鯉魚源嗜水氣單胞菌FAH5分離鑒定及其對寄主感染的解剖病理學研究

余文杰，陳觀水

(1.漳州職業技術學院，食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建農林大學，生命科學學院，福建 福州 350001)

鯉魚源嗜水氣單胞菌FAH5分離鑒定及其對寄主感染的解剖病理學研究

余文杰1，陳觀水2*

(1.漳州職業技術學院，食品與生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建農林大學，生命科學學院，福建 福州 350001)

【目的】對具有典型溶血性病征的染病鯉魚進行病原菌分離純化鑒定，并研究其對寄主感染的解剖病理學特征。【方法】采用營養瓊脂平板劃線方法從染病鯉魚肝臟樣本中分離得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自動細菌分析儀進行其生理生化特性探討，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。然后，采用嗜水氣單胞菌FAH5人工感染健康鯉魚，并通過解剖分析其器官病變情況。【結果】感染嗜水氣單胞菌FAH5后，鯉魚體表粘液增加，分泌物增多，鰭部和腹部泛紅，鰓部出現腐爛現象，并充血發黑。解剖后腹腔和內臟有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環障礙，血管擴張為主，嚴重感染時這些器官有充血、出血和溶血現象，活性細胞經感染病變至彌散性壞死。【結論】有溶血性病征的染病鯉魚分離純化得到了嗜水氣單胞菌FAH5，人工感染健康鯉魚后出現相同癥狀，解剖病理學特征為腹腔和內臟有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病變以血液循環障礙，血管擴張為主。

鯉魚；嗜水氣單胞菌；分離鑒定；解剖病理

【研究意義】鯉魚是亞洲原產的溫帶淡水魚，喜歡生活在平原地區氣候溫暖的湖泊，并且喜歡生活在水流緩慢的河川里。很早以前中國和日本就把鯉魚當做觀賞魚或食用魚養殖，而在德國等歐洲國家主要作為食用魚被養殖[1]。鯉魚背鰭比較長，沒有脂鰭，通常口邊有須，一般為2根，但也有的沒有須。鯉魚肉質鮮白，營養價值很高，其中的魚籽加工成的魚籽醬產品營養豐富，經濟價值很高。【前人研究進展】中國地區的鯉魚產業養殖在20世紀80年代中后期不斷發展，隨后不斷壯大[2]。鯉魚生長適應力強，生長迅速，遺傳穩定，飼料品質豐富，產量高。近些年，養殖規模擴大和養殖數量提高以后，養殖戶忽視了疾病預防措施，導致鯉魚的疾病品種增加，特別是一些機會污染菌引發的疾病[3]。鯉魚疾病的深入研究現如今處于起始階段，大部分研究人員局限在鯉魚疾病的分類和防治方法的簡單探討上面[4-5]，鯉魚病原菌的研究主要集中在嗜水氣單胞菌、鏈球菌和乳球菌分類上面[6-8]，很少涉及到致病性因子和致病機理的研究。迄今為止，鯉魚受到嗜水氣單胞菌感染后的解剖病理學研究還沒有研究人員涉及。2015年7月份，福建省閩侯縣泰富鯉魚養殖場的鯉魚爆發群體性疾病，死亡率達到80 %以上，造成養殖戶經濟損失嚴重。【本研究切入點】本研究擬對染病鯉魚進行病原菌分離純化和鑒定，并且開展此病原菌人工感染健康鯉魚的解剖病理學觀察。【擬解決的關鍵問題】旨在探討該病原菌的致病機制和有效預防控制措施，為鯉魚養殖產業的發展提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 染病鯉魚收集與病原菌的分離純化

養殖場的染病鯉魚經觀察患典型敗血癥，其主要癥狀為反應遲鈍，不攝食，嚴重者口鼻充血、出血。冷藏樣本帶回實驗室解剖后，觀察可見其肝臟腫大，有點狀出血，腎臟、腸道充血。在無菌條件下從染病鯉魚的肝、腎，皮膚和血液取樣，營養瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養24 h，挑取單菌落純化培養，經分離純化后的菌株低溫保存備用。

1.2 細菌鑒定

經細菌形狀、革蘭氏染色和生理生化檢測，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性細菌鑒定試劑條進行檢測，而后使用VITEK-32 全自動細菌分析儀進行鑒定。

