hTERC基因在預測宮頸上皮內瘤變Ⅰ級進展和轉歸中的價值

葛運貞

【摘要】 目的：探討hTERC基因在預測宮頸上皮內瘤變Ⅰ級進展和轉歸中的價值，為臨床預測宮頸上皮內瘤變Ⅰ級進展和轉歸提供理論依據。方法：選取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ）進行分析，隨訪后根據病理學確診情況分為進展組、持續組和轉歸組，采用Fish技術檢測不同組的hTERC基因擴增情況。結果：206例宮頸石蠟包埋病理標本，所有患者均成功雜交，其中56例進行了二次雜交，雜交成功率100%。206例CINⅠ組患者隨訪后發現，hTERC基因擴增陽性114例，其中進展組67例、持續組30例、轉歸組17例。在進展組中hTERC基因擴增陽性67例，占100%，持續組中基因擴增陽性30例，占49.18%，轉歸組中基因擴增陽性17例，占21.79%；經Fisher確切概率法，三組轉歸陽性率相比，差異有統計學意義（P<0.05）。經Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴增異常信號比的細胞比例比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：hTERC基因或可成為預測CINⅠ病程進展程度的一種生物學指標，可為臨床醫師診斷和治療提供依據，從而更大程度地做到對患者的早診、早治，避免對患者造成更大的傷害。

【關鍵詞】 宮頸癌； 宮頸上皮內瘤變； 人類染色體端粒酶RNA基因； 熒光原位雜交技術； 石蠟包埋切片

【Abstract】 Objective：To explore the value of hTERC gene in predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ，and to provide theoretical basis for predicting the progression and outcome of cervical intraepithelial neoplasia grade Ⅰ.Method：A total of 206 cases of cervical intraepithelial neoplasia （CINⅠ ） were selected in our hospital from December 2011 to December 2016.The patients were divided into progress group，continuous group and control group，according to the pathologic diagnosis，Fish technique was used to detect the hTERC gene amplification in different groups.Result：206 cases of cervical paraffin embedded pathological specimens，all patients were successfully hybridized，of which 56 cases were secondary hybridization，hybridization success rate of 100%.206 patients with CINⅠ were followed up and found that 114 cases of hTERC gene amplification were positive，including 67 cases in the progress group，30 cases in the continuous group and 17 cases in the control group.In the progress group，the positive rate of hTERC gene amplification was 67 cases（100%），the continuous group was positive in 30 cases（49.18%），and the control group was 17 cases （21.79%），by Fisher exact test method，the difference between the three groups was statistically significant（P<0.05）.The Fisher exact test，the proportion of cells in the abnormal signal amplification of hTERC gene than the three groups compared，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion：The hTERC gene may be a biological indicator for predicting the progression of CINⅠ，which can provide a basis for the diagnosis and treatment of clinicians，so as to achieve a greater degree of early diagnosis and early treatment of patients，to avoid causing greater harm to patients.

【Key words】 Cervical cancer； Cervical intraepithelial neoplasia； Human chromosome telomerase RNA gene； Fluorescence in situ hybridization； Paraffin-embedded sectionsendprint

First-authors address：The Peoples Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone，Linyi 276023，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.008

隨著環境和社會壓力的增加，目前女性宮頸癌的發病率占據女性惡性腫瘤的第2位，據現有的流行病學調查顯示，在我國每年大約有53萬新發病例，死亡人數約30萬，嚴重威脅婦女的健康，降低了患者的生活質量[1]。文獻[2-3]研究發現，宮頸癌進展一般需要10～20年的時間，病變從HPV感染最終發展成宮頸癌，由此可認為宮頸癌是一種可預防的惡性腫瘤。目前對于宮頸癌的檢查大部分采用三階段進行篩查，主要包括宮頸細胞學檢查、人類乳頭狀病毒DNA的檢測以及陰道鏡的檢測。但各種檢測方法有著自己的局限性，存在敏感率低，或特異性不高的現象。因此需要探索一種新的臨床指標來預測宮頸癌的發生及發展并協助上述檢查方法[4]。

