腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAKshRNA靶向治療肝癌的實驗研究

鐘寶元+劉清泉+鄧龍穎

【摘要】 目的：探討腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌的療效。方法：根據(jù)GenBank中Surivivin基因序列設計引物，在上下游引物5端引入相應酶切位點，以HepG2基因組DNA為模板擴增Surivivin啟動子基因片段。體外合成最小polyA轉錄中止信號，以pSUPER.retro.puro載體為媒介構建新的干涉載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP），完成干涉靶點的選取并完成干涉載體的構建和鑒定；建立細胞培養(yǎng)和轉染及穩(wěn)定轉染細胞系，完成FAK RNAi的干擾效應性檢測，進行體外細胞增殖及凋亡實驗。結果：重組質(zhì)粒完成DNA提取后，PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得1條預期大小的特異性皮帶，質(zhì)粒Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA涉及符合要求。將目的片段與腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA慢性載體表達載體連接的陽性克隆序列，獲得DNA序列證實含有目的序列片段，提示質(zhì)粒構建成功；PCR儀結果顯示：Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA在肝癌細胞中表達水平較低，抑制率能達到73.33%；Western blotting法結果顯示：轉染后，與未轉染的HepG2細胞相比，轉染后肝癌細胞Surivivin含量明顯下降；流式細胞儀結果表明：細胞轉染后，腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA細胞凋亡率為24.39%，與未轉染細胞的4.12%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌可明顯抑制腫瘤細胞的增殖，控制腫瘤的侵襲與轉移。

【關鍵詞】 腫瘤特異性； Surivivin啟動； FAK shRNA； 靶向治療

【Abstract】 Objective：To investigate the therapeutic effects of tumor specific Surivivin promoter targeting FAK and shRNA on hepatocellular carcinoma.Method：Primers were designed according to the Surivivin gene sequence in GenBank，and the corresponding restriction sites were introduced at the 5th and the end of primer DNA.The promoter fragment of Surivivin was amplified by HepG2 genomic DNA template.In vitro synthesis of polyA transcription termination signal to the minimum，pSUPER.retro.puro vector mediated interference vector pS-surP-shRNA-mpA （pS/surP），a new interference target selection and complete the construction and identification of interference vector.Establish the cell culture and transfection and stable transfection cell lines，to complete the interference effect of detecting FAK RNAi，cell proliferation and apoptosis experiments in vitro.Result：After DNA extraction，the recombinant plasmid was amplified by PCR，and 1 expected size specific bands were obtained by agarose gel electrophoresis.FAK shRNA regulated by plasmid Surivivin promoter met the requirement.FAK shRNA chronic carrier of the fragment and tumor specific Surivivin promoter and expression of positive clone sequence vector，DNA sequence was confirmed with the objective fragment，suggesting that plasmid was successfully constructed.PCR instrument showed that Surivivin promoter FAK shRNA in HCC cells expression level is low，the inhibition rate can reach 73.33%.Western blotting method showed：after transfection，compared with untransfected HepG2 cells，transfected Surivivin cells was significantly decreased.Flow cytometry results showed that FAK cells after transfection，shRNA cell apoptosis of tumor specific Surivivin promoter was 24.39%，and there was significant difference compared with 4.12% of non transfected cells（P<0.05）.Conclusion：Tumor specific Surivivin promoter targeting FAK shRNA targeting HCC can significantly inhibit the proliferation of tumor cells and control tumor invasion and metastasis.endprint

