間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施對稻麥輪作系統土壤微生物群落豐度的影響

紀洋，于海洋，Ralf Conrad，徐華*

1. 南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇 南京 210044；2. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室//中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；3. Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology，Marburg Germany 35043

間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施對稻麥輪作系統土壤微生物群落豐度的影響

紀洋1,2，于海洋2，Ralf Conrad3，徐華2*

1. 南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇 南京 210044；2. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室//中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；3. Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology，Marburg Germany 35043

間隙灌溉模式下控釋肥施用可減緩稻麥輪作系統CH4和N2O排放交互排放效應，從而降低綜合溫室效應，然而有關間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施對稻麥輪作系統土壤微生物的影響鮮有研究。通過采集稻麥輪作系統田間原位試驗新鮮土樣，采用核酸定量技術研究間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施下稻麥輪作系統土壤微生物群落豐度的變化，以探討此耦合措施降低稻麥輪作系統降低CH4和N2O排放的微生物機理。結果發現，除古菌外，稻季土壤細菌、產甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌群落豐度均高于麥季；間隙灌溉顯著影響稻田產甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌數量的季節變化；與尿素相比，施用控釋肥增加了稻麥輪作系統細菌、古菌和產甲烷菌數量，降低了甲烷氧化菌、氨氧化菌、反硝化菌數量。稻季CH4和N2O的排放量與土壤微生物豐度之間存在顯著相關性：CH4排放量與古菌、產甲烷菌和甲烷氧化菌數量均呈極顯著正相關關系（P＜0.01），而與氨氧化菌數量呈顯著負相關關系（P＜0.05）；N2O排放量與氨氧化菌、甲烷氧化菌、nirK型和nosZ型反硝化菌數量均呈顯著正相關關系（P＜0.05），而與nirS型反硝化菌無顯著相關性。研究表明，間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施通過影響稻麥輪作系統相關功能微生物的群落豐度進而減緩CH4和N2O氣體的交互排放效應。

間隙灌溉；控釋肥；稻麥輪作；土壤微生物；CH4和N2O排放

土壤中微生物數量龐大、作用復雜，在土壤生物地球化學過程研究中據有重要地位（吳金水等，2015）。受傳統的研究方法和手段的限制，目前對土壤微生物的認識十分有限。近年來，分子生物學技術在環境微生物領域的應用，促進了人類對微生物種群演變及其環境功能的了解（Prosser，2002）。由于古菌和細菌的16S rDNA具有多個保守區段，被廣泛用于土壤及環境樣品的古菌和細菌群落研究（Dunbar et al.，2001）。稻田 CH4排放包括 CH4產生、再氧化和傳輸3個過程（蔡祖聰等，2009），其中產甲烷菌和甲烷氧化菌是參與前兩個過程的重要微生物（于海洋等，2017）。產甲烷菌功能基因mcrA控制甲烷化的最后一步反應，其將輔酶M連接的甲基催化還原為CH4，甲烷氧化菌功能基因pmoA編碼利用甲烷的第一個關鍵酶，將甲烷氧化為甲醇（Theisen et al.，2005；Conrad et al.，2012）。硝化過程和反硝化過程是農田N2O產生的最主要途徑，而硝化和反硝化是由微生物驅動的生物化學過程。amoA基因控制硝化作用的第一步反應：NH3氧化成NH2OH，是硝酸鹽形成的關鍵反應之一（Chu et al.，2007）。亞硝酸還原酶是反硝化過程中的關鍵酶，其編碼基因（nirK和nirS）是反硝化微生物的關鍵功能基因（Liu et al.，2006）。nosZ基因在反硝化過程中調控著N2O轉化成N2的關鍵環節（R?sch et al.，2002）。因此，土壤中含有上述基因的功能微生物種群豐度結構及其演變規律受到廣泛關注。

