不同飼料飼養黃牛瘤胃厭氧真菌的多樣性對比研究

李亞丹，楊 輝，盧向陽，田 云*

(1.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.長沙環境保護職業技術學院環境科學系，湖南 長沙 410004)

不同飼料飼養黃牛瘤胃厭氧真菌的多樣性對比研究

李亞丹1,2，楊 輝1，盧向陽1，田 云1*

(1.湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.長沙環境保護職業技術學院環境科學系，湖南 長沙 410004)

【目的】探究不同飼料飼養黃牛瘤胃厭氧真菌多樣性的差異，了解芒草單一飼料飼養時瘤胃中特殊的真菌種類。【方法】通過構建芒草單一喂養、混合飼料飼養的黃牛瘤胃微生物18S rRNA基因文庫，來對比分析單一飼喂芒草對瘤胃厭氧真菌多樣性的影響。【結果】發現持續喂養18個月后，混合飼料飼養牛瘤胃真菌包含的種類較分散，無明顯的優勢類別，而芒草單一喂養牛瘤胃真菌包含的種類相對集中，主要集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis，Microdochiumsp.幾種。【結論】使用芒草單一飼養確實改變了黃牛瘤胃中真菌的組成，并且其中優勢真菌類群很可能與芒草的降解有密切關系，為今后開發瘤胃微生物資源在生物能源方面的利用奠定基礎。

黃牛；瘤胃；芒草；18S rRNA；真菌

【研究意義】反芻動物瘤胃微生物長期處于恒定溫度、恒定pH值、低氧氣濃度的特殊環境，所以瘤胃微生物的純分離培養受到極大的限制。【前人研究進展】20世紀70年代末，研究人員首次發現瘤胃內存在一個重要的微生物類群，厭氧真菌[1]。最近，仍有諸多新的微生物種陸續分離出來，如Mitsuokellajalaludinii[2]，Eubacteriumpyruvativorans[3]和Cellulosilyticumruminicola[4]。瘤胃中厭氧真菌游動孢子數為103～105/mL，對于瘤胃微生物類別的認識在不斷地豐富。瘤胃真菌的生物量約占瘤胃微生物總量的8 %[5]。截止2000年，瘤胃中已有15種厭氧真菌分離成功。根據其孢子、菌絲的形態分類，可將瘤胃真菌劃分為多中心類型和單中心類型。其中，多中心類型真菌主要包括Orpinomyces和Anaeromyces兩個屬，單中心類型真菌主要包括Neocallimastix，Promyces，Caeomyces3個屬,具體詳見表1。

表1 瘤胃主要真菌種類[5-6]

瘤胃真菌不僅能分泌產生纖維素酶，真菌的穿透生長還使植物組織纖維內部張力減小，使其變得疏松而易于降解。有研究證實，在無瘤胃細菌存在條件下，瘤胃真菌能完成粗纖維飼料中的干物質62 %的降解[6]，瘤胃真菌對于瘤胃內的纖維質成分的高效降解能力可見一斑。【本研究切入點】因此，通過高纖維含量飼料對黃牛進行馴養，研究黃牛瘤胃真菌多樣性的改變，對今后研究瘤胃對食物的消化吸收，以及利用牛瘤胃真菌資源降解纖維質材料的工作存在重要的意義。【擬解決的關鍵問題】擬通過構建牛瘤胃真菌18S rRNA基因克隆文庫的方法，分析飼喂單一芒草和普通飼料對于牛瘤胃真菌多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物飼養及樣品采集

實驗動物為湘西黃牛。在長沙縣江背鎮烏川湖村分組飼養(3頭/組)，試驗組 (M)僅以新鮮芒草為飼料，對照組 (C)以混合飼料酒糟、豆渣、干草為飼料，飼養時間為18個月。兩種飼料的纖維素含量采用VELP型纖維素測定儀測定(表2)。

牛屠宰后帶無菌手套分組取牛瘤胃內容物進行混合，再分為50 g/份，在液氮中速凍，帶回實驗室，置于-80 ℃備用。

1.2 高分子量瘤胃微生物總DNA的提取

以牛瘤胃內容物為實驗對象，通過除雜等步驟，得到瘤胃微生物，參照文獻[7]方法，提取總DNA，分別獲得試驗組總DNA和對照組總DNA。

1.3 PCR反應體系及條件

以真菌18S rRNA基因擴增引物[8]：(EF4：5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3′，fung5：5′-CTAAAA GTCCTGGTTCCCC-3′)和總DNA為模板，通過PCR反應擴增真菌18S rRNA基因。