【Key words】 Tumor specificity； Surivivin promoter； FAK shRNA； Targeted therapy

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.007

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，而我國是原發(fā)性肝癌發(fā)病率較高的國家[1]。有報道顯示，我國每年惡性腫瘤發(fā)病率為35萬，每年死亡人數(shù)約32萬，嚴重影響我國居民健康與生活[2]。目前，臨床上對于原發(fā)性肝癌以手術、放化療及介入等治療為主，這些方法雖然能改善患者癥狀，但是長期療效欠佳，不能從根本上改善患者的預后[3-4]。隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，分子生物技術為生物方法治療肝癌提供了新的方法[5]。為了探討腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌。本課題從外源性基因為起點，完成細胞的分離鑒定，并進行體外、體內(nèi)試驗，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 本課題中主要儀器和試劑主要為RT-PCR試劑盒、倒置相差顯微鏡、流式細胞分選儀、熒光定量PCR儀及BCA-100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒等，相關試劑和儀器廠家如下，見表1。

1.2 方法 （1）根據(jù)GenBank中Surivivin基因序列設計引物，并分別在上下游引物5端引入相應酶切位點，以HepG2基因組DNA為模板擴增Surivivin啟動子基因片段。體外合成最小polyA轉錄中止信號，將pSUPER.retro.puro作為媒介完成心載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）的構建[6]。（2）干涉靶點的選取：在相關基因庫中確定FAK基因序列，并根據(jù)相關要求完成兩對siRNA寡聚脫氧核苷酸序列的設計，以一組經(jīng)處理后無同源性的siRNA作為對照。（3）干涉載體的構建和鑒定：將以人FAK基因為靶序列設計的siRNA寡核苷酸鏈的退火后，與構建好的Surivivin啟動子調(diào)控的真核表達載體pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）連接，構建重組的短發(fā)卡狀shRNA真核表達載體，通過篩選、測序?qū)Σ迦雙S/surP中的干涉序列進行鑒定，并分別命名為：pS/surP-FAK/shRNA1、pS/surP-FAK/shRNA2、

pS/surP-NS（Non-Specific siRNA）[7-8]。（4）細胞培養(yǎng)和轉染及穩(wěn)定轉染細胞系的建立：將人肝癌細胞系HepG2放置在培養(yǎng)箱中進行4～5 d培養(yǎng)，設置培養(yǎng)箱條件：37 ℃、5%CO2，隔日換液。在轉染前去適當對數(shù)生長的細胞接種在24孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁90.0%以上后開始轉染。轉染完畢后再次利用600 μg/mL的G418抗生素進行篩選，約2周后待大部分細胞死亡，并有陽性克隆長出時，導致顯微鏡下觀察單個細胞克隆情況；持續(xù)利用100μg/mL的G418抗生素完成1個月篩選，凍存[9]。（5）FAK RNAi的干擾效應檢測：穩(wěn)定轉染細胞系分別命名如下：HepG2-s1、HepG2-s2、HepG2-NS。用RT-PCR法檢測各組細胞及未轉染的HepG2細胞中FAK mRNA的表達水平。Western blotting法檢測各組細胞及未轉染的HepG2細胞中FAK蛋白的表達水平。（6）體外細胞增殖及凋亡實驗：通過水溶性四唑鹽（WST-1）比色法來檢測細胞活力，流式細胞儀技術（FCM）檢測細胞周期的變化，流式細胞儀技術（FCM）檢測細胞凋亡率的變化，TdT-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）染色法檢測細胞凋亡，對穩(wěn)定轉染或者未轉染的HepG2細胞進行Caspase-3活性分析比較[10-11]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR擴增鑒定及序列測定 （1）PCR擴增鑒定。重組質(zhì)粒完成DNA提取后，PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得1條預期大小的特異性皮帶，質(zhì)粒Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA涉及符合要求，見圖1。（2）序列的鑒定。將目的片段與腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA慢性載體表達載體連接的陽性克隆序列，獲得DNA序列證實含有目的序列片段，提示質(zhì)粒構建成功，見圖2。

2.2 體外細胞增殖及凋亡實驗 （1）RT-PCR檢測轉染中Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA表達。PCR儀結果顯示：Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA在肝癌細胞中表達水平較低，抑制率能達到73.33%，見圖2。（2）Western blotting法檢測轉染及未轉染的HepG2細胞中FAK基因調(diào)控蛋白。轉染后，未轉染的HepG2細胞相比，轉染后肝癌細胞Surivivin含量明顯下降，見圖3。

