鈣網織蛋白在類風濕關節炎早期診斷及活動度評估中的作用*

丁紅梅 ，劉建華 ，鄭芳 ，賈曙光 ，魏蔚 ，孫曉東 ，趙雁艷 ，孟海妹

（1.河北省唐山市第二醫院，河北 唐山 063000；2.天津醫科大學 醫學檢驗學院，天津 300203；3.天津醫科大學總醫院 風濕免疫科，天津 300050）

鈣網織蛋白在類風濕關節炎早期診斷及活動度評估中的作用*

丁紅梅1，劉建華1，鄭芳2，賈曙光1，魏蔚3，孫曉東1，趙雁艷1，孟海妹2

（1.河北省唐山市第二醫院，河北 唐山 063000；2.天津醫科大學 醫學檢驗學院，天津 300203；3.天津醫科大學總醫院 風濕免疫科，天津 300050）

目的 探討鈣網織蛋白（CRT）在類風濕關節炎（RA）早期診斷和疾病活動度評估中的作用及臨床意義。方法 收集45例早期活動性RA患者、35例骨性關節炎（OA）患者，以及30例正常對照者（HC）的血清標本。采用酶聯免疫吸附法檢測3組患者血清CRT水平，魏氏法檢測紅細胞沉降率（ESR），免疫散射比濁法檢測C反應蛋白（CRP）的水平。采用Spearman對血清CRT水平與疾病活動度評分（DAS28）、ESR、CRP進行相關性分析。結果RA組血清CRT水平[（6.7±2.5）μg/L]高于OA組[（3.9±0.9）μg/L]和HC組[（3.8±0.7）μg/L]（P＜0.05），OA組與HC組的血清CRT水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與OA組和HC組比較，RA組ESR、CRP水平升高（P＜0.05）；RA組血清CRT水平與DAS28評分、ESR及CRP呈正相關（rs=0.391、0.459和0.454，P=0.008、0.002和0.002）。結論 早期活動性RA患者血清CRT水平增高，CRT與DAS28評分、ESR及CRP呈正相關，提示CRT可能成為早期診斷RA，以及輔助ESR、CRP評估RA疾病活動度的潛在血清學指標。

類風濕關節炎；鈣網織蛋白；疾病活動度；DAS28評分

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以外周關節慢性、侵襲性關節炎為主要臨床表現的免疫介導的疾病，其致殘率在關節病中居首位。RA的患病率占世界總人口的0.5%～1.0%，我國患病率為0.3%～0.4%，且呈上升趨勢[1-2]。早期診斷和治療、控制疾病活動是改善RA患者預后及降低其致殘率的關鍵。RA的診斷主要依據患者的臨床表現、影像學檢查及血清學檢查等方法。早期RA患者臨床表現多不典型，當出現明顯的臨床癥狀和影像學改變時，患者已經出現骨質破壞。因此，尋找更特異、靈敏的血清學指標，指導RA的早期診斷和治療、預后評估和療效監測是目前RA臨床研究的熱點[3-4]。本研究通過分析鈣網織蛋白（Calreticulin，CRT）在RA患者體內的表達特點及其與28個關節病情活動度評分（disease activity score for 28 joints，DAS28）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）和 C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等活動度指標的相關性，進一步探討CRT在RA早期診斷及病情評估中的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年10月-2015年10月在天津醫科大學總醫院感染免疫科和唐山市第二醫院關節外科住院治療患者，其中早期活動性RA患者45例，骨關節炎（Osteoarthritis，OA）患者35例。早期活動性RA患者的納入標準為病程＜12個月，且未接受緩解病情抗風濕藥物（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）治療[5]。選取同期收集的 30 例性別、年齡匹配的健康體檢者作為健康對照組（healthy control，HC）。RA和OA患者的診斷標準參考1987年美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）修訂的RA診斷標準[6]和1995年ACR修訂的OA診斷標準[7]。本研究通過河北省唐山市第二醫院倫理會的審查，并取得受試者的知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