1.4 18S rRNA基因克隆文庫的構建

每個模板同時進行3個平行PCR反應，將3次PCR產物混合以減少隨機性偏差。PCR產物用DNA純化試劑盒純化后的產物與pMD18-T載體按如下體系混勻，于16 ℃連接1 h。熱擊轉化后，加入500 μl新鮮LB培養基，恢復培養1 h后在含Amp (100 μg/mL)的固體LB培養基上進行涂布。試驗組18S rRNA基因文庫標記為FM，對照組18S rRNA基因標記為FC。液體培養將得到的菌落的對應菌液進行備份保藏。

1.5 核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分析

選用四堿基限制性內切酶MspⅠ和AfaⅠ先后2次對文庫中菌落的PCR產物進行酶切分析。酶切產物經3 %瓊脂糖電泳檢測，根據酶切譜帶初步確定克隆的分類單位 (OUT)。將經過兩次酶切分析的具有不同酶切譜帶的克隆初步確定為不同的分類單位，測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

表2 飼料成分比例

1.6 系統進化樹的構建及各OTU比例分析

使測序序列進行拼接，NCBI在線Blast n比對，獲得各序列在GeneBank中相似性最高的序列，下載用于與本實驗結果序列共同構建系統進化樹。用Neighbor-Jioning法構建進化樹，Bootstrap檢驗進化樹，自展數為1000。歸納整理序列信息，統計各運籌分類單元 (operational taxonomic units，OTU)及其所包含的克隆數，計算各個分類單元在文庫中所占比例。

2 結果與分析

根據測序結果進行結果中各序列間的比對，將完全一致序列歸為一個OUT，再與Genebank數據庫中已知真菌18S rRNA基因進行比對分析瘤胃真菌多樣性。

由表1可知，該文庫中19條序列與數據庫已知序列的序列相似性<97 %，約占總數的29.23 %，說明以芒草作為單一飼料的牛瘤胃真菌種類的新穎性強。其中FM-010和FM-017各包含5條序列，分別與Orpinomycessp.的18S rRNA基因序列相似性達到97 %，Orpinomycessp.很可能是試驗組牛瘤胃中的優勢真菌種類。進行序列的進化關系分析時，發現其中一支包括FM-012、FM-011、FM-010、FM-006、FM-009、FM-004、FM-013、FM-007、FM-016、FM-022、FM-017、FM-023，所包含33個克隆占文庫容量的50.77 % (圖1)。

而在對照組牛瘤胃真菌18S rRNA基因文庫中的41個克隆，絕大部分的序列與數據庫已知序列的相似性≥97 %，只有4條序列 (FC-009)與已知序列相似性<97 %，Gibellulopsisnigrescens(FC-010)為該庫中的優勢種，包含6條序列，占14.63 %(表2)。通過構建系統進化樹 (圖2)發現，同樣該庫中存在一支與已知序列親緣關系較遠的分支，包含12個OUT，分別為FC-001、FC-006、FC-008、FC-009和FC-002的分支與其他真菌的親緣關系比較遠，約占總數的34.14 %。

圖1 芒草馴養牛瘤胃真菌18S rRNA基因序列系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of fungual 18S rRNA gene sequences from Miscanthus sinensis (+) library

NumberofclonesinMiscanthussinensis(+)libraryNumberofclonesinMiscanthussinensis(-)libraryOrpinomycessp.303Piromycessp.92Neocallimastixsp.114Microdochiumsp.40Rhizophlyctisrosea20CandidatusMethanosphaerula20Pyrenochaetaacicola10Sarocladiumzeae06Aspergillusniger04Alternariaalternata05Candidacastellii03Ascomycotasp.04Gibellulopsisnigrescens06Neosartoryaudagawae04

圖2 混合飼料飼養牛瘤胃真菌18S rRNA基因序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of fungual 18S rRNA gene sequences from Miscanthus sinensis (-) library

比較試驗組和對照組18S rRNA基因文庫序列信息發現，混合飼料飼養的瘤胃真菌比對信息所包含的種類比較分散，如Orpinomycessp.，Sarocladiumzeae，Aspergillusniger，Piromycessp.，Alternariaalternata，Candidacastellii，Ascomycotasp.，Gibellulopsisnigrescens，Neosartoryaudagawae，而芒草單一喂養的牛瘤胃真菌包含的種類則相對集中，主要集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis，Microdochiumsp.幾種 (表3)。

