菌株F75風化煤降解特性研究

閆 敏，李 磊，張 強，馮悅晨，孫 捷，武文麗

(山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西 太原 030031)

菌株F75風化煤降解特性研究

閆 敏，李 磊*，張 強，馮悅晨，孫 捷，武文麗

(山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西 太原 030031)

【目的】 利用微生物能有效提高風化煤類物質的轉化效率。由于地理環境和形成年代及條件的差異，使得風化煤理化性質差異較大，直接影響了微生物的降解作用，所以明確微生物菌株對不同風化煤的降解特性能有效提高其轉化效率。【方法】本研究以3個不同來源的風化煤樣為研究材料，篩選了具有降解作用的微生物菌株F75并進行鑒定。【結果】在固體和液體培養條件下，從風化煤樣的各腐植酸含量及結構的變化上分析菌株對其的降解特性。菌株F75對3個風化煤樣均有降解作用，經鑒定為黑曲霉。液體培養條件下，風化煤YF01和YF09在190～280 nm的吸收曲線較對照呈現先增加后減少的趨勢，而風化煤YF06則呈現較對照一直增加的趨勢，且3個風化煤樣均在小于205 nm時有明顯的加強。紅外光譜分析顯示菌株F75對風化煤YF01的作用集中在碳鏈的縮短上，表現為失重率較高；對風化煤YF06和YF09的作用集中在羧基官能團上，表現為水溶性腐植酸和黃腐酸含量的增加。固體培養條件下，菌株F75對風化煤YF06的游離腐植酸含量提高明顯；菌株F75對3個風化煤樣的水溶性腐植酸含量和黃腐酸含量均有明顯提高，其中對風化煤YF09中水溶性腐植酸含量的增加呈主導作用，而對風化煤YF06中黃腐酸的含量有一定的消耗作用。【結論】菌株降解風化煤的作用在失重率和腐植酸類物質含量上因不同的風化煤樣而存在不同的主導作用，可以指導風化煤進一步的轉化生產。

風化煤；微生物降解；腐植酸；紅外光譜

【研究意義】風化煤是一種經濟價值較低、裸露于地表或位于地表淺層已經風化的煤。因其含有大量再生腐植酸和多種含氧活性功能團[1]，具有較大的利用價值，也是腐植酸的主要來源之一。腐植酸廣泛用于石油開采、陶瓷工業、醫藥衛生和環境保護等領域[2-3]，特別是在農業上也具有廣闊的應用前景[4-8]。【前人研究進展】我國風化煤貯藏量十分巨大，大量分布于山西、新疆、內蒙古、黑龍江、云南等地區。但是，由于地理環境和形成年代等差異，使得各風化煤的理化性質存在巨大差異，直接影響了其利用的效果。韓威[9]等對8種微生物對23種煤樣的研究表明菌種對煤樣的生物溶媒效果差異較大；張昕[10]等研究了4種真菌降解山西臨汾和內蒙古風化煤后的失重率的平均差異在10 %左右；馮曉霄[11]等研究的微生物菌株對新疆低階煤的轉化率為50 %左右；王春穎[12]等通過優化工藝參數使風化煤的降解率達到29.28 %。類似的研究表明，同一微生物菌株因不同風化煤樣而存在明顯的轉化差異，不同微生物菌株對同一風化煤樣也存在明顯的轉化差異，即微生物菌株對不同的風化煤樣存在不同的降解特性，同時發酵工藝的優化可以提高降解率，這就使得微生物菌種與風化煤之間匹配及降解特性的研究顯得十分重要。【本研究切入點】本研究以3個不同來源的風化煤樣為研究材料，其總腐植酸、游離腐植酸和黃腐酸的含量存在明顯差異；篩選出具有降解作用的微生物菌株F75，并在固體和液體培養條件下，從各腐植酸含量及結構的變化上分析菌株對其的降解特性。【擬解決的關鍵問題】為優化其發酵工藝、提高風化煤的降解效率及進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：菌株F75，以風化煤為唯一碳源，分離自菜園土壤，保存于本實驗室。供試風化煤：3種不同來源的風化煤，理化性質見下表[檢測由中國腐植酸工業協會腐植酸質量檢測中心(太原)完成]。

