MicroRNA-182在人肺腺癌中的表達及其臨床意義*

房延鳳，張紅軍，金發光，傅恩清，魯曦

（第四軍醫大學唐都醫院 呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安 710038）

MicroRNA-182在人肺腺癌中的表達及其臨床意義*

房延鳳，張紅軍，金發光，傅恩清，魯曦

（第四軍醫大學唐都醫院 呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安 710038）

目的 探討microRNA-182（miRNA-182）在人肺腺癌組織中的表達，以及與患者臨床特征及預后的相關性。方法 收集術后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織98例，以及其癌旁正常肺組織和良性病變旁正常肺組織98例，實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miRNA-182的相對表達量，分析其與臨床特征及生存預后的關系，用ROC曲線評估miRNA-182對人肺腺癌的診斷能力。結果 miRNA-182在人肺腺癌組織相對表達量為（0.8001±0.2112），在正常肺組織相對表達量為（0.2721±0.1216），人肺腺癌組織中的表達高于正常肺組織（P＜0.05）；miRNA-182的表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移及腫瘤分化相關（P＜0.05）。ROC曲線分析發現，當界值設置為0.52時，miRNA-182在人肺腺癌中的表達特異性為95.918%，敏感性為91.837%，陽性預測值為95.745%。結論 miRNA-182在人肺腺癌組織中表達量高于正常肺組織，有可能成為人肺腺癌診斷、預后評估的重要指標。

microRNA-182；人肺腺癌；診斷；預后

肺癌是全球發病率和死亡率最高的腫瘤，大多數患者被發現時已處于中、晚期[1]。因此，尋找有關肺癌早期預警、診斷標志物是目前研究的熱點之一[2]。近來研究顯示，microRNA-182（miRNA-182）的異常表達與肺癌的發生、發展密切相關[3-4]。本實驗采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測98例術后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織標本中miRNA-182的表達，研究其與各臨床特征的關系，探討miRNA-182在人肺腺癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床標本及資料

選取2010年6月-2011年6月第四軍醫大學唐都醫院術后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織98例，以及其正常肺新鮮組織（癌旁正常肺組織或良性病變旁正常肺組織）98例。其中，年齡33～88歲，平均（60.67±9.76）歲。臨床病理分期采用UICC（2009年）制定的TNM分期標準。所有患者術前未行放、化療，亦無其他惡性病變病史，相關資料完整。正常肺組織選用標準為癌組織邊緣＞5 cm或手術后良性病變周圍正常肺組織。常規處理組織后，在-80℃冰箱中保存。術后隨訪至2016年6月，隨訪98例，失訪11例，隨訪率為88.775%（87/98），隨訪期間，把死于與肺癌無關或失訪的患者作為刪失患者。入組患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及設備

總 RNA提取試劑：miRNeasy FFPE Kit和RNase-Free DNaseⅠ（德國Qiagen公司）。儀器：微量移液器（德國Eppendorf公司），離心機（型號：3K-15，德國SIGMA公司），紫外分光光度計（美國熱電公司）。逆轉錄試劑：Prime ScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司）；PCR 試劑：SYBR Prime ScriptTMmiRNA RT-PCR kit（日本TaKaRa公司）；儀器：PCR基因擴增儀和PCR儀（美國 Bio-Rad公司）。

1.3 引物及內參

PCR引物用Oligo和Beacon 7.8軟件進行熒光定量設計，由上海生工生物工程股份有限公司負責合成。正向引物：5'-GCTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ACT-3'；反向引物：5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCA CACT-3'。選擇β-actin作為內參，正向引物：5'-GT GGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；反向引物：5'-CTCCT TAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.4 RNA提取、逆轉錄及qRT-PCR

RNA提取按照日本TaKaRa公司RNA純化試劑盒說明書進行操作，注意RNA降解。利用紫外分光光度計對RNA定量后于-80℃冰箱冷凍保存待用。隨后利用逆轉錄試劑盒逆轉錄，操作步驟嚴格按照說明書進行。本研究采用SYBR法進行qRT-PCR，反應體系的配置嚴格按說明書操作，反應條件如下：94℃預變性 3 min，94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共40個循環。對miRNA-182行相對定量分析，反應結束后繪制熔解曲線，確認引物特異性后記錄內參基因和目的基因的CT值，同時計算相對表達量。每個標本重復3次。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件行，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析或t檢驗，描述生存過程用Kaplan-Meier法，miRNA-182對人肺腺癌的診斷用ROC曲線，肺腺癌患者影響因素的分析采用COX比例風險模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常肺組織與肺腺癌組織miRNA-182表達的比較