3 討 論

纖維素、半纖維素以及木質素經多種化學鍵復合而形成天然木質纖維素，這種復雜的高分子化合物很難被任何單一的水解酶降解、破壞，因此需要多種酶協同作用完成其降解利用[9]。反芻動物之所以能夠大量采食木質纖維含量高的植物莖桿類飼料，正是依靠瘤胃內的各種細菌、真菌及瘤胃原生動物所分泌的多種纖維素、木質素、半纖維素降解的酶的統一作用。其中厭氧真菌會優先附著于植物材料表面，通過真菌假根對植物細胞壁的降解作用而進入植物維管組織內，這種物理性降解，能夠削弱木質化組織的抗性，穿透植物表皮角質層屏障，使得內部的成分暴露，更容易接觸瘤胃微生物產生的降解酶[10]。真菌在植物材料內部擴張，使植物纖維變得疏松，更加利于其它微生物與植物材料的接觸。在降解植物細胞壁的同時，厭氧真菌還分泌多種纖維素酶，據Lee等研究證實，厭氧真菌所產生的纖維素酶活力比目前工業上常用的纖維素酶活力高出很多倍[11]。

由于受到純分離培養條件的限制，對于瘤胃內厭氧真菌多樣性的認識一直不夠全面。沈贊明等從水牛瘤胃中分離得到Piromycessp.，Neocallimastixsp.，Orpinomycessp.，分離到的Neocallimastixsp.和Orpinomycessp.具有CMCase活力[12]。用不同飼料喂養牛，由于飼料中植物種類不同，其木質纖維的組成成分也不相同，因此降解過程所依賴的真菌種類和比例也有相應變化[13]。另一項對日糧組成影響瘤胃厭氧真菌的研究表明，當日糧組成纖維含量較高時，厭氧真菌的數量增加，反之厭氧真菌數量則低[1,14]。

4 結 論

本文通過與數據庫已知序列的比對，得到芒草馴養牛瘤胃真菌也集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis幾種，并與已知瘤胃內纖維降解菌種類部分一致。而在混合飼料飼養的牛瘤胃內真菌種類較多，不集中。這也從一定程度上說明了長期單一飼喂芒草對于瘤胃內的厭氧真菌種類有較大影響，且芒草馴養很可能使瘤胃真菌種類顯現出更利于降解纖維質材料的方向。Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixsp.等屬與芒草降解的具體關系需要進一步深入研究加以確定。對瘤胃厭氧真菌認識的進一步豐富，有助于更好掌握瘤胃微生態總體變化，以及更加深入地利用其分泌的多種纖維質降解酶所形成的酶系統，并很可能為芒草這一高纖維質含量的非糧食類植物在生物燃料方向的開發利用擴寬了降解酶資源。

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EvaluationofFungalDiversityinRumenofYellowCattle(Bostaurus)FedMiscanthussinensisorCommonMixedFeedstuff

LI Ya-dan1,2,YANG Hui1,LU Xiang-yang1,TIAN Yun1*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China；2.College of Environmental Science, Changsha Environmental Protection College, Hunan Changsha 410004, China)

【Objective】This study aimed to detect whetherMiscanthussinensiscould increase the special population of rumen fibrolitic fungi. 【Methods】The experiment was conducted by constructing two 18S rRNA gene libraries using ruminal samples from yellow cattle fed with either common mixed feedstuff (group C) orM.Sinensis(group M), and the diversity of ruminal fungi in the rumens of cattle of both groups was identified. 【Results】Based on the comparative analysis of these two groups, the fungal composition in group C/M was found to be: there wereOrpinomycessp.,Sarocladiumzeae,Aspergillusniger,Piromycessp.,Alternariaalternata,Candidacastellii,Ascomycotasp.,Gibellulopsisnigrescens,Neosartoryaudagawaein rumen of mixed forage feeding cattle, in contrast, the species in rumen ofMiscanthussinensisfeeding cattle was concentrated relatively:Orpinomycessp.,Piromycessp.,Neocallimastixfrontalis,Microdochiumsp..【Conclusion】Feeding cattle withM.sinensiswill change the fungal composition in the rumen; the increased fungi may be responsible for digestingM.sinensis, which will benefit us in further screening of potentially valuable bio-enzymes.

Cattle；Rumen；Miscanthussinensis；18S rRNA；Fungi

1001-4829(2017)10-2371-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.035

2016-12-05

湖南省戰略性新興產業關鍵共性技術導向類項目(2015GK1017)；湖南省教育廳科學研究項目(15K058, 16C0018)

李亞丹(1984-)，女，河北石家莊人，博士研究生，工程師，環境微生物技術，E-mial: 469480533@qq.com；*為通訊作者：田 云，男，湖南沅江人，博士研究生，教授，微生物學，E-mial: tianyun@hunau.edu.cn。

S182

A

(責任編輯 李 潔)