鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1對鐵磷復合物中鐵、磷釋放規律的影響

令狐榮云，余煒敏，王榮萍，梁嘉偉，廖新榮，吳永貴

1. 廣東省生態環境技術研究所//廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650；2. 貴州大學資源與環境工程學院，貴州 貴陽 550025

鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1對鐵磷復合物中鐵、磷釋放規律的影響

令狐榮云1,2，余煒敏1*，王榮萍1，梁嘉偉1，廖新榮1，吳永貴2

1. 廣東省生態環境技術研究所//廣東省農業環境綜合治理重點實驗室，廣東 廣州 510650；2. 貴州大學資源與環境工程學院，貴州 貴陽 550025

中國南方紅壤中的磷素大多以鐵磷復合物的形式被固定于土壤中，磷的利用率較低。通過向土壤中添加以S. oneidensis MR-1為主的生物肥料，促進土壤磷的釋放，減少外源磷肥的輸入，以期達到保護環境和資源節約的目的。采用室內模擬試驗，在純化學培養的條件下，采用接種S. oneidensisMR-1的厭氧體系進行培養，分別以磷吸附態的水鐵礦（水鐵礦-磷）、磷吸附態的針鐵礦（針鐵礦-磷）和磷酸鐵（FePO4-磷）作為體系唯一的磷素和Fe(Ⅲ)來源，3種磷均為土壤中鐵磷復合物的組成成分。結果表明，S. oneidensis MR-1對3種鐵磷復合物中的Fe(Ⅲ)產生了還原效應并將其還原成Fe(Ⅱ)，且Fe(Ⅱ)質量濃度隨試驗時間延長總體呈先增長后穩定的變化趨勢；當3組加入S. oneidensis MR-1的體系Fe(Ⅱ)質量濃度均為最高時，Fe(Ⅱ)平均生成速率表現為：針鐵礦（30.44 mg·L-1·d-1）＞水鐵礦（21.05 mg·L-1·d-1）＞磷酸鐵（6.62 mg·L-1·d-1）；3 組加入 S. oneidensis MR-1的體系Fe(Ⅲ)質量濃度與初始質量濃度相比較均發生了改變，在針鐵礦-磷-菌體系中Fe(Ⅲ)質量濃度極低，而水鐵礦-磷-菌體系和磷酸鐵-磷-菌體系中則大量存在Fe(Ⅲ)；至試驗結束時，磷酸鐵-磷-菌體系中總磷質量濃度是初始時的2.3倍，而針鐵礦-磷-菌和水鐵礦-磷-菌體系的總磷約為初始質量濃度的1/10。因此，S. oneidensis MR-1利用磷酸鐵-磷的過程會促進磷的釋放，使磷酸鐵中磷得以活化，而利用針鐵礦-磷和水鐵礦-磷的過程則會消耗磷，不會造成磷累積。

Shewanella oneidensis MR-1；異化鐵還原；固定態磷；活化

磷是植物生長必不可缺的營養元素之一。為提高作物產量，大量磷肥被施入土壤，據統計，2015農用磷肥施用折純量為843.06萬噸，但土壤磷的當季利用率只有10%～20%（張福鎖等，2008），其他部分均被固定或淋失。特別是在酸性紅壤中，施入土壤中的磷大部分被鐵和鋁固定，形成磷酸鐵鹽、磷酸鋁鹽以及被氧化鐵膠膜包被的磷酸鹽等，這些固定態磷在土壤中大量富集但無法被植物利用（王永壯等，2013），因此，固定態磷的活化利用成為當前植物營養與土壤科學的研究熱點（Wei et al.，2010；龔松貴等，2010；Richardson et al.，2011）。研究表明，固定態磷的轉化與活化受到諸多因素的影響，例如有機酸、根系分泌物、AM真菌等對固定態磷均具有較強的活化效應，可促進其向活性更強的磷轉化（Hu et al.，2005；Hinsinger，2001；張宇亭等，2012）。除上述因素之外，有研究還表明，酸性土壤中磷的釋放與鐵的氧化還原反應密切相關（Phillips et al.，1998），而鐵還原菌是介導土壤鐵的氧化還原反應的主要方式，因此鐵還原菌間接影響著土壤中磷的釋放。