從表1可以看出，3個風化煤樣在總腐植酸、游離腐植酸和黃腐酸的含量上存在明顯差異。其中，風化煤YF01的總腐植酸和游離腐植酸含量基本一致，且較高，風化煤YF06的總腐植酸含量較高而游離腐植酸含量較低，風化煤YF09的總腐植酸含量和游離腐植酸含量且較低。供試培養基[10]：①固體定性培養基：Na2HPO44.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，酵母浸出粉6.0 g，去離子水1000 mL，瓊脂15～20 g。②液體培養基：(NH4)2SO42.6 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去離子水1000 mL，風化煤10.0 g，pH值為6.0。③無機鹽溶液：(NH4)2SO43.7 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去離子水1000 mL。④葡萄糖無機鹽營養液：每升無機鹽營養液加入5 g葡萄糖。

1.2 菌株F75對風化煤樣降解能力的篩選

將純化的菌種接種到固體定性培養基上，28 ℃下培養5～7 d。待菌絲長滿平板表面，將滅菌后風化煤均勻灑在菌絲上，繼續培養，每日觀察并記錄風化煤顆粒被溶解的情況。

1.3 風化煤降解菌株的鑒定

形態學鑒定：對分離到的菌株采用PDA平板、顯微鏡(乳酸石炭酸棉蘭染色),對菌落、菌絲、孢子等結構進行觀察，并參照《真菌鑒定手冊》[16]和《中國真菌志》[17]進行鑒定。

分子生物學鑒定：采用生工公司生產的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取該菌的DNA，并進行PCR擴增18S rDNA序列，引物采用真菌18S rDNA序列擴增通用引物NS1(5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS6(5’-GCATCACAGACCAGATATTGCCTC-3’)。PCR反應體系為：10×Buffer(with Mg2+) 2.5 μl，dNTP(各2.5 mM)1.0 μl，引物(10 μM)各 0.5 μl，Taq酶(2 U/μl)0.2 μl，DNA模板0.5 μl，加無菌水補至25 μl。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物委托上海生工有限公司進行測序。 將18 S rDNA測序結果提交到NCBI數據庫并進行BLAST比對。

在我國眾多工程測繪工作中，不動產測繪是重點內容，它不僅可以為房產測繪工作提供數據指導，同時也可以為城市現代化建設提供幫助。然而不動產測繪在實際的應用過程中還存在一些缺陷和不足，這就導致不動產統一登記管理工作無法發揮出實質性作用，同時也阻礙了城市化建設的進一步實施。因此，相關研究工作人員必須要給予高度重視，切實提高不動產測繪的水平和質量，確保不動產統一登記管理工作有條不紊地進行，最終加快我國城市化建設的步伐。

表1 3個風化煤樣的理化性質

圖1 菌株F75對3個風化煤樣的降解Fig.1 Degradation of 3 kinds of weathered coal by strain F75

1.4 風化煤液體降解特性的研究

將菌株活化后，接種到液體培養基中，50 mL培養基接種量為1/4個平板。28 ℃下培養7 d后，離心(12 000 r/min)15 min，上清液稀釋12.5倍后測定190～280 nm(間距5 nm)的吸光度；測定上清液中黃腐酸、水溶性腐植酸的含量[18]。同時將上清液先用6 mol·L-1H2SO4調節pH值至1,形成絮狀沉淀,然后離心(12 000 r/min)15 min,沉降物在75 ℃烘干,即得固體水溶性組分并進行FT-IR分析[9-10]。沉降物在75 ℃烘至恒重，計算損失的質量，失重率為培養基中加人的風化煤質量與沉降物質量(包括菌體和未分解的風化煤)之間的差值與原加入風化煤的質量之比，用百分數表示。同時做不接種的空白對照(CK)，重復3次。

1.5 風化煤固體降解特性的研究

準確稱取10.0 g風化煤于150 mL三角瓶中，每瓶接種1/2平板的活化菌株并進行如下處理：①加入3 mL無機鹽營養液，②加入3 mL葡萄糖無機鹽溶液，并分別進行滅菌和不滅菌處理；每瓶中補水至28 ℃培養30 d，7～10 d補1次水(約3 mL)，以維持合適的濕度(含水量約為30 %)，每個處理做3次重復。同時做滅菌和不滅菌的不接種處理為對照。培養結束時將培養物在75 ℃下烘干并研細，測定黃腐酸、水溶性和游離性腐植酸的含量[16]。

圖2 菌株在PDA上的菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain on PDA

1.6 數據分析

試驗數據采用Mintab 14 軟件進行統計分析, 采用Tukey’s 進行多重比較。文中圖采用Excel 繪制,圖中數據表示為3 次重復的平均值±標準誤(SE)。