肺腺癌組織相對表達量為（0.8001±0.2112），正常肺組織相對表達量為（0.2721±0.1216），經t檢驗，差異有統計學意義（t=16.380，P=0.000），肺腺癌組織miRNA-182相對表達量高于正常肺組織。見圖1。

圖1 肺腺癌組織與正常組織miRNA-182的相對表達量比較

2.2 miRNA-182表達與患者臨床病理特征的關系

不同性別、年齡患者的miRNA-182表達水平比較，經t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤分化程度比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），低、中分化患者的miRNA-182表達水平高于高分化患者；有遠處轉移及淋巴結轉移患者的miRNA-182表達水平高于無上述轉移患者（P＜0.05）；TNMⅢ、Ⅳ期患者的miRNA-182表達水平高于TNMⅠ、Ⅱ期患者（P＜0.05）。見表1。

表1 患者臨床病理特征與miRNA-182表達的關系

2.3 miRNA-182表達與患者生存分析

2.3.1 5年總體生存分析 用電話方式對98例患者進行隨訪，隨訪時間為2010年6月-2016年6月，期間患者死亡78例，存活9例，失訪11例；總體中位生存時間35.253個月，5年生存率為10.345%（9/87）。見圖 2。

圖2 男女5年生存率比較

2.3.2 多因素生存分析 將人肺腺癌中miRNA-182表達有差異的相關變量：miRNA-182表達、人肺腺癌分化程度、淋巴結及遠處轉移，以及TNM分期納入COX多因素比例風險回歸模型。逐步回歸分析結果表明，miRNA-182表達狀態、TNM分期是影響肺腺癌患者預后的獨立因素（P＜0.05）。見表2。

表2 肺腺癌患者影響因素的多因素COX回歸分析相關參數

2.4 miRNA-182表達對人肺腺癌診斷能力的評價

采用98例人肺腺癌組織和98例正常肺組織miRNA-182的相對表達量建立ROC曲線，曲線下面積確定為0.95，界值0.52（見圖3）。以該界值對肺癌和正常肺組織重新進行判斷，＜0.52判定為肺癌組織，＞0.52判定為正常肺組織。miRNA-182表達對肺癌診斷的特異性為95.918%（94/98），敏感性為91.837%（90/98），陽性預測值為 95.745%（90/94），陰性預測值為92.157%（94/102），陰性似然比為0.085（1-0.91837/0.95918），約登指數為87.755%（91.837%+95.918%-1），陽性似然比為 22.498（0.91837/1-0.95918）。

圖3 miRNA-182在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織表達的ROC曲線

3 討論

miRNA為一類非編碼RNA分子，對轉錄后的基因進行調控[5]。miRNA在細胞生長多個過程中發揮重要調節作用[6]。迄今發現，作為miRNA家族一員的miRNA-182的異常表達與人類很多腫瘤相關，miRNA-182作為一種癌基因或抑癌基因，具有調節腫瘤浸潤、轉移等功能[7]。新近研究發現，miRNA-182在多株肺腺癌細胞包括SPC-A-1和A549細胞中表達高，使PDCD4表達量下調，從而加快肺癌細胞的增殖[8]。

本研究首先發現，miRNA-182在人肺腺癌組織中的表達高于正常肺組織，其中低、中分化癌組織中miRNA-182表達高于高分化組織，TNM Ⅲ、Ⅳ期表達高于TNM I、Ⅱ期，即腺癌組織惡性程度越高、分期越晚，其表達量越高。既往YANG等[9]研究得出，在人肺癌早期miRNA-182表達增加，可促進肺癌細胞的增殖、轉移，與本研究結果一致。其次，本文COX多因素生存分析提示，miRNA-182表達狀態、TNM分期是影響肺腺癌患者預后的獨立因素，由此可見，miRNA-182對肺腺癌患者的預后評估有重要作用。最后，本實驗通過對98例人肺腺癌組織及其正常肺組織的miRNA-182相對表達量建立ROC曲線，明確診斷界值，重新判定肺癌和正常組織，得出其特異性、敏感性及陽性預測值均高于傳統腫瘤標志物。雖然該方法有局限性，但是一定程度上表明，miRNA-182對于人肺腺癌的診斷、分期及預后預測有重要意義，有望成為腺癌組織形態學改變前的分子學改變，其高表達預示腫瘤的高危性或進展性。此外BARSHACK等[10]用qRT-PCR和微陣列分析對110個肺原發腫瘤及肺轉移癌組織標本進行檢測，得出miRNA-182在肺原發癌中明顯升高，而肺轉移癌中miRNA-126過表達，從而表明miRNA-182可能對鑒別肺轉移癌及肺原發腫瘤有一定意義。