人CRT檢測試劑盒購自上海鑫樂生物科技有限公司，采用BioTek Synergy 2酶標儀（美國Biotek公司）進行檢測。人全血CRP采用Nephstar Plus蛋白分析儀（深圳市國賽生物技術有限公司）及其配套試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 方法

1.3.1 酶聯免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA） 采集所有受試對象的清晨空腹靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清置入-80℃冰箱冷凍保存備用。血清CRT的含量應用雙抗體夾心法96孔ELISA試劑盒進行檢測，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 魏氏法 應用一次性血沉真空采血管（枸櫞酸鈉抗凝管）采集受試者的空腹靜脈血1.6 ml（靜脈血與抗凝劑的比例為4∶1），緩慢顛倒混勻8～10次。將混勻血吸取到魏氏血沉管至0刻度處。將血沉管垂直放置在血沉架上，室溫下靜止1 h，觀察上層血漿高度（mm），即為血沉結果。正常參考值：男性＜15 mm/h，女性 ＜20 mm/h。

1.3.3 免疫散射比濁法 采集受試者的EDTA抗凝血，吸取2 μl全血標本加入預分裝處理緩沖液的測量杯中，輕搖10 s充分混勻。將量杯放進Nephstar Plus蛋白分析儀的測量孔，儀器自動檢測并顯示結果。正常參考值：CRP＜8 mg/L。

1.3.4 RA疾病活動度檢測 RA疾病活動度測定采用DAS28評分系統，其計算公式為：DAS28評分=0.56×sqrt（疼痛關節數）+0.28×sqrt（腫脹關節數）+0.7Ln（ESR）+0.014×sqrt（總體疼痛VAS評分）。DAS 28評分≤2.6提示病情緩解，2.6～3.2提示低度活動，3.2～5.1提示中度活動，＞5.1提示高度活動。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗；計數資料以率表示，用χ2檢驗；采用Spearman等級相關進行相關性分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

各組在年齡、性別方面比較，差異無統計學意義（P＜0.05）。3組ESR、CRP水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），RA組較OA組、HC組升高。見附表。

2.2 各組血清CRT水平比較

RA組、OA組及HC組的血清CRT濃度分別為（6.7±2.5）、（3.9±0.9）和（3.8±0.7）μg/L，經方差分析，差異有統計學意義（F=36.409，P=0.000）。進一步兩兩比較，經SNK-q檢驗，RA組的血清CRT濃度高于OA組和HC組（P=0.000），而OA組與HC組的血清CRT濃度比較，差異無統計學意義（P=0.816）。

2.3 血清CRT與DAS28評分、ESR及CRP的相關性分析

CRT與DAS28評分呈正相關（rs=0.391，P=0.008）。ESR、CRP與DAS28評分呈正相關（rs=0.506和0.530，均P=0.000），且 CRT與 ESR、CRP呈正相關（rs=0.459和0.454，均P=0.002）。見附圖。

附表 3組患者的臨床資料比較

附圖 RA患者血清CRT水平與DAS28評分、ESR及CRP的相關分析散點圖

3 討論

RA是最常見的炎性關節病，具有較高的致殘率。RA治療的關鍵在于早期明確診斷和治療，控制疾病活動度。因此，正確判斷RA病情的活動性對臨床制定治療方案、監測療效及預后評估具有十分重要的指導意義。目前，臨床上評估RA疾病活動度的工具主要包括ACR反應標準、DAS28評分、簡化的疾病活動性指數及臨床疾病活動指數等。盡管DAS28評分是目前臨床上應用最廣泛的療效監測及病情活動性評估的綜合指標，但該評價方法較為繁雜，限制其在臨床實踐中的應用。血清學指標，如ESR和CRP等炎癥標志物，常用來反映RA疾病活動度。然而，該炎癥指標缺乏特異性，而且一部分可能進展的RA患者中，并未檢測到ESR和CRP升高。因此，臨床需要尋找更加特異的生物標志物，用于開展RA患者的個性化診療及病情活動性評估。近年研究表明，一些生物標志物，如血清淀粉樣蛋白A[8]、白介素17[9]等可用來評估RA的病情活動度。