以前期淹水、中期烤田和后期干濕交替為特征的間隙灌溉是我國稻田主要的水分管理措施（Yan et al.，2005）。相對于持續淹水，稻田烤田可顯著抑制水稻生長期 CH4排放，但卻極大促進 N2O排放。水稻生長季持續淹水造成稻田極端厭氧，有利于CH4的產生排放；相反，間隙灌溉模式下烤田提高了土壤通透性，土壤中原有的還原狀態被破壞，土壤Eh迅速增加，土壤CH4的生成受到限制（Zhang et al.，2013）。烤田期間土壤氧化CH4能力的提高是導致CH4排放減少的另一個原因（Zhang et al.，2012）。然而，稻田烤田為土壤提供大量的 O2，有利于硝化和反硝化反應同時進行，極大促進稻季N2O排放（蔡祖聰等，2009）。控釋肥是既適應作物全生長季不同生育階段氮素營養的需求，而又不至于導致土壤中剩余無機氮濃度過高的一種可控釋放氮肥。國內外大量研究表明，施用控釋肥可明顯減少稻麥輪作系統溫室氣體排放，尤其是N2O氣體的排放（Delgado et al.，1996；林匡飛等，2000；李方敏等，2004；易瓊等，2013）。前期研究發現，間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施可彌補烤田造成的N2O排放增加，減緩稻田CH4和N2O排放交互排放效應，同時避免高量氮肥施入帶來的生態環境效應（Ji et al.，2013；2014）。然而，有關此耦合措施對稻麥輪作系統土壤微生物種群的影響，尤其是對與CH4和 N2O排放相關的功能微生物種群的了解很少。近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發展，基于 16S rDNA基因及其他功能基因的非培養技術，包括聚合酶鏈式反應（PCR）、克隆文庫技術（Clone）和核酸定量技術（real-time PCR）的出現為揭示自然環境中微生物群落結構多樣性的分子生態學研究開辟了一個全新的研究平臺（Heid et al.，1996）。

本研究通過采集稻麥輪作系統田間原位試驗新鮮土樣，采用熒光定量PCR技術研究間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施對與CH4和 N2O排放相關的土壤微生物群落豐度的影響，以探討此耦合措施降低稻麥輪作系統溫室氣體排放的微生物機理，從而為農田系統溫室氣體減排提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗方案及樣品采集

供試土壤是采自于 2010—2011年江蘇省句容市行香鎮（31°58′N，119°18′E）稻麥輪作試驗田上的原位新鮮土。試驗地屬北亞熱帶季風氣候區，年平均氣溫為 15.1 ℃，年平均降雨量為 1100～1200 mm，稻-麥輪作是該地區的主要耕作制度。試驗土壤為發育于下蜀黃土的爽水性水稻土，其基本理化性質為：pH值6.91，有機碳含量為18.9 g·kg-1，全N含量為1.2 g·kg-1，砂粒（2～0.02 mm）14%，粉粒（0.02～0.002 mm）69%，粘粒（＜0.002 mm）17%，土壤WHC為55%。

試驗共設3個處理：（1）對照處理（CK）：不施氮肥；（2）尿素處理（U）：稻季尿素施用量（以N 計）為 240 kg·hm-2，麥季尿素施用量為 200 kg·hm-2；（3）控釋肥處理（C）：與尿素處理相同施氮量。本試驗所施用的控釋肥為山東金正大生態工程股份有限公司生產的可降解樹脂包膜尿素肥料，含氮量為42%。小區面積均為3 m×5 m，每個處理3次重復，隨機區組排列。