2.3 流式細胞儀技術（FCM）檢測細胞凋亡率 流式細胞儀結果表明：細胞轉染后，腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA細胞凋亡率為24.39%，與未轉染細胞的4.12%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。

3 討論

肝癌是臨床上常見的疾病，在不同年齡段均可發(fā)病，且多發(fā)生在中老年人群中，患者由于年齡較大，機體免疫相對較低，再加上長期伴有乙型肝炎、飲酒史等，加劇疾病的發(fā)展。肝癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者一旦確診，已經(jīng)是中、晚期，延誤了最佳治療時機。因此，臨床上如何采取有效的措施提高肝癌患者治療效果對改善預后具有重要的意義[12-13]。endprint

隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，人們對于原發(fā)性肝癌的研究已經(jīng)深入到基因水平，再加上“基因沉默”技術的發(fā)展及利用，為肝癌的分析靶向治療提供了新的方法[14-15]。本課題中以siRNA為基礎完成相關基因片段的感染，能有效地抑制靶基因基因表達水平及活性，能在一定程度上對腫瘤細胞的增殖、生長發(fā)揮干擾。目前，臨床上對于肝癌的治療中RNAi 主要由RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）啟動子調(diào)控等構成，這些放大雖然能延緩病情發(fā)展，但是對于腫瘤細胞的抑制缺乏特異性。Surivivin屬于是一種細胞凋亡抑制因子，在正常人體中Surivivin表達水平相對較多，且多存在于胚胎細胞[16-17]。對于肝癌患者發(fā)病后機體免疫將迅速發(fā)揮作用，導致Surivivin水平得到迅速上升，并且在腫瘤細胞中均可表達，能夠選擇性地在癌組織中激活其后的外源基因的轉錄，減少對正常細胞的損傷。國內(nèi)學者擴增了Surivivin基因翻譯起始位點上游約0.4 kb的片段，證實Surivivin在肝癌細胞中具有轉錄活性[18]。同時發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系中，Surivivin啟動子活性相當高，是AFP啟動子活性的數(shù)十倍。由此可以看出：在肝癌的靶向性基因治療中，Surivivin啟動子能夠有效的啟動目的基因的表達，它比AFP啟動子具有更強的轉錄活性。本研究擬利用腫瘤特異性Surivivin啟動子在腫瘤細胞內(nèi)高轉錄調(diào)控活性而在正常細胞內(nèi)轉錄調(diào)控活性幾乎為零的特性，構建腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK RNAi真核表達質(zhì)粒，實現(xiàn)Surivivin啟動子調(diào)控的RNA干涉系統(tǒng)特異性的封閉腫瘤內(nèi)源性FAK基因表達[19]。將腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌中能積極有效的控制腫瘤的侵襲和轉移，能為臨床原發(fā)性肝癌的治療提供新的思路和方法，延長患者壽命，促進患者早期恢復[20]。

綜上所述，腫瘤特異性Surivivin啟動子調(diào)控的FAK shRNA靶向治療肝癌可明顯抑制腫瘤細胞的增殖，控制腫瘤的侵襲與轉移，能為肝癌的治療提供新的思路和方法。

參考文獻

[1]田偉，鄭克彬，何心，等.shRNA干擾Surivivin基因后膠質(zhì)瘤細胞中Survinvin及mcm2的表達及意義[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2015，23（1）：24-29.

[2] Zhang J，Zhu Z，Sun Z，et al.Surivivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels[J].Mol Med Rep，2014，9（2）：600-606.

[3]陶燕，付生軍，洪梅，等.靶向Surivivin基因的shRNA慢病毒載體的構建及其對膀胱癌EJ細胞凋亡的影響[J].暨南大學學報自然科學與醫(yī)學版，2015，36（3）：239-245.