LEI等[11]研究發現，miRNA-182在乳腺癌細胞中高表達，且與乳腺癌的預后呈負相關。因此miRNA-182并不是肺癌的特有指標，應聯合其他腫瘤標志物及相關臨床資料，成為早期診斷肺癌的方法之一。最后，鑒于本研究樣本量有限，還需在多中心大樣本量中進一步驗證其應用價值。

[1]CARILLIO G,MONTANINO A,COSTANZO R,et al.Cetuximab in non-small-cell lung cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther,2012,12(2):163-175.

[2]SAWYERS C L.The cancer biomarker problem[J].Nature,2008,452(7187):548-552.

[3]WANG H,WU S,ZHAO L,et al.Clinical use of microRNAs as potential non-invasive biomarkers for detecting non-small cell lung cancer:a meta-analysis[J].Respirology,2015,20(1):56-65.

[4]朱清,許波,劉雨生.microRNA在卵巢和卵巢癌中的表達及功能[J].安徽醫科大學學報,2014,49(5):694-697.

[5]FARAZI T A,SPITZER J I,MOROZOV P,et al.miRNAs in human cancer[J].J Pathol,2011,223(2):102-115.

[6]LUJAMBIO A,LOWE S W.The microcosmos of cancer[J].Nature,2012,482(7385):347-355.

[7]RASHEED S A,TEO C R,BEILLARd E J,et al.MicroRNA-182 and microRNA-200a control G-protein subunit alpha-13(GNA13)expression and cell invasion synergistically in prostate cancer cells[J].J Biol Chem,2013,288(11):7986-7995.

[8]WANG M,WANG Y,ZANG W,et al.Downregulation of microRNA-182 inhibits cell growth and invasion by targeting programmed cell death 4 in human lung adenocarcinoma cells[J].Tumour Biol,2014,35(1):39-46.

[9]YANG WB,CHEN PH,HSU TS,et al.Sp1-mediated microRNA-182 expression regulates lung cancer progression[J].Oncotarget,2014,5(3):740-753.

[10]BARSHACK I,LITHWICK-YANAI G,AFEK A,et al.MicroRNA expression differentiates between primary lung tumors and metastases to the lung[J].Pathol Res Pract,2010,206(8):578-584.

[11]LEI R,TANG J,ZHUANG X,et al.Suppression of MIM by microRNA-182 activatesRhoA and promotesbreastcancer metastasis[J].Oncogene,2014,33(10):1287-1296.

MicroRNA-182 expression and its clinical significance in human lung adenocarcinoma*

Yan-feng Fang,Hong-jun Zhang,Fa-guang Jin,En-qing Fu,Xi Lu
(Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710038,China)

Objective To study the level of microRNA-182(miRNA-182)in human lung adenocarcinomas,and to evaluate its correlations with clinical features and prognosis of the patients with lung adenocarcinomas.Methods The fresh human lung adenocarcinoma tissues and their paired adjacent normal lung tissues of 98 cancer patients,and normal lung tissues of 98 cases with benign lesions were collected.All tissues of surgery or biopsy were confirmed by pathology.miRNA-182 was measured by qRT-PCR.The correlations of miRNA-182 with clinical features and prognosis of human lung adenocarcinomas were analyzed.The ROC curve was used to evaluate the ability of miRNA-182 in diagnosis of human lung adenocarcinomas.Results The level of miRNA-182 in the human lung adenocarcinomas (0.8001±0.2112)was significantly higher than that in the normal lung tissues [(0.2721±0.1216),P＜0.05].The level of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas was correlated with TNM stage,lymphatic metastasis,distant metastasis and tumor differentiation (P＜0.05).After further analysis by ROC curve,the results showed that when the cut-off value was set to 0.52,the specificity,the sensitivity and the positive predictive value of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas were 95.918%,91.837% and 95.745% respectively.Conclusions Level of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas is significantly higher than that in normal lung tissues,it may be an important index for the diagnosis of human lung adenocarcinomas and prognosis evaluation.

miRNA-182;human lung adenocarcinoma;diagnosis;prognosis

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.013

1005-8982（2017）26-0066-04

2016-10-19

國家自然科學基金青年科學基金（No：31300121）[

魯曦，E-mail：luxi1126@163.com

（童穎丹 編輯）