田間管理措施與當地農田管理相同。麥季尿素按基肥∶追肥為6∶4施用（施用時間分別為2010年11月20日和2011年3月6日）；稻季尿素按基肥∶分蘗肥∶穗肥為 5∶2.5∶2.5施用（施用時間分別為2011年7月2日、7月22日和8月20日）；稻麥季控釋肥均作為基肥一次性施入。所有處理均施用 450 kg·hm-2的過磷酸鈣和 225 kg·hm-2的氯化鉀，作為基肥一次性施入。小麥品種為揚麥16號，于2010年11月20日播種，2011年6月10日收割；水稻品種為華粳3號，于2011年7月2日移栽（水稻移栽密度為24 holes·m-2），11月6日收割。水分管理參照當地稻田常規管理方式，采用傳統的前期淹水（7月1日—8月1日）、中期烤田（8月2日—8月13日）、后期干濕交替（8月14日—10月7日）和末期排水落干（10月8日—11月6日）管理模式。

麥季土壤樣品于2011年6月10日（小麥成熟期）采集；稻季土壤樣品分別于2011年7月23日水稻幼苗期（淹水期）、8月3日分蘗期（烤田開始）、8月11日拔節期（烤田結束）和11月4日（成熟期）采集。各小區按“S”形多點采樣法取表層（0～15 cm）土壤混合。取200 g新鮮土壤用液氮冷凍后于-80 ℃保存，供分子生物學研究。

1.2 土壤DNA提取及定量PCR

稱取0.5 g土壤用Fast DNA SPIN KIT試劑盒（MP Biomedicals，Eschwege，Germany）提取總 DNA（Conrad et al.，2012），操作按說明書進行。所提DNA質量與長度通過1%凝膠電泳檢測。所得DNA均稀釋10倍后再進行下游實驗。細菌16S rRNA基因、古菌16S rRNA基因、兩個CH4排放相關功能基因（產甲烷菌功能基因mcrA、甲烷氧化菌功能基因pmoA）以及4個N2O排放相關功能基因（氨氧化細菌功能基因 amoA、反硝化菌功能基因 nirS、nirK、nosZ）的定量PCR分析均采用SYBR Green染色法。各基因定量PCR所用的引物和參考文獻如表 1 所示。采用 SPSS 13.0 for Windows（SPSS Inc.，USA）軟件對不同處理的功能基因數目進行顯著性差異分析（One-way ANOVA），并對稻田CH4和N2O排放量與土壤微生物種群數量進行相關性分析（Pearson two-tailed test）。

表1 各目標基因定量PCR所用引物及參考文獻Table 1 Primers and references used in qPCR

2 結果與分析

2.1 稻麥輪作系統土壤細菌和古菌的群落豐度

圖1所示為麥季收獲期和后續稻季不同生長發育階段土壤細菌和古菌群落的豐度變化。稻麥輪作系統土壤中檢測到的細菌數量多于古菌，介于7.2×108～6.0×109copies·g-1（干土，下同）之間，其中稻季細菌數量明顯高于麥季。隨著水稻生長，各處理細菌數量逐漸降低。與不施氮肥的對照處理相比，水稻生長前期，施用尿素和控釋肥均促進細菌數量增加，其中尿素處理細菌數量高于控釋肥處理；而在水稻和小麥收獲期，施用尿素降低細菌數量，施用控釋肥對細菌數量沒有顯著影響。檢測到的古菌數量在 1.3×108～3.7×108copies·g-1之間，稻麥兩季之間古菌數量沒有顯著差異，隨著水稻生長，各處理古菌數量逐漸增加。與不施氮肥的對照處理相比，施用尿素和控釋肥均降低稻季和麥季古菌數量；與尿素相比，施用控釋肥增加土壤中古菌數量。

2.2 稻麥輪作系統土壤產甲烷菌和甲烷氧化菌的群落豐度

如圖 2所示，產甲烷菌（mcrA）數量介于3.9×106～2.1×107copies·g-1之間，其中稻季產甲烷菌數量明顯高于麥季。在水稻生長季，分蘗期和拔節期處于排水落干的烤田期，其產甲烷菌數量小于處于淹水的水稻幼苗期和干濕交替的收獲期。在水稻幼苗期，施用尿素和控釋肥均促進產甲烷菌數量的增加，隨著水稻生長，氮肥施用逐漸抑制產甲烷菌生長，在水稻和小麥收獲期，尿素和控釋肥均顯著抑制產甲烷菌生長，其中控釋肥處理產甲烷菌數量高于尿素處理。

