TSNAs降解菌05-5402的篩選及其降解特性研究

雷麗萍，吳玉萍，莫笑晗，周駿，夏振遠

1 云南省煙草農業科學研究院 昆明 630021；

2 上海煙草集團北京卷煙廠 北京 010000

生物技術

TSNAs降解菌05-5402的篩選及其降解特性研究

雷麗萍1，吳玉萍1，莫笑晗1，周駿2，夏振遠1

1 云南省煙草農業科學研究院 昆明 630021；

2 上海煙草集團北京卷煙廠 北京 010000

為分離篩選能夠降解TSNAs的微生物，探討其降解特性，本研究采用替代底物平板稀釋法分離和靶標底物點接法篩選相結合的分離篩選策略，篩選到能夠利用NNK為唯一碳源和氮源而生長的細菌05-5402菌株，鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。白肋煙浸提液經05-5402菌株處理后，TSNAs含量降低了22.2%，其中NNK和NAT的含量分別降低了47.4%和55.7%。晾制的煙葉經05-5402菌株處理后，TSNAs降低17.3%，其中，NAB的含量降低了52.2%。發酵過程中的煙絲經05-5402菌株處理，TSNAs含量下降12.2%。05-5402菌株能實現煙草特有亞硝胺的高效定向降解，具有較大的應用潛力。

煙草；煙草特有亞硝胺；短小芽孢桿菌；降解特性

煙草特有亞硝胺（TSNAs）是煙草特有的N-亞硝基類化合物，是煙葉中重要的有害成分[1]，NNN、NNK、NAB、NAT是煙草和煙氣中主要的TSNAs[2-3]。煙葉是卷煙的主要原料，也是卷煙煙氣中TSNAs的主要來源[4]。影響煙葉中TSNAs含量的因素很多，其中主要有煙草類型[5]、煙草組織[6]、栽培方式[7]、調制方法[8]、微生物降解[9]、氮肥施用量[10]、硝酸還原酶及亞硝化酶的活性等。目前已有的有效方法通過改變上述影響因子從而降低TSNAs的含量，例如選育良種、控制氮肥、適時采收等農業栽培措施，及利用馬來酰肼、維生素C和α-生育酚等化學制劑等。利用微生物也是一個具有應用前景的TSNAs調控措施，日本煙草產業株式會社[11]利用少動鞘氨醇單胞菌和熒光假單胞菌減少煙葉中TSNAs含量；張玉芹等[9]利用反硝化細菌降低煙絲中硝酸鹽、亞硝酸鹽和TSNAs含量；張玉玲等[12]用放線根瘤菌(Rhizobium radiobacter）對煙株進行灌根處理，采收時噴灑煙葉處理，結果為兩種處理的煙葉TSNAs含量明顯降低。據現有的研究，推測某些微生物能夠降低煙草TSNAs含量的機制主要包括兩個方面，一是這些微生物具有還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力，使TSNAs合成的前體物質減少，導致煙草TSNAs含量下降；另一種可能是接種微生物數量大或產生抗生素類物質，抑制引起TSNAs積累的微生物類群，從而降低TSNAs的含量[13]。綜上，目前有關微生物降低煙草TSNAs含量的研究主要集中在微生物對TSNAs合成的環節，而對TSNAs降解的作用未見報道。本研究試圖從微生物降解TSNAs的角度出發，研究降低煙草TSNAs微生物的資源和降解特性，為通過微生物降低煙草TSNAs含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

分離培養基（g/L）：瓊脂15.0、K2HPO41.5、KH2PO40.4、NaCl 0.1、MgSO4.7H2O 0.1、CaCl20.04、MnSO4.H2O 0.002、CuSO4.5H2O 0.001、ZnSO4.7H2O 0.002、NaMoO4.2H2O 0.002、 尼 古 丁1.0。

篩選培養基：上述分離培養基中的尼古丁替換為NNK。

1.1.2 儀器與器材

恒溫恒濕箱（德國 Memmert公司）、高效液相色譜及三重四級桿質譜檢測器（美國Waters公司）、PCR儀（美國Life Technologies公司）、高速大容量冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、恒溫搖床（瑞士 INFORS公司）。

1.1.3 試劑

NNK、NNN、NAT、NAB（ ≥ 98%，Toronto Research Chemicals）、乙腈（色譜純，MERCK）、其他試劑（分析純，國產）、Taq酶及細菌基因組提取試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.1.4 煙絲

由上海煙草集團北京卷煙廠提供。

1.2 方法

1.2.1 05-5402菌株的分離篩選

將煙葉或植煙土壤研磨后加入無菌水，于室溫下振蕩提取30min，將提取懸濁液用稀釋平板的方法25℃培養48 h，挑取能在分離培養基上旺盛生長的菌株；共計分離137個樣品，得到869個菌落。將這些菌株以點接的方式轉接到篩選培養基平板上，25℃培養48 h，有122株細菌能夠生長，一株長勢最旺盛的細菌標記為05-5402，菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.7418。