隨著分子生物學的發展，目前研究發現，hTERC基因可阻止細胞的凋亡，導致腫瘤的發生，是宮頸癌的發病機制之一[5]。本研究探討hTERC基因在預測宮頸上皮內瘤變Ⅰ級進展和轉歸中的價值，為臨床預測宮頸上皮內瘤變Ⅰ級進展和轉歸提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2011年12月-2016年12月收治的206例宮頸上皮內瘤變Ⅰ級（CINⅠ）進行分析，年齡38～58歲，平均（43.2±5.1）歲，所有患者均無急性陰道炎、宮頸炎以及就診前24 h內無性生活，無長期性激素暴露史，非月經期、妊娠期和哺乳期；獲取標本前接受過物理或化學治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 標本的制作 所有患者均進行宮頸組織的取材，且進行石蠟包埋，然后進行厚度為2 μm的連續切片6張，并將玻片經70 ℃的過夜烘烤。

1.2.2 熒光原位雜交技術（FISH）檢測 將事先制作好的標本置于二甲苯中進行脫蠟處理，15 min/次，共2次；隨后放入100%乙醇中，10 min；然后將玻片在室溫下依次經100%乙醇3 min、85%乙醇

3 min、75%的乙醇3 min；將其放入滅菌純化水中室溫洗滌3 min，取出玻片，再將其放入滅菌純化水中100 ℃煮片20 min進行復水；復水后將玻片置于2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中漂洗玻片

5 min，室溫晾干，進行松解和消化；將玻片放置37 ℃的雜交儀器中，滴加適量的蛋白酶K工作液，消化10 min，室溫下于2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中漂洗玻片2次，5 min/次；將玻片依次置于70%、85%和100%乙醇中各脫水3 min，自然干燥玻片[6]。Fish檢測步驟包括（1）離心：從-20 ℃冰箱中取出雜交液，混勻后進行離心[6-7]；（2）雜交：加入10 μL的雜交液，蓋上22 mm×22 mm的蓋玻片，用封片膠沿蓋玻片邊緣封片，用將玻片放在83 ℃的雜交儀上，變性5 min，42 ℃復性16 h；（3）洗滌：將玻片取出，用鑷子輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片，玻片放入47 ℃的2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中洗滌5 min，然后放入47 ℃的0.1% NP-40和2×氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液中洗滌

5 min，將玻片室溫下浸泡在70%乙醇中脫水3 min，自然干燥玻片；（4）觀察：滴加10 μL DAPI復染劑到載玻片的組織中，蓋上蓋玻片，輕壓，避免產生氣泡，在暗處存放，在熒光顯微鏡下選擇適合的濾光片進行觀察。

1.2.3 FISH結果的判斷 用FISH分析軟件進行圖像分析。每例樣本隨機計數100個細胞，計算顯示異常信號細胞數所占計數細胞的百分比。雜交結果標記顏色綠∶紅[8]，正常信號細胞為綠色及紅色信號各2個，即2∶2；擴增異常信號細胞為綠色信號≥2個，紅色信號>2個，即2∶3、2∶4、3∶3、4∶4以及高拷貝型（N：≥5，即綠色信號≥2個，紅色信號≥5個）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析。三組間的陽性率比較采用Fisher確切概率法，其檢驗水準設為α=0.05；兩兩比較采用Fisher確切概率法，檢驗水準設為α=0.05/3=0.017。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hTERC基因擴增陽性情況與CINⅠ進展及轉歸的關系 本研究中206例宮頸石蠟包埋病理標本，所有患者均成功雜交，其中56例進行了二次雜交，雜交成功率100%。206例CINⅠ組患者隨訪后發現，hTERC基因擴增陽性114例，其中進展組67例、持續組30例、轉歸組17例，見表1。