圖1 稻麥輪作系統中土壤細菌和古菌的群落豐度Fig. 1 Abundances of Bacteria and Archaea in the rice-wheat rotation ecosystem

圖2 稻麥輪作系統中土壤產甲烷菌（mcrA）和甲烷氧化菌（pmoA）的群落豐度Fig. 2 Abundances of methanogens (mcrA) and methanotrophs (pmoA) genes in the rice-wheat rotation ecosystem

甲烷氧化菌（pmoA）數量介于 1.3×107～4.2×107copies·g-1之間，其中稻季甲烷氧化菌的數量大于麥季，且隨著水稻的生長而增加。在麥季收獲期，尿素和控釋肥施用均降低麥季甲烷氧化菌數量。在水稻生長前期，尿素施用抑制甲烷氧化菌生長，隨著水稻的生長，在水稻收獲期，尿素施用促進甲烷氧化菌生長。在整個稻季，控釋肥施用抑制甲烷氧化菌生長，但其抑制作用小于尿素處理。

2.3 稻麥輪作系統土壤氨氧化細菌和反硝化菌的群落豐度

圖3所示為麥季收獲期和后續稻季不同生長發育階段土壤中與N2O排放相關的功能基因的豐度變化。稻麥輪作系統土壤中氨氧化菌（amoA）的數量比3種反硝化菌數量（nirS、nirK和nosZ）多出2～3個數量級，前者介于 1.6×109～2.1×1010copies·g-1之間，后者分別介于 7.6×106～3.4×107、3.5×107～9.6×107和 2.7×107～1.1×108copies·g-1之間。麥季氨氧化菌的數量小于稻季；整個稻季，氨氧化菌數量變化呈單峰型，在水稻分蘗和拔節期達到最大值，而此時期正是水稻烤田期，土壤經排水落干后硝化作用增強，尿素和控釋肥施用促進氨氧化菌生長，其中尿素處理氨氧化菌數量高于控釋肥處理，隨著水稻生長，土壤中氮素含量逐漸減少，氨氧化菌數量隨之下降。在水稻和小麥收獲期，氮肥處理氨氧化菌數量均高于不施氮處理，其中尿素較控釋肥更能促進氨氧化菌生長。

稻季土壤中與反硝化作用有關的nirS、nirK和nosZ基因拷貝數均高于麥季，說明稻季土壤氧化還原條件更有利于反硝化作用的進行。麥季收獲期，施氮處理以上3種基因拷貝數均高于不施氮處理，但僅nosZ基因有顯著性差異；水稻生長季，3種基因拷貝數隨著水稻的生長而下降，且尿素處理＞控釋肥處理＞不施氮處理。

3 討論

3.1 間隙灌溉對稻麥輪作系統土壤微生物豐度和結構的影響

圖3 稻麥輪作系統中土壤氨氧化菌（amoA）和反硝化菌（nirS/nirK/nosZ）的群落豐度Fig. 3 Abundances of ammonia-oxidizing bacteria (amoA) and denitrifiers (nirS/nirK/nosZ) in the rice-wheat rotation ecosystem

