與RS增高RAEB組基因突變率比較，P>0.05；RS增高RAEB組紅系增生程度高于非RS增高RAEB組，核型分布較差(P均<0.05)。見表2。

表2 各組骨髓細胞形態及基因變化比較(例)

2.3 RS水平對MDS患者預后的影響 截止至2017年3月1日，非RS增高MDS組中位生存時間為21.9個月，RS增高MDS組中位生存時間為12.5個月；低原始細胞非RS增高MDS組中位生存時間為24.1個月，低原始細胞RS增高MDS組中位生存時間為17.9個月；非RS增高RAEB組中位生存時間為14.6個月，RS增高RAEB組中位生存時間為6.8個月。伴RS增高組的中位生存時間均短于非RS增高組(P均<0.05)。

2.4 MDS預后的影響因素 采用COX回歸模型對MDS患者預后影響因素進行分析，結果顯示，RS是MDS患者預后的獨立影響因素(P<0.05)。

3 討論

研究發現，MDS患者存在染色體異常、癌基因和抑癌基因突變、骨髓造血干、祖細胞體外培養生長異常及多種免疫功能異常[6]，但以上異常現象是MDS的結果還是病因仍不清楚，大部分研究傾向于是其結果。貧血是其主要臨床征象，可有不同程度的出血，但程度較輕。大部分MDS患者病情穩定，甚至有好轉的趨勢。正常幼紅細胞(主要是晚幼紅細胞)的細胞核周圍可見到1～5個呈藍色的細小鐵顆粒。含有鐵顆粒的幼紅細胞稱為鐵粒幼細胞。鐵粒幼細胞性貧血患者骨髓出現大量RS，鐵利用不良、血紅素合成障礙、紅細胞無效生成是本病發病的關鍵。因MDS異質性極大，臨床無診斷的“金標準”。WHO根據RS占有核紅細胞百分比及原始細胞百分比將MDS分為5型：難治性貧血、環形鐵粒幼細胞性難治性貧血、RAEB、難治性貧血伴原始細胞增多向白血病轉變型、慢性粒-單核細胞性白血病[7]。本研究根據RS占有核紅細胞百分比進行分組，分析環形鐵粒幼細胞水平變化與MDS患者染色體核型、基因突變及預后的關系。

大部分MDS患者具有染色體異常克隆，畸變類型復雜，包括染色體數目、結構，可涉及每條染色體。主要常見染色體數目異常，較少見染色體易位，因此細胞遺傳學研究對MDS診治及預后評估有重要價值。有研究顯示，異常核型的MDS患者其中位生存期僅為8.7個月，而正常核型的MDS患者其中位生存期可達53.4個月；且正常核型的MDS患者僅有20%～40%轉化為急性白血病，而異常核型的MDS患者60%～70%轉化為急性白血病[8]。本研究，RS增高RAEB組核型分布較非RS增高RAEB組差，說明RS增高的MDS患者其染色體核型分布差，可見RS水平變化與染色體核型有一定關系，具體因果需進一步研究證實。

通過單核苷酸多態性微陣列技術和全基因組或外顯子組測序，發現了25～30種參與MDS發生的基因突變。正常造血干或祖細胞獲得多種遺傳性體細胞突變和(或)表觀遺傳學異常導致細胞自我更新以及分化、成熟異常，形成惡性造血干細胞克隆是MDS的發病基礎。研究證實基因突變和異常表達也能作為分子生物學標志來評估MDS預后，MLL、NRAS、p53基因突變及GATA1、KIT、EVI1基因突變表達與MDS發展有密切關系[9]。本研究RS增高MDS組基因突變率高于非RS增高MDS組，低原始細胞RS增高MDS組基因突變率高于低原始細胞非RS增高MDS組，說明RS水平升高的MDS患者其基因突變率高。

MDS患者外周血細胞減少可反映MDS無效造血，本研究RS增高MDS組白細胞、血小板水平相對較高，說明RS可能主要影響紅系造血，對粒系和巨核系影響不大。RS≥15%的患者骨髓紅系增生程度和巨幼變更加明顯，證明RS主要影響紅系造血而不影響粒系及巨核系。無效性紅細胞易發生原位溶血，是MDS高鐵負荷的形成機制，過高的鐵負荷增加RS形成及MDS轉為白血病的概率，加快MDS進程。本研究隨訪發現，伴RS增高組的中位生存時間短于非RS增高組。進一步經COX回歸模型對MDS患者預后影響因素進行分析，結果顯示，RS是MDS患者預后的獨立影響因素。說明對RS進行檢測可以預測MDS患者預后。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.025

R551.3

B

1002-266X(2017)37-0073-03

郭潔(E-mail:1984xyd@163.com)

2017-07-28)