S. oneidensis MR-1屬于革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，是目前被研究得較多的鐵還原菌之一（胡敏等，2014；Lin et al.，2007；Myers et al.，1988；Lovley，2006），它們能以Fe(Ⅲ)為電子受體氧化有機物獲得能量，這個過程對鐵的生物地球化學循環具有重要意義（Ruebush et al.，2006；Cruz-García etal.，2007；汪明霞等，2014）。前期研究結果（令狐榮云等，2016）表明，向土壤中加入鐵還原菌可引起土壤中磷素形態的變化，但各形態間的具體轉化途徑尚未明確。為深入研究鐵還原菌對固定態磷活化的效應及機理，本研究以固定態磷的主要成分磷酸鐵作為研究對象，并以磷吸附態的水鐵礦（水鐵礦-磷）、磷吸附態的針鐵礦（針鐵礦-磷）作為對照，將3種鐵磷復合物作為可供S. oneidensis MR-1利用的唯一磷源與Fe(Ⅲ)源，探究Fe(Ⅲ)還原過程中鐵與磷的變化特征，以期為微生物活化紅壤固定態磷素機理研究提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種來源：S. oneidensis MR-1由廣東省生態環境技術研究所土壤微生物修復實驗室提供。

水鐵礦制備：水鐵礦與針鐵礦均根據Schwertmann et al.（2008）的方法制得。具體步驟為：將40 g Fe(NO3)3·9H2O溶于500 mL去離子水，在劇烈、均勻攪拌下，將1 mol·L-1NaOH連續滴加到Fe(NO3)3溶液中，當pH接近中性時放慢滴加速度，直至pH為7.0，此時溶液為深紅色水鐵礦懸濁液；然后置于磁力攪拌器上繼續攪拌30 min，再將pH調節至7.0，將懸濁液在5000 rpm，4 ℃下冷凍離心15 min，倒掉上清液，加超純水搖勻再離心，如此反復數次洗去其中NO3-。將得到的水鐵礦冷凍干燥，瑪瑙研缽研磨過100目尼龍篩，備用。

針鐵礦制備：在劇烈攪拌的情況下將 100 mL 4.5 mol·L-1KOH 快速加入到 50 mL1 mol·L-1Fe(NO3)3溶液中，并將混合液稀釋到 1 L，然后將混合液置于70 ℃下老化反應60 h，期間用玻璃棒攪拌3～5次，得到黃褐色沉淀，過濾，洗滌沉淀至濾液呈中性，70 ℃烘干沉淀，瑪瑙研缽研磨過100目尼龍篩，備用。

水鐵礦-磷以及針鐵礦-磷制備參照王亞潔等（2015）的方法：將14.1 g水鐵礦粉末和針鐵礦粉末加入600 mL 5 mmol·L-1NaH2PO4溶液中，充分搖勻后，置于30 ℃、100 r·min-1搖床上振蕩24 h，離心后于60 ℃烘干，瑪瑙研缽研磨過100目尼龍篩，即得針鐵礦-磷以及水鐵礦-磷。