本研究中土壤微生物的豐度在稻麥輪作系統生育期內存在較為明顯的季節差異。除古菌外，稻季土壤細菌、產甲烷菌、甲烷氧化菌、硝化菌和反硝化菌豐度均高于麥季，這是由于稻季氮肥施用量大，水分管理方式較為復雜，根系分泌物的大量產生豐富了土壤有機質的類型和總量，為土壤微生物的生長提供了適宜的條件（Watanabe et al.，2006）。李大明等（2013）研究發現在水稻生長旺盛期（分蘗期），產甲烷菌的數量顯著高于其他時期，本研究也得到類似的結果。本研究稻季的水分管理參照當地稻田常規管理方式，采用前期淹水、中期烤田、后期干濕交替和末期排水落干的管理模式，為了有效控制水稻分蘗，烤田在水稻生長的旺期分蘗期進行。整個水稻生長季產甲烷菌的豐度隨著間隙灌溉的進行和水稻的生長而呈現動態變化。在水稻幼苗期，土壤處于持續淹水狀態，厭氧環境有利于產甲烷菌的生長；分蘗和拔節期，雖然水稻生長旺盛，但烤田增加了土壤通氣性，破壞了產甲烷菌的生存條件，產甲烷菌數量下降，達到最低值；隨著后期干濕交替的進行，產甲烷菌所需厭氧環境逐漸恢復，根系分泌物的大量產生又為產甲烷菌的增加提供了充足的反應底物，產甲烷菌數量逐漸增加，在收獲期達到最大值。Ma et al.（2012）通過研究不同水分管理方式對稻田產甲烷菌數量和結構的影響發現，間隙灌溉水分管理方式顯著增加稻田甲烷氧化菌數量。在本研究中，甲烷氧化菌數量隨著水稻生長而逐漸增加，在收獲期達到最大值，烤田對甲烷氧化菌的數量沒有顯著影響，這可能是由于烤田期土壤銨態氮大部分轉化為硝態氮，盡管烤田有利于甲烷氧化菌的生長，但硝態氮對甲烷氧化菌有一定的脅迫作用（Boer et al.，1988）。

以往研究表明，土壤潛在硝化勢、反硝化勢分別與氨氧化菌、反硝化菌數量呈正相關關系，土壤中大多數微生物數量與土壤氮素養分含量呈正相關（Yuan et al.，2012）；在間隙灌溉模式下，烤田提高稻田土壤通透性，為土壤提供大量的 O2，NH4+-N單氧化酶活性抑制被解除，有利于硝化和反硝化反應同時進行（Towprayoon et al.，2005）。本研究中，水稻生長前期，由于氮肥中氮素快速水解，氨氧化菌和多種反硝化菌數量均隨水稻的生長而逐漸增加；水稻分蘗和拔節期，烤田破壞了土壤厭氧環境，土壤通透性的提高促進氨氧化菌生長和硝化作用的進行，同時硝化作用的產物硝態氮又為多種反硝化菌提供充足的底物，因此氨氧化菌和多種反硝化菌數量在分蘗—拔節期達到最大值，其中氨氧化菌的數量高于反硝化菌，這與以往研究結果一致（Yan et al.，2000）；由于氮素的不斷消耗，氨氧化菌和反硝化菌數量隨之逐漸降低。

3.2 稻麥輪作系統CH4和N2O排放與土壤微生物豐度的關系

土壤微生物在農田 CH4和N2O的產生和排放中發揮著重要作用。稻田CH4排放包括CH4產生、再氧化和傳輸 3個過程（蔡祖聰等，2009），其中前兩個過程都與產甲烷菌和甲烷氧化菌數量及活性密切相關（Theisen et al.，2005）。硝化過程和反硝化過程是農田N2O產生的最主要途徑，而硝化和反硝化是由硝化菌和反硝化菌驅動的生物化學過程（蔡祖聰等，2009）。以往研究發現，水稻田土壤的甲烷排放量受到甲烷氧化菌、產甲烷菌種群數量及其活性的影響，而土壤中N2O的產生與氨氧化細菌和nirS基因反硝化細菌數量的增加有關（陳中云等，2001；保瓊莉等，2011）。結合 Ji et al.（2013；2014）研究數據（表2），得到了類似的結果，稻田CH4和N2O的排放量與土壤微生物豐度之間存在顯著相關性（表3）。稻季不同生長季CH4排放量與相應階段的古菌和產甲烷菌數量之間均存在極顯著正相關關系（P＜0.01）；不同生長季 N2O的排放量與相應階段的氨氧化菌、nirK基因反硝化菌和nosZ基因反硝化菌數量之間均呈顯著正相關關系（P＜0.05），這與以往研究結果一致（Conrad，2007；Miller et al.，2008；Maeda et al.，2010），但與 nirS基因反硝化菌數量沒有顯著相關性（P＞0.05）。因此，控制農田產甲烷菌和硝化、反硝化菌數量可以有效減少CH4和N2O的排放量。