1.3 試驗用健康鯉魚

人工感染所使用的健康鯉魚體長為6～8 cm，體重量為25～35 g，購買自福建省農科院鯉魚養殖場，在實驗室養殖溫室正常飼養7 d后用于人工感染病原菌試驗。

1.4 試驗方法

1.4.1 人工感染病原菌試驗 設定嗜水氣單胞菌FAH5感染組和生理鹽水注射對照組，每組鯉魚30尾。將前述分離純化的嗜水氣單胞菌FAH5在營養瓊脂上30 ℃培養18 h,然后以無菌生理鹽水稀釋成8×106cells/mL的菌液。感染組的鯉魚腹腔使用一次性針筒注射菌液，劑量150 μl/尾，對照組注射150 μl/尾的無菌生理鹽水。鯉魚飼養池水溫為25 ℃，24 h持續充氣，每天換水1次，換水量約為1/3。試驗以14 d為1個周期，每天記錄鯉魚的發病以及死亡情況，并且固定典型特征死亡鯉魚，用于后續解剖病理學分析。

1.4.2 解剖病理切片的制備 分別收集5尾人工感染組鯉魚和3尾對照組鯉魚的肝臟、脾臟、腎臟，解剖后使用波恩氏液和體積分數為2.5 % 的戊二醛進行固定。固定后的解剖塊使用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，最后使用萊克2180切片機進行切片，切片厚度為5 μm。切片完成后使用蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，使用奧林帕斯顯微鏡進行病理圖像拍照分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌生理生化反應及其鑒定

病原菌菌株FAH5經分離純化后，使用VITEK-32 全自動細菌分析儀鑒定為嗜水氣單胞菌，生理生化特性具體見表1。

2.2 鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后臨床學特性研究

從圖1可以看出，健康鯉魚體表和解剖后內臟均無典型病癥。鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后，其體表出現粘液增加的現象，可見斑狀血點，鰭部和腹部泛紅; 鰓部出現腐爛充血發黑(圖2～3)。解剖后腹腔和內臟器官有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環障礙，血管擴張為主，嚴重感染時這些器官有充血、出血和溶血現象(圖4～5)。鯉魚人工感染嗜水氣單胞菌FAH5試驗結果表明，感染初期, 鯉魚就開始出現疾病和出現死亡現象，7 d后死亡率高達70 %，相比較，對照組在實驗期內均未出現死亡，也無典型病征(表2)。

2.3 解剖病理學研究

2.3.1 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚肝臟發病情況 鯉魚感染病原菌程度輕度時，肝臟病理變化主要出現血液循環降低，肝臟中央靜脈擴張，引發紅細胞腫脹，嚴重感染時肝臟血管內皮細胞腫脹，導致血管腔溶血，肝臟血管周圍引發出血，引起含鐵血紅素沉積。早期病變肝臟細胞界限比較清楚，細胞稍微腫脹，胞質中出現少量空泡，這些空泡隨后逐漸合并后出現明顯的變性空泡。隨著病情加重，肝臟細胞出現彌散性壞死灶。大部分壞死肝臟細胞中心核消失，或者出現核固縮和核碎裂。伴隨血紅細胞的溶血，肝臟細胞出現貧血現象。肝臟細胞被膜透明變性，導致細胞死亡(圖6)。

2.3.2 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚脾臟發病情況 鯉魚感染病原菌程度輕度時，脾臟病理變化主要是可以明顯區別脾臟紅白髓細胞，其中含有豐富的淋巴細胞。脾腔中紅細胞數量少，血液循環較為順暢。脾臟周圍觀察到紅細胞腫脹現象，其紅細胞胞質內含少量粉紅色細顆粒，脾竇稍微擴張，動脈和靜脈血管中紅細胞開始腫脹。隨著病情加重，脾臟細胞內貧血，血管中紅細胞出現溶血，在毛細管血管周圍出現紅細胞壞死。壞死細胞其核內結構慢慢消失，導致細胞核消失，或者核碎裂和核固縮(圖7)。

表1 菌株FAH5生理生化特性

圖1 鯉魚未感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片對照Fig.1 Anatomical slice of carp without infection of Aeromonas hydrophila FAH5

圖2 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5體表皮膚出血Fig.2 Skin hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

實驗組類別Experimentalgroupcategory實驗鯉魚數量Experimentalcarpnumber人工感染后不同時間段鯉魚死亡數量Mortalityofcarpatdifferenttimeafterartificialinfection1d2d3d4d5d6d7d8d9d死亡鯉魚數量NumberofdeadcarpFAH5感染組3034552110021生理鹽水對照組300000000000

圖3 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5體表尾鰭出血Fig.3 Tail fin bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

圖4 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片肝臟出血Fig.4 Hepatic hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

圖5 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5解剖切片腸道出血Fig.5 Intestinal bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

2.3.3 人工感染嗜水氣單胞菌FAH5鯉魚腎臟發病情況 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5后其腎臟的病變主要是腎間質出現腫脹和充血現象，淋巴細胞出現壞死現象，腎臟細胞出現貧血現象；腎小體和腎小管影響程度較小，腎小管出現少量顆粒沉淀，從而喪失排水能力；腎小體毛細血管出現萎縮現象，導致腎臟細胞囊腔變大(圖8)。