磷酸鐵（FePO4·4H2O）：化學純試劑，購于上海潤捷化學試劑有限公司。瑪瑙研缽研磨過100目尼龍篩，備用。

1.2 試驗方法

配制微生物基礎厭氧生長培養基，每升培養基中含有 2.5 g NaHCO3、0.25 g NH4Cl、0.1 g KCl、10 mL微量元素溶液和10 mL維生素溶液（Li et al.，2009）。其中，微量元素溶液和維生素溶液組成如表1、表2所示，并且向體系中加入50 mmol·L-1PEM緩沖溶液，以保持體系pH恒定。此外，厭氧培養體系碳源由葡萄糖（100 mmol·L-1）提供，磷源和Fe(Ⅲ)源由3種鐵-磷復合體提供。具體操作為：稱取3種0.500 g鐵-磷復合體于50 mL血清瓶中，將葡萄糖、培養基以及血清瓶于高壓滅菌鍋中115 ℃滅菌 30 min，置于超凈工作臺中冷卻。嚴格按照無菌操作方法向血清瓶中加入25 mL培養基，3 mL碳源以及2 mL MR-1懸菌液（OD600=2），充氮氣40 min除去體系中的氧氣，密封后于30 ℃生化培養箱中避光靜置培養 26 d，同時設置不加 S.oneidensis MR-1的空白處理組（CK組），期間定時取樣測定相關指標。試驗共設置3組空白處理體系（CK體系）與3組加S. oneidensis MR-1處理體系（加菌體系），分別為水鐵礦-磷-CK體系（Ferrihydrite-P-CK）、針鐵礦-磷-CK 體系（Goethite-P-CK）與磷酸鐵-磷-CK（FePO4-P-CK）體系，水鐵礦-磷-菌體系（Ferrihydrite-P-MR-1）、針鐵礦-磷-菌體系（Goethite-P-MR-1）與磷酸鐵-磷-菌體系（FePO4-P-MR-1）。每個處理設置 3個重復。

表1 維生素溶液Table 1 Vitamin solution

表2 微量元素溶液Table 2 Trace element solution

1.3 樣品處理與分析方法

試驗共進行26 d，分別在第1、3、7、11、15、21、26天取樣測定相關指標，每個處理每次各取出3瓶，充分搖勻后從中吸取2 mL混合液于8 mL 0.5 mol·L-1HCl中，振蕩1 h后離心，用0.45 μm濾膜過濾，濾液用于測定Fe(Ⅱ)和總鐵另取10 mL懸液離心后用0.45 μm濾膜過濾，將濾液消解后測定總磷質量濃度。

Fe(Ⅱ)和總鐵采用鄰菲羅啉分光光度法測定，總磷采用鉬酸銨分光光度法測定。

1.4 數據統計與分析

所有數據采用Microsoft Office Excel 2010進行統計，DPS 2000進行方差分析（Duncan多重比較法），Origin 8.5.1進行作圖。

2 結果與分析

2.1 反應體系中Fe(Ⅱ)質量濃度的變化

各處理Fe(Ⅱ)質量濃度如圖1所示，3組CK體系的 Fe(Ⅱ) 質量濃度在試驗過程中變化均較小；3組加入S. oneidensis MR-1體系則發生變化，Fe(Ⅱ)質量濃度在各個采樣時間點均表現為針鐵礦-磷-菌體系＞水鐵礦-磷-菌體系＞磷酸鐵-磷-菌體系。3組加入S. oneidensis MR-1的體系的Fe(Ⅱ)質量濃度在試驗的前11天均緩慢增加，之后開始呈現較大差別；水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系之間質量濃度差異不顯著（P＞0.05），但它們與磷酸鐵-磷-菌體系的 Fe(Ⅱ)質量濃度間則存在顯著差異（P＜0.05）。水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系的 Fe(Ⅱ)質量濃度在第 15天達到最大值，兩組處理的Fe(Ⅱ)質量濃度分別由最初的74.6和 70.6 mg·L-1上升至 390 mg·L-1和 527 mg·L-1，Fe(Ⅱ)的平均產生率為 21.0 mg·L-1·d-1和 30.4 mg·L-1·d-1；而磷酸鐵-磷-菌體系 Fe(Ⅱ)質量濃度則在試驗的第11天達到最大值，前11 天的Fe(Ⅱ)平均產生率僅為6.6 mg·L-1·d-1。以上結果均表明，S. oneidensis MR-1對Fe(Ⅲ)的還原與體系中礦物類型密切相關。

圖1 反應體系中Fe(Ⅱ)質量濃度的變化Fig. 1 Concentration changes of Fe (Ⅱ) in the reaction system