甲烷氧化菌和氨氧化菌分別參與碳氮循環，在CH4和N2O排放方面起著重要作用。甲烷氧化菌和氨氧化菌都傾向于生長在相近的土層，即“通氣-厭氣”界面，可氧化CH4和（Bodelier et al.，1999），這些細菌氧化CH4和的方式是很類似的。因此，甲烷氧化菌氧化甲烷的同時也能氧化銨態氮，氨氧化菌也能消耗大量甲烷（賈仲君等，2003），稻田甲烷氧化和銨氧化具有強烈的交互作用。本研究中，稻季CH4排放量與甲烷氧化菌數量呈顯著正相關關系，而與氨氧化菌呈顯著負相關關系（表 3）。以往研究表明，土壤高濃度 CH4會促進甲烷氧化菌的生長和活性（Arif et al.，1996）。張廣斌等（2010）研究表明，CH4產生潛勢對稻田CH4排放量的影響較大，而CH4氧化潛勢對其影響較小。本研究中，由于產甲烷菌數量的增加促進CH4產生，而高濃度的CH4同時又促進甲烷氧化菌的生長，產甲烷菌數量增加對CH4產生的促進作用強于甲烷氧化菌數量增加對CH4氧化的促進作用，因此產甲烷菌與甲烷氧化菌的數量同時與 CH4排放呈正相關關系。Oneill et al.（1977）高初始甲烷濃度培養會抑了氨氧化菌對的氧化，CH4濃度對氨氧化菌的影響與底物濃度也密切相關，CH4/+比例越高，氨氧化菌氧化甲烷能力越強。本研究中，稻季氨氧化菌數量高峰期出現在排水落干的烤田期（圖 3），良好的通氣條件抑制產甲烷菌的生長和CH4產生，另外淹水期產生的高濃度CH4抑制了氨氧化菌對的氧化，增強了對CH4的氧化能力，因此稻季CH4排放與氨氧化菌數量呈顯著負相關關系。

表2 水稻生長季CH4和N2O排放量Table 2 CH4 and N2O emission during the rice growing season

表3 稻田CH4和N2O排放量與土壤微生物種群數量的相關性分析結果Table 3 Correlation between CH4 and N2O emission and the abundance of soil microbial communities

3.3 控釋肥施用對稻麥輪作系統土壤微生物豐度的影響

控釋肥作為一種新型肥料，不僅可以提高肥料利用率，有效防止環境污染，而且具有提高土壤酶活性、增加土壤微生物數量、降低環境污染等優點（Trenkel，1997）。孟慶英等（2012）研究結果表明，控釋肥施用有利于增加土壤細菌、土壤氮素含量及玉米產量；羅蘭芳等（2007）研究發現，短期施用控釋氮肥稻田土壤的細菌數量明顯高于不施氮處理，周年土壤細菌明顯高于尿素處理。氮肥養分釋放特性不同，其對土壤中微生物數量及土壤中氮素產生影響不同（Yuan et al.，2012）。本研究表明，與不施氮處理相比，施用尿素降低稻麥季收獲期細菌數量，而施用控釋肥增加其數量，這可能是由于尿素施用量過多會導致高濃度 N的脅迫作用同時改變土壤pH值，從而影響細菌的數量和活性，而控釋肥可調節養分釋放模式，滿足作物全生育期對氮的生理需求，更利于提高土壤氮素含量為微生物創造良好的生存環境，刺激微生物的生長和活性。