CRT是一個具有多種生物學功能的蛋白質分子。在內質網中，CRT的主要功能包括維持Ca2+穩態、分子伴侶及調節MHC-Ⅰ類分子運載抗原肽等。此外，CRT還表達在細胞質、細胞膜表面及胞外環境中，參與細胞的黏附和遷移、傷口愈合、細胞凋亡的調節，以及抗腫瘤免疫應答等多種生物學活動[10-12]。近年來，HONG等[13]發現，RA患者血清中可溶性CRT濃度高于系統性紅斑狼瘡患者。TARR等[14]研究顯示，CRT在RA患者血漿和滑膜液中表達升高，并且與疾病活動度相關，CRT可能通過與凋亡蛋白FasL結合，抑制T淋巴細胞的凋亡，進而參與RA的發病。LING等[15]研究發現，CRT可作為RA共享表位的信號轉導受體，介導促炎癥信號的傳導。最新研究表明，CRT在RA患者體內表達升高，其可能通過促進新生血管形成，參與RA滑膜炎和血管翳形成的病理過程[16]。本研究結果顯示，RA患者血清CRT水平高于OA組和HC組。本研究納入的研究對象均為早期活動性RA患者，初步結果表明CRT可能成為RA早期診斷及病情評估的潛在血清學指標。

由于DAS28評分是目前臨床上應用最廣泛的評估RA活動度及藥物治療效果的綜合指標。因此，本研究通過分析CRT水平與DAS28評分的相關性，進而分析CRT能否成為評估RA疾病活動度的新的血清學指標。結果顯示，RA患者血清CRT水平與DAS28評分呈正相關，提示CRT可作為RA活動度評估的潛在指標。ESR和CRP是臨床廣泛應用的評估RA病情活動度的重要血清學指標，因此本研究進一步分析CRT與兩者的相關性。結果表明，ESR、CRP與DAS28評分呈正相關，且CRT與ESR、CRP也呈正相關。以上結果均提示CRT可能成為輔助ESR、CRP評估RA病情活動度的潛在指標。本研究納入的樣本數較少，在后續實驗中，筆者將擴大樣本量進行深入研究。

綜上所述，早期活動性RA患者血清CRT的濃度升高，且與反映RA病情活動度的指標DAS28評分，以及血清學指標ESR和CRP呈正相關，提示CRT可能成為早期診斷RA，以及輔助ESR、CRP評估RA疾病活動度的潛在血清學指標。

[1]SCOTT D L,WOLFE F,HUIZINGA T W.Rheumatoid arthritis[J].Lancet,2010,376(9746):1094-1108.

[2]LI Z G.A new look at rheumatology in China-opportunities and challenges[J].Nat Rev Rheumatol,2015,11(5):313-317.

[3]VERHEUL M K,FEARON U,TROUW L A,et al.Biomarkers for rheumatoid and psoriatic arthritis[J].Clin Immunol,2015,161(1):2-10.

[4]MC ARDLE A,FLATLEY B,PENNINGTON S R,et al.Early biomarkers of joint damage in rheumatoid and psoriatic arthritis[J].Arthritis Res Ther,2015,17:141.

[5]ZHAO J,SU Y,LI R,et al.Classification criteria of early rheumatoid arthritis and validation of its performance in a multicentre cohort[J].Clin Exp Rheumatol,2014,32(5):667-673.

[6]ARNETT F C,EDWORTHY S M,BLOCH D A,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1988,31(3):315-324.

[7]MANDELL B F,LIPANI J.Refractory osteoarthritis.Differential diagnosis and therapy[J].Rheum Dis Clin North Am,1995,21(1):163-178.