2 結果與分析

2.1 菌株F75對風化煤降解作用的篩選

將菌株在固體定性培養基上培養，待菌絲基本長滿平板后加入風化煤繼續培養，3 d后，培養基被染成了棕黃色(圖1)，說明菌株F75對3個風化煤樣(YF01、YF06、YF09)均出現了不同程度的溶煤現象。

2.2 菌種鑒定

菌株F75在PDA平板上菌落生長快，表面黑色粉末狀(圖2)；分生孢子頭的頂囊球形或近球形(圖3)，小梗雙層，第一層粗大，第二層短小，呈放射狀排列，布滿整個頂囊，頂端有鏈形孢子，初步判定F75為黑曲霉。

將測得的18SrDNA基因序列在 NCBI 上進行同源性檢索(圖4)，結果表明，所測序列與黑曲霉(Aspergillusniger) 同源性為 100 %。綜合形態特征和18SrDNA基因序列同源性兩方面分析，該菌株鑒定為黑曲霉(Aspergillusniger)。

圖3 菌株在顯微鏡下的生長形態Fig.3 Growth morphology of strain under microscope

圖4 菌株的18SrDNA 序列PCR擴增產物Fig.4 Result of Genomic DNA ITS PCR amplification

圖5 培養物上清液的吸收曲線Fig.5 Ultraviolet absorption curve of culture supernatant

2.3 風化煤液體降解特性的研究

2.3.1 液體培養下降解物紫外分析 從圖5可以看出，經菌株F75液體培養條件下的降解后，風化煤YF01和YF09在190～280 nm的吸收曲線是相似的。接種處理與不接種處理相比，提高小于205 nm的吸光值，降低大于205 nm的吸光值，說明該菌株分解了風化煤中水溶性組分，特別是吸收大于205 nm紫外光的物質。而風化煤YF06的吸收曲線與YF01和YF09不同，接種處理和不接種處理的紫外吸收曲線相似，但接種處理的吸光度明顯高于不接種處理，并且波長越短，增加的幅度越高。這說明培養過程中風化煤中有大量的物質，可能是腐植酸類物質轉化為水溶性狀態，所溶解出來的物質組成也受到接種微生物菌株的影響，吸收低波長紫外光處的物質顯著增加，隨著波長的增大吸光值得增量有所下降。

圖6 風化煤YF01培養物的紅外吸收光譜Fig.6 IR spectra of weathered coal YF01 cultures

圖7 風化煤YF06培養物的紅外吸收光譜Fig.7 IR spectra of weathered coal YF06 cultures

2.3.2 液體培養下降解物紅外分析 從圖6可以看出，接種菌種F75與對照相較，譜圖的形狀基本相似，在1400 cm-1(脂族C-H變形振動)處減弱，1230～1034 cm-1處峰形平緩且有肩峰，而在910、600～760 cm-1處發生了不同程度的位移，說明可能是碳鏈縮短、羧基官能團含量存在差異，結構較復雜且另含有其他官能團，降解作用較強。

從圖7可以看出，接種菌種F75與對照相較，譜圖的形狀基本相似，在1720 cm-1處有一個缺失的小峰，1652～1631 cm-1處多出3個肩峰，而在760 cm-1處的峰形較平緩；說明菌株F75降解風化煤YF06后產生的羧基官能團類物質種類多，結構復雜。

從圖8可以看出，接種菌種F75與對照相較，譜圖的形狀基本相似，1266～1035 cm-1處多出5個肩峰，937～858 cm-1處有3個加強峰及小位移，760 cm-1處有2個加強峰；說明在羧基官能團上含量較多且結構較復雜，而在C-H彎曲的面外振動有明顯的加強，即菌株F75對風化煤YF09的降解可能更多的集中在腐植酸類物質上，其含量可能增加量較大。

2.3.3 液體培養下風化煤的降解特性 從風化煤液體培養后的失重率(圖9)變化看出，接種菌株F75后各風化煤的失重率明顯高于對照。對照處理的風化煤YF01、YF06、YF09的失重率分別是5.0 %、4.5 %和11.5 %；接種菌株F75后的失重率為19 %、13 %、24 %。其中接種菌株F75后，對風化煤YF01的降解效果最好。