氮肥施用對土壤產甲烷菌和甲烷氧化菌的影響較為復雜。Schimel（2000）研究表明，氮促進植株生長，為CH4產生提供前體基質，從而促進產甲烷菌的生長和活性；而許靜等（2012）研究結果則相反，高氮肥施用在一定程度上會抑制產甲烷菌的生長，降低其數量。本研究中，施用氮肥降低稻麥季古菌和產甲烷菌豐度，控釋肥的抑制作用小于尿素，這可能是由于尿素施用后通過硝化作用產生硝態氮，提升了土壤氧化還原電位，間接抑制產甲烷古菌的生長。銨態氮肥對土壤甲烷氧化菌的影響隨NH4+和 CH4濃度的不同而變化（Oneill et al.，1977），本研究中，稻季生長前期，氮肥施用降低甲烷氧化菌數量，但稻麥季收獲期，氮肥施用增加其數量，這是由于在稻田高內源CH4濃度條件下，施用銨態氮肥對稻田CH4氧化菌的作用開始表現為抑制，隨著時間的延長和銨態氮的逐漸消失，高濃度CH4和銨態氮的存在促進了甲烷氧化菌的生長（Cai et al.，1997）。以上分析表明，2011年稻季施氮處理降低CH4排放量（表2），主要是由于氮肥對產甲烷菌生長的抑制作用及其對水稻生長前期甲烷氧化菌生長的促進作用。水稻生長前期，與尿素相比，施用控釋肥對產甲烷菌和甲烷氧化菌數量沒有明顯影響，且 2011年稻季尿素處理和控釋肥處理 CH4排放量之間無顯著差異（表2），這進一步說明稻田CH4排放量與產甲烷菌和甲烷氧化菌數量之間具有顯著相關性。

土壤中硝化細菌和反硝化細菌的數量與活性分別影響著土壤硝化作用和反硝化作用的強度。羅蘭芳等（2007）研究發現，短期施用控釋氮肥稻田土壤的氨化細菌和反硝化菌數量明顯高于不施氮處理，氨化細菌、反硝化細菌的數量比尿素處理低，土壤中大多數微生物數量與土壤氮素養分含量呈正相關。本研究得到類似的結論，施用氮肥顯著增加了稻麥季氨氧化菌和多種反硝化菌的數量，其中控釋肥處理微生物數量顯著低于尿素處理，這是由于尿素迅速溶解，氮素的劇增刺激了氨氧化菌和多種反硝化菌的生長繁殖，而控釋肥的氮釋放速率緩慢，對硝化菌和反硝化菌的影響較小。然而，氨氧化菌和反硝化菌數量并不隨氮肥施用量的增加而增加。侯彥林等（2004）室內培養實驗結果表明，當施肥量低于肥土比 1∶400時，硝化菌和反硝化菌數量隨施肥量的增加無顯著變化，而當施肥量高于肥土比 1∶400時，其隨施肥量增加而下降，與Boer et al.（1988）的研究結果一致，這是由于尿素溶解后，高濃度 NO3--N抑制了硝化菌和反硝化菌的生長。本研究 2011年田間原位試驗結果表明，稻季N2O排放主要集中在烤田期，與尿素相比，施用控釋肥顯著降低烤田期N2O排放量，從而降低整個稻季總排放量（表2），這與控釋肥對硝化菌、反硝化菌數量的影響密切相關；施用控釋肥顯著降低氨氧化菌和多種反硝化菌數量，烤田期控釋肥的抑制作用最為明顯（表3）。因此，施用控釋肥可降低氨氧化菌和多種反硝化菌的數量，進而降低稻季N2O排放量。