[8]SHEN C,SUN X G,LIU N,et al.Increased serum amyloid A and its association with autoantibodies,acute phase reactants and disease activity in patients with rheumatoid arthritis[J].Mol Med Rep,2015,11(2):1528-1534.

[9]METAWI S A,ABBAS D,KAMAL M M,et al.Serum and synovial fluid levels of interleukin-17 in correlation with disease activity in patients with RA[J].Clin Rheumatol,2011,30(9):1201-1207.

[10]GOLD L I,EGGLETON P,SWEETWYNE M T,et al.Calreticulin:non-endoplasmic reticulum functions in physiologyand disease[J].FASEB J,2010,24(3):665-683.

[11]RAGHAVAN M,WIJEYESAKERE S J,PETERS L R,et al.Calreticulin in the immune system:ins and outs[J].Trends Immunol,2013,34(1):13-21.

[12]WIJEYESAKERE S J,BEDI S K,HUYNH D,et al.The cterminal acidic region of calreticulin mediates phosphatidylserine binding and apoptotic cell phagocytosis[J].J Immunol,2016,196:3896-3909.

[13]HONG C,QIU X,LI Y,et al.Functional analysis of recombinant calreticulin fragment 39-272:implications for immunobiological activities of calreticulin in health and disease[J].J Immunol,2010,185(8):4561-4569.

[14]TARR J M,WINYARD P G,RYAN B,et al.Extracellular calreticulin is present in the joints of patients with rheumatoid arthritis and inhibits FasL (CD95L)-mediated apoptosis of T cells[J].Arthritis Rheum,2010,62(10):2919-2929.

[15]LING S,CHENG A,PUMPENS P,et al.Identification of the rheumatoid arthritis shared epitope binding site on calreticulin[J].PLoS One,2010,5(7):DOI:10.1371/journal.pone.0011703.

[16]DING H,HONG C,WANG Y,et al.Calreticulin promotes angiogenesis via activating nitric oxide signalling pathwayin rheumatoid arthritis[J].Clin Exp Immunol,2014,178(2):236-244.

Role of calreticulin in early diagnosis and activity assessment of rheumatoid arthritis*

Hong-mei Ding1,Jian-hua Liu1,Fang Zheng2,Shu-guang Jia1,Wei Wei3,Xiao-dong Sun1,Yan-yan Zhao1,Hai-mei Meng2
(1.The Second Hospital of Tangshan,Tangshan,Hebei 063000,China;2.School of Laboratory Medicine,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China;3.Department of Rheumatology and Immunology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300050,China)

Objective To investigate the role of calreticulin (CRT)in the diagnosis and assessment of disease activity in the patients with early rheumatoid arthritis(RA).Methods Serum CRT level was measured by ELISA in 45 patients with early RA,35 cases with osteoarthritis(OA)and 30 healthy controls(HC).ESR was measured by the Westergren method.Serum CRP level was measured by immunonephelometry.The correlations of CRT with Disease Activity Score for 28 joints (DAS28 score),ESR and CRP were assessed by Spearman's rank correlation coefficient.Results The serum concentration of CRT of the early RA patients[(6.7±2.5)μg/L]was higher than that of the OA patients and HC[(3.9±0.9)and(3.8±0.7)μg/L,P＜0.05],while there was no significant difference between the OA and HC groups(P＞0.05).Compared with the OA and HC groups,the ESR and CRP levels were elevated in the early RA group (P＜0.05).Serum CRT concentration in the early RA patients was positively correlated with DAS28 score,ESR and CRP (rs=0.391,0.459 and 0.454;P=0.008,0.002 and 0.002).Conclusions Together with ESR and CRP,CRT may be used as a potential biomarker for early diagnosis of RA and for assessment of disease activity.

rheumatoid arthritis;calreticulin;disease activity;DAS28 score

R446.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.010

1005-8982（2017）26-0052-04

2016-05-10

河北省科技計劃項目（No：152777157）

（童穎丹 編輯）