1.2.2 菌株鑒定

通過常規生物學、生理生化特性檢測和分子生物學方法對菌株05-5402進行鑒定。菌株05-5402的形態特征及生理生化性狀分析按照文獻［14］進行。16S rRNA 基因序列測定分析方法如下：細菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，方法參見試劑盒說明書。PCR擴增選用引物F27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 R1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），常規條件擴增，擴增產物經TaKaRa Agarose Gel DNA Puri fi cation Kit Ver.2.0回收后，連接于載體pMD18-T Vector，轉化入感受態細胞E.coliDH5α，陽性克隆委托上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。測得的16S rDNA全序列經EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net/)同源性搜索[15]，并用Mega 4.0軟件將該序列與常見的芽孢桿菌菌株的16S rDNA全序列構建立系統發育樹。

1.2.3 煙草浸提液中TSNAs的降解

按白肋煙末∶蒸餾水=1∶10的比例混勻，超聲波浸提30min后過濾，濾液調節pH至7.2～7.4，300mL三角瓶分裝100mL滅菌。挑取05-5402一環接種，以不接菌作為對照（CK），各處理重復3次。150 rpm振蕩培養48 h后，浸提液8000 rpm常溫離心10min，經0.22 μm水相濾膜過濾，采用UPLCMS / MS 進行TSNAs含量分析[16]。

1.2.4 調制煙葉TSNAs的降解

采用半葉法進行調制煙葉TSNAs的降解實驗，在調制前，一半葉片噴施4%葉重的05-5402發酵液，另一半噴施無菌水作為對照（CK）。將煙葉置于培養箱內，在30℃、相對濕度80%的條件下調制7 d，使葉片干燥。

TSNAs含量檢測。將煙葉在65℃烘干研磨后過100目篩，稱取煙末1.0 g（精確到0.1mg），置于100mL的錐形瓶中，加入20mL 100mmol/L的乙酸銨水溶液，超聲萃取60min。靜置后取2mL上層清液經0.2 μm水相濾膜過濾，進行UPLC-MS/MS檢測TSNAs含量[16]。

1.2.5 煙絲中TSNAs的降解

05-5402菌株經LB培養基液體培養，離心去培養基后用無菌水重新懸浮，懸浮液含菌量為0.8×1010cfu/mL。煙絲充分混合均勻后分成處理和對照（CK）兩組。處理組噴施煙絲重量4%的05-5402菌懸液，對照組噴施等量的無菌水，處理和對照各設3次重復。將煙絲的水分含量調整到30%（m/m），放置于30℃，相對濕度為80%的恒溫恒濕培養箱內處理5d。處理后煙絲TSNAs含量檢測方法同1.2.4。

1.2.6 統計方法

檢測數據采用PAST V.3.14進行標準偏差計算和t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 05-5402菌株的鑒定

05-5402菌株于28℃在NA平板上培養24 h，菌落呈圓形，直徑2～3 mm，扁平無凸起，乳白色，有光澤，邊緣不整齊，為好氧菌。菌株為革蘭氏陽性，芽孢橢圓形中生或端生，不膨大，芽孢比菌體小，存在于菌體中，菌體平均大小為0.61～0.68 μm×2.2～2.8 μm。該菌株過氧化氫酶實驗、VP實驗、產H2S實驗、明膠液化實驗、卵磷脂酶實驗反應呈陽性；水解淀粉實驗、產NH3實驗、甲基紅實驗、吲哚實驗、水解脂肪實驗、硝酸鹽還原實驗反應呈陰性。

05-5402菌株經核酸提取后，16s rDNA擴增測序得到1513 bp的核酸序列，Genbank注冊號KY427112，經EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net/)同源性搜索，該菌16s rDNA序列與芽孢桿菌同源性最高，相似性為99.52%。在Ribosomal Database數據庫中選取10株屬于Bacillus屬的不同種的芽孢桿菌模式菌株構建系統發育樹，查看屬種間的遺傳進化關系（圖1）。從系統發育樹看，05-5402與B.pumilus、B.australimaris和B.zhangzhouensis處 于同一分支，說明它們的遺傳進化關系最近，結合05-5402菌株的生理生化特性，將其鑒定為短小芽孢桿菌（B.pumilus）。

圖1 菌株05-5402的16S rDNA序列系統發育樹Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of 05-5402

2.2 05-5402菌株對煙草浸提液TSNAs的降解

由表1的實驗結果數據可知，菌株05-5402對白肋煙浸提液中的TSNAs具有降解效果。經48 h處理，浸提液中TSNAs含量較對照降低了22.2%，處理與對照達到了極顯著的差異水平，NNK和NAT的含量分別降低了47.4%和55.7%。