圖8 風化煤YF09培養物的紅外吸收光譜Fig.8 IR spectra of weathered coal YF09 cultures

圖9 液體培養下風化煤的失重率Fig.9 Weight loss rate of weathered coal under the condition of liquid culture

從風化煤液體培養后的上清液中水溶性腐植酸含量的變化(圖10)看出，接種菌株F75后各風化煤培養液中水溶性腐植酸的含量相較于對照均明顯提高。對照風化煤YF01、YF06、YF09的培養液中水溶性腐植酸的含量分別是1.25 %、0.27 %和1.56 %；接種菌株75后的培養液中水溶性腐植酸的含量約為2.33 %、1.70 %、2.94 %。其中接種菌株F75后，風化煤YF06的降解效果最好，由于對照風化煤YF06的水溶性腐植酸含量最低，故而其增效最大。

從風化煤液體培養后的上清液中黃腐酸含量(圖11)的變化看出，接種菌株F75后各風化煤培養液中黃腐酸的含量相較于對照均明顯提高。對照風化煤YF01、YF06、YF09的培養液中水溶性腐植酸的含量分別是0.56 %、0.32 %和0.62 %；接種菌株F75后的培養液中水溶性腐植酸的含量約為1.44 %、1.31 %、1.68 %。其中接種菌株F75后，風化煤YF06的降解效果最好，而風化煤YF09的黃腐酸的含量最高。

2.4 風化煤固體降解特性的研究

3個風化煤樣經過固體培養后，腐植酸的含量發生了明顯的變化。從表2可以看出，①接種菌種后風化煤中游離腐植酸的含量有所增加。風化煤YF01和YF09的游離腐植酸含量在各處理中較對照的變化不明顯；而風化煤YF06游離腐植酸含量較對照則明顯提高，而且加糖高于不加糖，不滅菌高于滅菌，說明加糖可促進菌種生長，且對于風化煤YF06的降解存在菌種之間的協同作用。②在固體培養后風化煤的水溶性腐植酸含量的變化上，接種菌種較于不接種有大幅度的提高。風化煤YF01和YF06的處理中，滅菌處理的加糖高于不加糖，不滅菌處理不加糖高于加糖，說明菌株F75對風化煤的降解機理與風化煤自身微生物的降解機理不同。而在風化煤YF09的各處理中，不加糖高于加糖，且滅菌高于不滅菌，說明對風化煤YF09的降解以菌株F75為主。③從風化煤固體培養后黃腐酸的變化看，風化煤YF01和YF09的表現相似，不加糖高于加糖，可能菌株F75的生長對黃腐酸有所消耗，但不大；風化煤YF06的處理中，加糖促進了風化煤的降解，但接種較不接種提高幅度不大，菌株F75的生長的黃腐酸有明顯的消耗。綜上所述，在固體發酵中，對于風化煤YF01和YF09應不加糖或少加糖來提高水溶性腐植酸和黃腐酸的含量，而風化煤YF06可以通過添加糖來提高游離腐植酸和水溶性腐植酸的含量。

圖10 液體培養下風化煤的水溶性腐植酸含量Fig.10 Water soluble humic acid content of weathered coal under the condition of liquid culture

圖11 液體培養下風化煤的黃腐酸含量Fig.11 Fulvic acid content of weathered coal under the condition of liquid culture

2.5 風化煤的理化性質

山西風化煤儲量巨大，約為80億噸，且煤種豐富。目前，筆者組已收集到10份來自不同產地的風化煤，其中山西風化煤6種。其理化性質見表3。

從表3可以看出，僅僅是由于地理環境的不同，就使得風化煤的理化性質差異較大。根據總腐植酸、游離腐植酸和黃腐酸的含量，以及pH值的差異，我們選取了YF01、YF06和YF09號風化煤作為研究材料。其中風化煤YF01的總腐植酸和游離腐植酸含量都較高，風化煤YF06的總腐植酸含量較高而游離腐植酸含量較低，風化煤YF09的總腐植酸含量和游離腐植酸含量基本接近且較風化煤YF01低許多。以期從3個差異較大風化煤樣入手，解析它們對菌株降解的響應，為進一步的機理研究和生產提供依據。