圖6 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5肝臟器官切片(400倍)Fig.6 Liver organ slice of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

圖7 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5脾臟器官切片(500倍)Fig.7 Splenic biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (500×)

圖8 鯉魚感染嗜水氣單胞菌FAH5腎臟器官切片(400倍)Fig.8 Renal biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

3 討 論

采用營養瓊脂平板劃線方法從染病鯉魚肝臟樣本中分離得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自動細菌分析儀進行其生理生化特性探討，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。這和前人的研究比較相似，如嗜水氣單胞菌感染鯉魚后產生敗血癥和出血性水腫，氣單胞菌感染鯉魚產生腹水疾病[4-5]。儲衛華等從患病鯉魚中可以分離到病原菌嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌[7]。

將分離純化的嗜水氣單胞菌FAH5人工感染健康鯉魚后，感染組和自然發病魚體癥狀一致，因此認為自然發病魚體的病原菌為嗜水氣單胞菌。鯉魚受到嗜水氣單胞菌FAH5感染后的臨床癥狀表現為，體表粘液出現增加，分泌物增多，以典型敗血癥為特征，鰭部和腹部泛紅，鰓部出現腐爛，充血發黑。解剖后腹腔和內臟器官有出血點，肝臟，腎臟，脾臟等器官病理變化以血液循環障礙，血管擴張為主，嚴重感染時這些器官有充血、出血和溶血現象，活性細胞經感染病變至彌散性壞死。

染病鯉魚解剖病理研究發現，嗜水氣單胞菌產生的毒素是通過血液循環作用進入到各內臟器官，從而損傷各個內臟器官的功能。肝臟，脾臟，腎臟的病理變化是從血管及血紅細胞產生病變，然后引發各個內臟器官充血、出血和溶血。內臟器官解剖切片研究表明，鯉魚的肝臟，脾臟和腎臟在發病初期，均表現為局部血液循環障礙，微血管腫脹擴張，引發臟器充血、出血、溶血和貧血現象，最后引發活性細胞顆粒變性和空泡變性，再發展后出現彌散性壞死灶。引發鯉魚產生這些病變的原因主要是致病性嗜水氣單胞菌分泌各種毒素，包括溶血素、腸毒素和細胞毒素，這些毒素引發血紅細胞裂解，活性細胞滲透性變大，損傷毛細血管，引起鯉魚敗血癥[9-10]。本研究的結果表明，對于鯉魚的養殖，在疾病產生初期，內臟器官還未出現實質病變的時候，采取預防措施可以使鯉魚恢復健康，但如果疾病嚴重并且爆發時間較長時，就會出現鯉魚器官壞死，無法進行治療。

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DetectionofAeromonashydrophilaFAH5andPathologicalObservationofCyprinuscarpioInfectedwithStrain

YU Wen-jie1, CHEN Guan-shui2*

(1.Zhangzhou Vocational and Technical College, Department of Food and Biological Engineering, Fujian Zhangzhou 363000,China；2.Fujian Agriculture and Forestry University, College of Life Sciences, Fujian Fuzhou 350001,China)

【Objective】The pathogenic bacteria were isolated, purified and identified from the infectedCyprinuscarpiowith typical hemolytic symptoms, and the anatomical and pathological features of the infection were studied.【Method】The pathogen FAH5 was isolated from infectedCyprinuscarpioliver samples, its physiological and biochemical characteristics by VITEK-32 automatic analyzer were studied, which was identified asAeromonashydrophila. Then, the healthyCyprinuscarpiowere infected withAeromonashydrophilaFAH5, and their anatomical pathological changes were analyzed.【Result】After the infection withAeromonashydrophilaFAH5,Cyprinuscarpiomucus increased, secretions increased, fins and abdomen became red, and gills appeared rotten.The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the blood circulation disorders and vascular dilatation of the liver, kidney, spleen and other organs were found.Serious infections in these organs were found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.【Conclusion】TheAeromonashydrophilaFAH5 was isolated from theCyprinuscarpiowith hemolytic disease symptoms. The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the liver, kidney, spleen and other organs were found blood circulation disorders and vascular dilatation. Serious infection in these organs was found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.

Cyprinuscarpio;Aeromonashydrophila; Detection; Anatomical pathology

1001-4829(2017)10-2388-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.038

2016-11-10

國家自然科學基金(30900915)；福建省科技廳科學研究項目(JK2012012)

余文杰(1977-)，男，福建漳州人，講師，碩士，從事生物科學的教學及科研工作，E-mail：1527076860@qq.com；*為通訊作者：陳觀水，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：主要從事基因克隆與功能相關研究工作，水產動物繁育及病害防治，E-mail：2085404947@qq.com。

S965.116

A

(責任編輯 陳 虹)