4 結論

本研究通過采集稻麥輪作系統田間原位試驗新鮮土樣，研究此間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施下稻麥輪作系統土壤微生物群落豐度的變化，以探討此耦合措施降低稻麥輪作系統綜合溫室效應的微生物機理。整個稻麥輪作系統，除古菌外，稻季土壤細菌、產甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌豐度均高于麥季。間隙灌溉顯著影響稻季產甲烷菌、甲烷氧化菌、氨氧化菌和反硝化菌數量的季節變化。稻季CH4和N2O的排放量與土壤微生物豐度之間存在顯著相關性（P＜0.05）。與尿素相比，施用控釋肥降低了土壤氨氧化菌和 nirS/nirK/nosZ型反硝化菌，從而降低稻麥輪作系統 N2O的排放量；增加了土壤細菌、古菌和產甲烷菌數量，降低了甲烷氧化菌數量，從而影響稻麥輪作系統CH4的排放量。本研究表明，間隙灌溉和控釋肥施用耦合措施通過影響稻麥輪作系統相關微生物的群落豐度進而減緩CH4和N2O氣體的交互排放效應。

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Effect of the Coupling Technique of Intermittent irrigation and Controlledrelease Fertilizer on the Abundance of Soil Microbial Communities from Rice-wheat Rotation Ecosystem

JI Yang1,2, YU Haiyang2, CONRAD Ralf3, XU Hua2*
1. College of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China;
2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture//Institute of Soil Science, Chinese Academy of Science, Nanjing 210008, China;
3. Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg, 35043 Germany

The coupling technique of intermittent irrigation and controlled-release fertilizer (CRF) application is expected to reduce CH4and N2O emissions from rice-wheat rotation ecosystem by the author’s previous studies, but its effect on the microbial communities remain poorly understood. Fresh soils were sampled through the rice-wheat rotation seasons in a field experiment to elucidate the microbial mechanisms of effects of the coupling technique of intermittent irrigation and controlled-release fertilizer(CRF) application on CH4and N2O emissions by analyzing the abundance of soil microbial communities using the method Real-time PCR. The abundances of bacterial, methanogens, methanotrophs, ammonia-oxidizing bacteria and denitrifiers were higher during rice growing season than that during wheat growing season. Intermittent irrigation significantly influenced the seasonal variation of abundances of methanogens, methanotrophs, ammonia-oxidizing bacteria and nirS/nirK/nosZ-type denitrifiers. Compared with urea,CRF increased the abundances of archaea, bacteria and methanogens, while decreased the abundances of methanotrophs,ammonia-oxidizing bacteria, nirS/nirK/nosZ-type denitrifiers. CH4and N2O emissions were significantly correlated with the abundances of soil microbial communities. CH4emission was positively correlated with the abundances of archaea, methanogens and methanotrophs (P＜0.01), while it was negatively correlated with the abundances of ammonia-oxidizing bacteria (P＜0.05). N2O emission was positively correlated with the abundances of ammonia-oxidizing bacteria, methanotrophs, nirK-type and nosZ-type denitrifiers (P＜0.05), while no significant relationship was found with nirS-type denitrifiers. The results indicated that the coupling technique of intermittent irrigation and controlled-release fertilizer application mitigated the CH4and N2O emissions from rice-wheat rotation ecosystem by influencing the abundance of related functional microbial communities.

intermittent irrigation; controlled-release fertilizer; rice-wheat rotation; soil microbial communities; CH4and N2O emissions

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.10.008

S154.3; X172

A

1674-5906（2017）10-1696-08

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國家自然科學基金項目（41401268）；江蘇省基礎研究計劃青年基金項目（BK20140992）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（14KJB210006）；土壤與農業可持續發展國家重點實驗室開放基金課題（Y412201414）

紀洋（1986年生），女，講師，博士，研究方向為農田溫室氣排放的生態環境過程及微生物調控機制研究。E-mail: jiyang@nuist.edu.cn*通信作者：徐華（1966年生），男，研究員，博士。E-mail: hxu@issas.ac.cn

2017-07-25