表2 固體培養后各風化煤的性質

表3 風化煤的理化性質

3 討論與結論

近年來，國內外針對利用微生物轉化煤類物質開展廣泛的研究，降解微生物主要包括白腐菌、曲霉、木霉、青霉、鏈霉菌、假單胞菌及芽孢桿菌的一些屬等。本研究中降解微生物是黑曲霉，對3個風化煤樣均具有不同程度的溶解作用。黑曲霉廣泛分布于糧食、植物產品和土壤中；運用歷史悠久，被美國FDA認證為安全菌種(GRAS)。由于其產纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶等被用于飼料生產，秸稈腐熟等，也可用于風化煤的降解研究。HA的紅外光譜[21-23]中的吸收峰主要出現在以下區域：2920 cm-1(不對稱脂族C-H伸縮振動)，2850 cm-1(-CH2-對稱脂族C-H伸縮振動)，1720 cm-1(羧基的 C=O伸縮振動)，1620 cm-1(芳香C=C伸縮振動)，1400 cm-1(脂族C-H變形振動)，1230 cm-1(羧基中-OH的變形振動和C-O伸縮振動)和1034 cm-1(碳水化合物或多糖結構中C-O伸縮振動及無機物的Si-O伸縮振動)。張昕等[10]的研究中，1280～1580 cm-1有尖銳的吸收峰，2500～2000 cm-1的吸收峰向高波數移動，660 cm-1吸收的消失，暗示氫鍵結合減少；內蒙古烏海風化煤經WF2作用后，減弱。本研究發現，菌株F75對風化煤YF01的作用集中在碳鏈的縮短上，表現為失重率較高；對風化煤YF06和YF09的作用集中在羧基官能團上，表現為水溶性腐植酸和黃腐酸含量的增加，而且在羧基振動上變化較多，結構復雜，可能存在多種腐植酸類物質，有利于降解產物的利用，若進行定向消耗可加速風化煤的降解程度。同時，菌株F75對風化煤YF01 的液體降解后失重率最高，而風化煤YF 06和YF09則是水溶性腐植酸含量和游離腐植酸的含量明顯增加，這一結果和紅外光譜分析的結果一致。總之，可以從菌株F75對3個風化煤樣的降解特性的差異進一步對其降解機理和降解效果進行研究。

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StudyonCharacteristicsofStrainF75DegradingWeatheredCoal

YAN Min,LI Lei*,ZHANG Qiang, FENG Yue-cheng, SUN Jie, WU Wen-li

(Institute of Agricultural Environment and Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Shanxi Taiyuan 030031, China)

【Objective】Microbes can effectively improve the conversion efficiency of weathered coal. Due to the differences of geographical condition and age, weathered coals usually showed different physical and chemical properties，which affected the degradation of microbes. Therefore, the definition of degradation characteristics of different weathered coals could effectively improve its conversion efficiency. 【Method】In this study,taken Three different sources of weathered coal as tested materials, the strain ‘F75’ was screened and identified, which could degrade weathered coal. 【Result】Under the solid and liquid culture, the degradation characteristics of the contents and structure of humic acids of the strains from weathered coals were analyzed.The strain ‘F75’ could degrade the three sources of weathered coals and was identified as Aspergillus niger. Under the liquid culture, the UV analysis showed that the curves of F75 to the YF01 and YF09 increased firstly and then decreased from 190 nm to 280 nm, whereas the curve of F75 to the YF06 increased in this stage, and all the weathered coals showed obvious enhancement before 205 nm. The results of FT-IR showed that under the action of YF01, the carbon chain of F75 was shortened, with higher rate of weight loss, and for the YF06 and YF09, the content of water-soluble humic acid and fulvic acid increased, which implied that the effect of F75 to YF06 and YF09 concentrated in the carboxyl groups. Under the solid culture condition, the content of free humic acid of YF06 significantly increased when F75 was added; The content of water soluble humic acid and fulvic acid of three weathered coals significantly increased with F75 addition, of which the increase of water soluble humic acid had a dominant effect on YF09 and some consumption effect on YF06. 【Conclusion】During the degradation of different sources of weathered coals according to the rate of weight loss and the content of humic substances, the strain had different dominant effects, which would guide the further transformation of weathered coal.

Weathered coal; Microbial degradation; Humic acid; FT-IR

1001-4829(2017)10-2360-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.033

2016-11-20

土壤環境與養分資源山西省重點實驗室基金(2013004)；山西省農科院重點項目(YZD1511)

閆 敏(1975-),女，河北深縣人，碩士，副研究員，主要研究方向是農業微生物資源利用，ymrice@163.com，*為通訊作者， E-mail: tfslilei@163.com。

S154.39

A

(責任編輯 陳 虹)