2.2 反應體系中總鐵質量濃度的變化

圖2所示為試驗中總鐵質量濃度的變化，各體系的總鐵質量濃度均發生改變。其中，水鐵礦-磷-菌體系和磷酸鐵-磷-菌體系的總鐵質量濃度先呈波動變化再趨于平緩，而針鐵礦-磷-菌體系的總鐵質量濃度則呈先上升后穩定的趨勢。對比總鐵與Fe(Ⅱ)質量濃度（圖 1）可知，水鐵礦-磷-菌體系和磷酸鐵-磷-菌體系中的 Fe(Ⅱ)質量濃度為60～600 mg·L-1，而總鐵質量濃度則為 1500～4000 mg·L-1，總鐵/Fe(Ⅱ)比值在 6.5～39.5 之間，表明這兩種體系中鐵多以Fe(Ⅲ)存在，僅有少部分Fe(Ⅲ)被S. oneidensis MR-1還原為Fe(Ⅱ)。針鐵礦-磷-菌體系的總鐵和 Fe(Ⅱ)質量濃度在試驗中的變化趨勢一致，并且在同一時間，前者質量濃度僅略大于后者，表明在試驗過程中，針鐵礦-磷-菌體系中Fe大多以Fe(Ⅱ)形式存在。在培養過程中，3組加菌體系的總鐵質量濃度大致均表現為水鐵礦-磷-菌體系＞針鐵礦-磷-菌體系＞磷酸鐵-磷-菌體系，并且三者間存在顯著差異。

圖2 反應體系中總鐵質量濃度的變化Fig. 2 Concentration changes of TFe in the reaction system

2.3 反應體系中總磷質量濃度的變化

圖 3所示為總磷質量濃度變化，水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系中磷來自于兩種礦物所吸附的磷，由于兩種礦物對磷的吸附能力不同，導致兩者初始質量濃度不同，而磷酸鐵-磷-菌體系中總磷的初始質量濃度較大，約為水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系的10倍。水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系總磷質量濃度在試驗的前 3天急劇下降，兩體系總磷質量濃度分別從初始時的 3.28 mg·L-1和 3.50 mg·L-1驟降至 0.42 mg·L-1和 0.30 mg·L-1，之后有微弱上升趨勢，最后總體處于穩定狀態，且各取樣時間點的總磷質量濃度均與初始質量濃度之間存在顯著差異。磷酸鐵-磷-菌體系的總磷質量濃度在試驗的前11天上升較緩慢，且前11天無顯著差異，之后總磷質量濃度呈大幅度上升趨勢，且與前11天存在顯著差異（P＜0.05）；至試驗結束時，磷酸鐵-磷-菌體系總磷質量濃度明顯高于初始質量濃度，約為初始時的2.3倍。在試驗的前3天，水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系的Fe(Ⅱ) 質量濃度呈急劇升高趨勢，總磷質量濃度則降低，這可能是由于加入體系中的 S. oneidensis MR-1在還原 Fe(Ⅲ)獲取能量的同時利用磷元素及其他營養元素進行增殖所致。

圖3 反應體系中總磷質量濃度的變化Fig. 3 Concentration changes of TP in the reaction system

3 討論

研究表明，S. oneidensis MR-1對水鐵礦以及針鐵礦均有較強的還原作用（Ouyang et al.，2014；Roy et al.，2014；司友斌等，2015），而對磷酸鐵的還原作用則相對較弱（孫宏飛，2006）；試驗進行至后期，針鐵礦與水鐵礦體系的Fe(Ⅱ)均呈現下降趨勢，出現此現象的原因可能是電子在鐵氧化物表面的吸附位點上發生了轉移，與 FeⅡOH±結合生成FeIIFeIIIO(OH)，最終形成穩定性較差的無定形氧化鐵，其在中性條件下可生成磁鐵礦（Fe3O4），而磁鐵礦的形成會消耗Fe(Ⅱ)，從而使Fe(Ⅱ)質量濃度下降（Jeon et al.，2003；Benner et al.，2002）。除磁鐵礦外，Fe(Ⅲ)被還原成 Fe(Ⅱ)后，還可形成菱鐵礦（FeCO3）和藍鐵礦[Fe3(PO4)2·8H2O]等（Zachara et al.，2001）；微生物還原磷酸鐵所生成的藍鐵礦不易被 0.5 mol·L-1HCl溶解，導致磷酸鐵-磷-菌體系中的 Fe(Ⅱ)比水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系少（孫宏飛，2006）。