[4]易梅，李吉，栗娟，等.RASSF1A對黑色素瘤A375細胞基因網(wǎng)絡的影響[J].生物化學與生物物理進展，2014，41（4）：352-362.

[5]吳發(fā)宗，紀建松，應希慧，等.射頻消融聯(lián)合放射性125I粒子植入治療多結節(jié)型原發(fā)性肝癌療效分析[J].中華醫(yī)學雜志，2016，96（9）：693-696.

[6]張遠標，洪德飛，黃東勝，等.經(jīng)皮微波或射頻消融肝實質(zhì)分隔聯(lián)合門靜脈栓塞計劃性肝切除術治療肝硬化肝癌[J].中華消化外科雜志，2016，15（5）：510-514.

[7]唐榮，胡仁健，魏來.手術切除聯(lián)合射頻消融治療肝癌的臨床研究[J].重慶醫(yī)學，2015，44（20）：2844-2847.

[8] Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Downregulation of Surivivin by shRNA inhibits Invasion and enhances the radiosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma[J].Cell Biochem Biophys，2015，72（1）：251-257.

[9]谷毅博，劉萍，杜海燕，等. Surivivin與卵巢癌相關性的研究現(xiàn)狀[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2015，12（28）：149-152.

[10]朱俊，袁玉林，彭濤，等.Cdc2/cdk1和Surivivin特異性siRNA真核表達載體的設計、構建和鑒定[J].海南醫(yī)學院學報，2015，21（3）：291-295.

[11]王健.Surivivin基因多態(tài)性與結直腸癌發(fā)病風險的相關性分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2016，13（14）：7-10.

[12] Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Downregulation of Surivivin by shRNA Inhibits Invasion and Enhances the Radiosensitivity of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma[J].Cell Biochemistry and Biophysics，2015，72（1）：251.

[13]樂雄，楊德同，張洪海.胃癌干細胞對氟尿嘧啶敏感性及化療藥物耐受細胞的生物學機制[J].中國組織工程研究，2015，19（19）：3022-3026.

[14]楊斌，鄧立歡，李秉航.角質(zhì)細胞生長因子及氯化鋰誘導毛囊干細胞定向分化中的信號通路[J].中國組織工程研究，2014，18（19）：3060-3068.

[15]張瑞，劉明.球形多孔微載體支持下高密度培養(yǎng)人肝細胞L-02的定時形態(tài)變化（英文）[J].中國組織工程研究，2015，19（12）：1924-1930.

[16]康從利，徐日，徐風亮，等.血清腫瘤標志物的聯(lián)合動態(tài)檢測在原發(fā)性肝癌診斷中的價值[J].腫瘤研究與臨床，2014，26（8）：531-534.

[17]韓素桂，黃彩云，李世龍，等.甲胎蛋白異質(zhì)體聯(lián)合甲胎蛋白、高爾基體蛋白73在原發(fā)性肝癌中的診斷價值研究[J].標記免疫分析與臨床，2016，23（2）：156-157.

[18]施明明，黃楨翔，楊月，等.高爾基體糖蛋白73聯(lián)合甲胎蛋白L3診斷原發(fā)性肝癌的薈萃分析[J].中華肝臟病雜志，2015，23（3）：189-193.

[19]萬豪光，徐浩，顧玉明，等.GP73和AFP單項與聯(lián)合診斷對原發(fā)性肝癌診斷應用的Meta分析[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2014，22（5）：357-361.

[20] Chen Q W，Li H J，Chen Y N，et al.Hepatic Lesions Detected after Mastectomy，in Breast Cancer Patients with Hepatitis Background May Need to Undergo Liver Biopsy to Rule Out Second Primary Hepatocellular Carcinoma[J].PLoS One，2016，11（1）：397-399.

（收稿日期：2017-06-12） （本文編輯：程旭然）endprint