2.2 hTERC基因擴增陽性情況與CINⅠ進展及轉歸的關系 在進展組中hTERC基因擴增陽性67例，占100%（67/67），持續組中基因擴增陽性30例，占49.18%（30/61），轉歸組中基因擴增陽性17例，占21.79%（17/78）；經Fisher確切概率法，三組轉歸陽性率相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 hTERC基因擴增異常信號細胞及異常信號比類型與CINⅠ進展及轉歸的關系 206例宮頸石蠟包埋病理標本，每例計數100個細胞，進展組67例中hTERC基因擴增異常信號細胞數3371個，擴增異常信號細胞比例為50.31%；持續組30例，hTERC基因擴增異常信號細胞數678個，擴增異常信號細胞比例為22.60%；轉歸組17例，hTERC基因擴增異常信號細胞數112個，擴增異常信號細胞比例為6.59%；經Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴增異常信號比的細胞比例比較，差異有統計學意義（P<0.05）。endprint

3 討論

盡管醫學診療技術的不斷進步，但是宮頸癌仍然是嚴重威脅婦女健康的惡性疾病之一，其發病率較高，居惡性腫瘤發病率的第2位，僅次于乳腺癌，且全球發病率呈現逐年增加的趨勢，在發展中國家尤為突出。且目前宮頸癌發病有明顯年輕化趨勢，嚴重威脅著女性的健康和生命[1-9]。在發達國家，由于開展對宮頸癌的篩查，對宮頸癌實施早期的診斷和治療，目前死亡率已下降50%，而在發展中國家，大多數宮頸癌發現時已經是晚期。這說明早期診斷和治療至關重要[2]。

現代細胞遺傳學和分子生物學研究表明，人體大多實體腫瘤細胞一般表現為染色體的不穩定性，其不僅數目異常，而且在某種程度上其染色體結構也有著一定的異常表現。在對宮頸癌的研究中顯示，常見于染色體3q的增加和2、3、4、6P與11q的缺失[10-11]。文獻[12-14]研究表明，宮頸細胞由非典型性發育異常向宮頸癌轉變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增。其中，人類染色體端粒酶基因（hTERC）作為端粒酶RNA成分的編碼基因，其異常擴增可能為導致宮頸癌的因素之一。該基因的擴增可阻止細胞凋亡，因而可導致腫瘤產生[15-17]。

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術是目前檢測這一基因擴增的標準方法[18]。目前，FISH檢測方法已廣泛地用于產前、產后遺傳病診斷及血液腫瘤、實體瘤等方面的檢測。其檢測樣本較為廣泛，主要包括羊水、絨毛、流產組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等[18-19]。

本研究通過FISH技術對宮頸脫落細胞TERC基因檢測，結果發現，206例CINⅠ組患者隨訪后發現，hTERC基因擴增陽性114例，其中進展組67例、持續組30例、轉歸組17例。且研究還發現，在進展組中hTERC基因擴增陽性67例，占100%（67/67），持續組中基因擴增陽性30例，占49.18%（30/61），轉歸組中基因擴增陽性17例，占21.79%（17/78）；經Fisher確切概率法，三組轉歸陽性率相比，差異有統計學意義（P<0.05）。

FISH技術操作相對簡單，重復性好、穩定，并具有較好的靈敏性及特異性，并且不需要細胞培養，可以用于間期細胞[20-21]。本研究對宮頸上皮內瘤變患者不同進展的階段進行FISH分析檢測，結果發現，206例宮頸石蠟包埋病理標本，每例計數100個

細胞，進展組67例中hTERC基因擴增異常信號細胞數3371個，擴增異常信號細胞比例為50.31%；持續組30例，hTERC基因擴增異常信號細胞數678個，擴增異常信號細胞比例為22.60%；轉歸組17例，hTERC基因擴增異常信號細胞數112個，擴增異常信號細胞比例為6.58%；經Fisher確切概率法，三組hTERC基因擴增異常信號比的細胞比例比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

綜上所述，hTERC基因或可成為預測CINⅠ病程進展程度的一種生物學指標，可為臨床醫師診斷和治療提供依據，從而更大程度的做到對患者的早診、早治，避免對患者造成更大的傷害。

參考文獻

[1]韓歷麗，齊慶青，王朝，等.北京市宮頸癌篩查宮頭細胞學結果分析[J].中國婦幼保健，2011，26（13）：1938-1940.

[2]張向蓮，鄭海燕.宮頸涂片與液基細胞學篩查宮頸癌的嘗萃分析機[J].新疆醫學，2013，12（1）：32-35.