體系總鐵波動較大的原因可能是：（1）雖然向各處理中添加的S. oneidensis MR-1均為2 mL懸菌液，但由于不同體系中的礦物不同，S. oneidensis MR-1的適應性不同，導致 Fe(Ⅲ)被還原的速率不同；（2）對于水鐵礦-磷-菌體系，S. oneidensis MR-1在還原其中 Fe(Ⅲ)的過程中產生了難溶性磁鐵礦（Fe3O4），磷酸鐵-磷-菌體系中則主要產生藍鐵礦[Fe3(PO4)2·8H2O]，兩種礦物均不易被 0.5 mol·L-1HCl提取，所以只能通過還原劑還原而以Fe(Ⅱ)的形式被測定（曲東等，2001）。

Mott（1981）認為，當反應體系中磷酸鹽濃度較高時，其中的磷可與氧化鐵形成易于解吸的單核（基）配合物；磷酸鹽濃度較低時，則與氧化鐵形成較難解吸的雙核（基）配合物。吸附試驗采用較低濃度的 NaH2PO4溶液（5 mmol·L-1），可能形成了難以解吸的雙核（基）配合物，從而使得水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系磷酸鹽初始質量濃度偏低。試驗進行至第3天時，所有處理的磷酸鹽質量濃度均下降，其中加菌體系下降幅度較大，此后，水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系的磷酸鹽質量濃度一直低于水鐵礦-磷-CK 體系和針鐵礦-磷-CK體系。對于磷酸鐵-磷-CK與磷酸鐵-磷-菌體系，無論是否添加S. oneidensis MR-1，兩組處理的變化趨勢一致，但加入S. oneidensis MR-1的體系磷酸鹽質量濃度略大于未加S. oneidensis MR-1的處理，表明S. oneidensis MR-1的存在能促進磷酸鐵中磷的釋放，但其釋放速率較小。

在水鐵礦-磷-菌體系和針鐵礦-磷-菌體系中，總磷的質量濃度隨著培養時間的延長呈先降低再趨于穩定的現象，這可能是由于在培養初期，S.oneidensis MR-1將體系中的磷轉化為生物有效態磷，其生長繁殖消耗了部分磷，從而導致體系中總磷質量濃度降低。相關研究亦表明（徐國想等，2001），有氧化鐵存在的氧化還原反應體系會因Fe(Ⅲ)水解而產生 Fe(OH)+、Fe(OH)2、Fe(OH)3-等水合物，它們可以與PO43-結合生成絡合物，然后通過沉淀的方式帶走其中的磷，導致體系中總磷質量濃度減小；此外，Fe(Ⅲ)可與PO43-結合生成難溶鹽，也可導致上清液中總磷質量濃度下降，此研究結果也與王亞娥等（2013）的研究結果一致；在磷酸鐵-磷-菌體系中，總磷質量濃度一直呈上升現象，表明S. oneidensis MR-1的存在能夠促使難溶性的磷酸鐵中磷的釋放，孫宏飛等（2006）的研究結果也顯示，向土壤中加入磷酸鐵，在土壤微生物的作用下，土壤中的有效磷會產生累積現象，從而對固定態磷起到活化作用。因此，通過本研究結果可以推測，在紅壤中適量加入S. oneidensis MR-1的生物肥料，可將土壤中的固定態磷素轉化為活性更強的磷素，供給植物生長，但其具體操作與實踐還有待更進一步的研究。