2.3 05-5402菌株對煙葉TSNAs的降解

通過半葉法評價05-5402在煙葉晾制階段對TSNAs的降解作用，由表2數據可知，菌株05-5402能使煙葉中的TSNAs含量明顯下降，總體下降幅度為17.3%，t檢驗結果顯示差異顯著。NAB的含量降低了52.2%，達極顯著水平，其他3種TSNAs也有降低，但t檢驗差異不顯著。

表1 菌株05-5402對煙草浸提液中TSNAs的降解效果Tab.1 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs of burley tobacco extracts ng/g

表2 菌株05-5402對調制期煙葉中TSNAs的降解效果Tab.2 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs of tobacco during air-curing ng/g

2.4 05-5402菌株對發酵煙絲中TSNAs的降解

由表3數據可知，菌株05-5402能使煙絲中的TSNAs含量明顯下降，總體降低了12.2%，對4種TSNAs均有降解效果。其中，NNN、NAT和NAB的含量分別降低了12.9%、11.0%和10.3%。經t檢驗，NNN和TSNAs在05-5402菌株處理和對照之間差異達到了極顯著水平。

表3 菌株05-5402對煙絲中TSNAs的降解效果Tab.3 Effect of strain 05-5042 on the contents of TSNAs in cut tobacco ng/g

3 討論與結論

以往的研究[17-20]，多以細菌的硝酸還原能力來篩選降解菌株，噴施微生物能降低煙葉中的TSNAs含量，這些研究是建立在TSNAs的形成是以亞硝酸鹽以及氮氧化物(NOX)為底物的理論基礎上，通過微生物的作用降低煙葉中的亞硝酸鹽，而降低煙葉中TSNAs的合成數量。已有研究證明，某些微生物可以降解TSNAs[21]，按照微生物降解TSNAs的思路，本研究利用替代底物平板稀釋法分離和靶標底物點接法篩選相結合，篩選到能夠利用NNK為唯一碳源和氮源而生長的細菌。以尼古丁替代TSNAs作為培養基進行微生物分離，以靶標底物點接法進行功能篩選，避免了研究過程中使用大量的靶標TSNAs，利于降低研究成本。本研究從有降解尼古丁功能的869株細菌中篩選到以NNK為唯一碳源和氮源的菌株122株，說明在自然界中存在著大量的能降解NNK的微生物。此結果將豐富應用微生物降低煙草TSNAs含量的資源和途徑。本研究通過對煙葉浸提液、煙葉和煙絲處理后的TSNAs含量檢測，證明05-5402菌株均能降低TSNAs含量，其降解TSNAs的效率表現為溶液中大于煙絲發酵，其原因可能與菌株增殖和降解環境有關。有關05-5402菌株降解TSNAs的降解途徑和機理等問題有待于進一步研究。

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Isolation and screen of TSNAs-degrading bacillus 05-5402 and its degradation characteristics

LEI Liping1,WU Yuping1,MO Xiaohan1,ZHOU Jun2,XIA Zhenyuan1*
1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science,Kunming 630021,China；
2 Beijing Cigarette Factory,Shanghai Tobacco Group,Beijing 010000,China

The aim of current study was to isolate and screen TSNAs-degrading microorganism,and study its degradation characteristics.TSNAs-degrading Bacillus isolate 05-5402 was obtained by isolating bacillus using dilution-plate method with nicotine as alternative substrate,and was screened by selective medium containing NNK as sole carbon and nitrogen sources.Isolate 05-5402 was identi fi ed asBacillus pumilusby physio-biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis.Isolate 05-5402 could degrade 22.2% of total TSNAs in the extracts of burley tobacco,and 47.4% of NNK and 55.7% of NAT.Isolate 05-5402 could reduce 17.3% of total TSNAs in tobacco during air-curing period,and 52.2% of NAB.Total TSNAs content of cut tobacco was reduced by 12.2% after fermentation with isolate 05-5402.Isolate 05-5402 can degrade TSNAs efficiently,which has application potential.

tobacco; TSNAs;Bacillus pumilus; degradation characteristics

雷麗萍，吳玉萍，莫笑晗，等.TSNAs降解菌05-5402的篩選及其降解特性研究[J].中國煙草學報，2017,23（5）

中國煙草總公司卷煙減害技術重大專項（110201101035（JH-10））

雷麗萍（1963—），碩士，副研究員，主要從事低危害煙草研究，Tel：0871-65183692，Email：lplei@yntsti.com

夏振遠（1971—），Tel：0871-65106032，Email：zyxia@yntsti.com

2017-01-09；< class="emphasis_bold">網絡出版日期：

日期：2017-07-18

：LEI Liping,WU Yuping,MO Xiaohan,et al.Isolation and screen of TSNAs-degrading bacillus 05-5402 and its degradation characteristics[J].Acta Tabacaria Sinica,2017,23(5)

*Corresponding author.Email：zyxia@yntsti.com