[3]陳媛，徐友梯.DNA定量分析和宮頸液基細胞學檢查在宮頸病變中的診斷價值[J].實用婦產科雜志，2010，12（11）：845-848.

[4]李楊，尚玉敏，楊陽.HPVDNA檢測（HC2）用于宮頸癌篩查價值的Meta分析[J].現代婦產科進展，2013，13（7）：561-564.

[5] Priebe A M.2012 cervical cancer screening guidelines and the future role of HPV testing[J].Clin Obstet Gynecol，2013，56（l）：44-50.

[6]杜輝，張艷萍，張薇，等.APTIMA HPV E6/E7 mRNA和MAUW-TOF-MS HPV基因分型檢測宮頸高度病變效果評價[J].現代婦產科進展，2014，14（12）：937-941.

[7] Arbyn M，Rodens J，Cuschieri K，et al.The APTIMA HPV assay versus title Hybrid Gapture 2 test in triage of women with ASOUS or LSIL cervical cytology：a meta-analysis of the diagnostic accuracy[J].Int J Cancer，2013，132（1）：101-108.

[8]呂威，曹志星.hTERC基因檢測對宮頸癌的診斷價值及FISH技術檢測優勢[J].醫學綜述，2015，11（19）：3506-3508.

[9]徐慶華，朱寶生.端粒、端粒酶及hTERT/hTERC基因的研究進展[J].分子診斷與治療雜志，2012，13（4）：267-273.

[10]莫偉英，黃莉，莫耀僖，等.焚光原位雜交技術檢測人類宮頸端粒酶RNA組分基因的表達及其臨床意義[J].重慶醫學，2013，23（1）：13-15.

[11]任飛飛，趙淑萍，馬德化.FISH檢測宮頸脫落細胞與宮頸組織中hTERC基因制片方法的研究（英文）[J].現代生物醫學進展，2009，23（21）：4126-4129.

[12]伍軍平，羅新，王曉玉，等.宮頸組織hTERC基因檢測在宮頸癌篩查中的意義[J].中國計劃生育和婦產科，2015，23（4）：36-39.

[13] Jin Y，Li J P，He D，et al.Clinical significance of human telomerase RNA gene （hTERC） amplification in cervical squamous cell lesions detected by fluorescence in situ hybridization[J].Asian Pac J Cancer Prev，2011，12（5）：1167-1171.

[14]米賢軍，吳秋良，鐘守軍，等.FISH檢測宮頸細胞hTERC基因在宮頸癌篩查中的價值[J].中華全科醫學，2013，22（4）：504-505.

[15]徐靜，李磊，張麗，等.不同CIN分級宮頸病變組織中hTERC基因表達及意義[J].山東醫藥，2014，33（14）：43-45.

[16]錢敏，尤志學，姚芳芳，等.陰道鏡下宮頭活檢診斷CIN1中漏診CIN2及以上病變的分析[J].中國婦產科臨床雜志，2013，13（5）：403-405.

[17]石琳，帥翰林.宮頸上皮內瘤變石蠟標本hTERC基因檢測與高危型人乳頭瘤病毒分型測定的臨床意義[J].湖北民族學院學報（醫學版），2014，11（4）：9-12.

[18]朱園園，馮定慶，沈國棟，等.FISH檢測兩種基因在宮頸癌篩查中的價值[J].檢驗醫學與臨床，2014，12（15）：2065-2067.

[19]楊萍，董瑞卿，楊安強，等.熒光原位雜交法檢測人端粒酶RNA基因在子宮頸病變篩查中的意義[J].中國婦幼保健，2014，29（18）：2939-2942.

[20]常柏峰，曹箭.宮頸TBS細胞學診斷非典型細胞的臨床意義[J].診斷病理學雜志，2015，12（4）：250-252.

[21]李茜，卞美滯，陳慶云，等.宮頸脫落細胞中人端粒酶RNA組分基因表達在宮頸病變中的臨床價值[J].中日友好醫院學報，2011，11（3）：152-155.

（收稿日期：2017-04-25） （本文編輯：張爽）endprint