4 結論

S. oneidensis MR-1對水鐵礦、針鐵礦以及磷酸鐵均具有還原作用，對針鐵礦的還原作用最強，對磷酸鐵的還原作用最弱；加入 S. oneidensis MR-1的3個處理的Fe(Ⅱ)質量濃度均隨時間延長呈先增長后趨于平穩的趨勢，在試驗時間內，Fe(Ⅱ)平均生成速率為針鐵礦＞水鐵礦＞磷酸鐵。

S. oneidensis MR-1還原針鐵礦和水鐵礦的過程中會消耗吸附態磷，不會造成體系中磷素累積，而還原磷酸鐵的過程會造成磷素累積，將固定態磷素轉化為非固定態磷，增大磷的活性，但轉化速率較緩慢。

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Effects of Iron-reducing Bacterium Strain Shewanella oneidensis MR-1 on the Release of Iron and Phosphorus from Iron/Phosphorus Compounds

LINGHU Rongyun1,2, YU Weimin1*, WANG Rongping1, LIANG Jiawei1, LIAO Xinrong1, WU Yonggui2
1. Guangdong Institute of Eco-environmental Science & Technology//Guangdong Key Laboratory of Agricultural Environment Pollution Integrated Control,Guangzhou 510650, China;
2. College of Resources and Environmental Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China

In South China, phosphorus (P) is largely fixed as iron/phosphorus (Fe/P) compounds in the red soils with a low P utilization rate. In this study, for environmental protection and resource conservation, biofertilizer with Shewanella oneidensis MR-1,an iron-reducing bacterium strain, as its main component, was added to the soil in order to enhance soil P release and reduce exogenous P fertilizer input. In the indoor stimulation experiment, anaerobic systems with MR-1 inoculated were set up to investigate the transformation of Fe(Ⅲ) and release of P during Fe(Ⅲ) reduction, with ferrihydrite-P, goethite-P, or FePO4-P as the only source of Fe(Ⅲ) and P. The results showed that S. oneidensis MR-1 reduced the 3 different Fe(Ⅲ) compounds by varying degrees; Fe(Ⅱ)mass concentration first increased with time and then stabilized; when the mass concentrations of Fe(Ⅱ) in the systems were the highest, the average Fe(Ⅱ) production rate of the 3 systems was in the order of goethite (30.44 mg·L-1·d-1)＞ferrihydrite (21.05 mg·L-1·d-1)＞ FePO4(6.62 mg·L-1·d-1); Fe(Ⅲ) mass concentration in the 3 systems with MR-1 inoculated changed during the incubation progress with that in the goethite-P system being extremely low while that in the other 2 systems being high; at the end of the experiment, the total P mass concentration in the FePO4system was 2.3 times that of the initial while that in the other 2 systems was only about 1/10 of the initial. In a word, the introduction of S. oneidensis MR-1 promoted the transformation of FePO4-P and the release of P, but consumed P from ferrihydrite-P and goethite-P with no P accumulation.

Shewanella oneidensis MR-1; dissimilatory Fe (Ⅲ) reduction; fixed phosphorus; activation

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.10.009

S154; X17

A

1674-5906（2017）10-1704-06

令狐榮云, 余煒敏, 王榮萍, 梁嘉偉, 廖新榮, 吳永貴. 2017. 鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1對鐵磷復合物中鐵、磷釋放規律的影響[J]. 生態環境學報, 26(10): 1704-1709.

LINGHU Rongyun, YU Weimin, WANG Rongping, LIANG Jiawei, LIAO Xinrong, WU Yonggui. 2017. Effects of iron-reducing bacterium strain Shewanella oneidensis MR-1 on the release of iron and phosphorus from iron/phosphorus compounds [J]. Ecology and Environmental Sciences, 26(10): 1704-1709.

國家科技支撐項目（2014BAD14B05）；省院合作項目（2013B091500016）；廣州市科技計劃項目（201607010082）；廣東省科技計劃項目（2015B070701017）；省院創新平臺建設專項（2016GDASPT-0105）

令狐榮云（1992年生），女，碩士研究生，研究方向為土壤與植物營養。E-mail: lhry92@163.com*通信作者：余煒敏（1974年生），男，助理研究員，研究方向為土壤與環境。

2017-07-26