散結通絡方對缺血性腎病晚期大鼠MMP—2、TIMP—2表達的影響

王蕊+陳桂梅+李偉+劉蘭英++李嬌艷++李根茂+葛東宇++王耀獻

[摘要] 目的 探討散結通絡方對缺血性腎病晚期大鼠腎組織基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2）表達的影響。 方法 將SD雄性大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組（均給予生理鹽水3 mL/d）、藥物組[散結通絡方10.85 g/（kg·d）]，采用單側腎動脈不全結扎術建立模型。于實驗第28天檢測大鼠24 h尿蛋白定量及血肌酐。處死大鼠，取腎組織做光鏡檢查，觀察各組大鼠腎臟形態學改變；免疫組化法檢測腎組織MMP-2、TIMP-2表達。 結果 光鏡下模型組和藥物組大鼠的腎小球及腎小管間質均有損傷。與假手術組比較，模型組和藥物組腎小球硬化指數評分及腎小管間質損傷評分均明顯升高（P < 0.01），而藥物組較模型組降低（P < 0.01）。與模型組比較，藥物組MMP-2表達升高（P < 0.01），24 h尿蛋白定量、血肌酐及TIMP-2表達降低（P < 0.01），且兩組均高于假手術組（P < 0.01）。 結論 散結通絡方可能通過上調MMP-2、下調TIMP-2在腎組織中的表達對缺血性腎病晚期病變起防治作用。

[關鍵詞] 散結通絡方；缺血性腎??；基質金屬蛋白酶2；基質金屬蛋白酶組織抑制因子2；大鼠

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0024-04

Effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2， tissue inhibitor of metalloproteinase 2 in rats with ischemic nephropathy of advanced stage

WANG Rui1 CHEN Guimei1 LI Wei1 LIU Lanying1▲ LI Jiaoyan1 LI Genmao2 GE Dongyu2 WANG Yaoxian3

1.Department of Nephrology， the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2.Basic Research Center， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3.Department of Nephrology， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Sanjie Tongluo Decoction on the expression of matrix metalloproteinase 2 （MMP-2）， tssue inhibitor of metalloproteinase-2 （TIMP-2） of nephridial tissue in rats with ischemic nephropathy of advanced stage. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group （both groups were given normal saline 3 mL/d）， drug group [Sanjie Tongluo Decoction 10.85 g/（kg·d）] by random number table method. The unilateral renal artery insufficiency ligation was used to establish animal model. In the 28th day of experiment， the levels of 24 hours urinary protein and creatinine of rats were detected. The rats were put to death and nephridial tissue was collected to take light microscope examination， the changes of renal morphology in all groups were observed. Immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-2 and TIMP-2 of nephridial tissue. Results Under the light microscope， the glomerulus and tubulointerstitium in the model group and drug group had damage. Compared with sham operation group， the scores of glomerulosclerotic index and tubulointerstitial lesion in the model group and drug group were all increased （P < 0.01）， which of drug group were lower than those of model group （P < 0.01）. Compared with model group， the expression of MMP-2 in drug group was increased （P < 0.01）， 24 hours urinary protein， creatinine and the expression of TIMP-2 were decreased （P < 0.01）， which of both groups were higher than those of sham operation group （P < 0.01）. Conclusion Sanjie Tongluo Decoction can prevent the lesions of ischemic nephropathy of advanced stage by up-regulating the expression of MMP2 and down-regulating the expression of TIMP-2.endprint

[Key words] Sanjie Tongluo Decoction； Ischemic nephropathy； Matrix metalloproteinase 2； Tissue inhibitor of metalloproteinase 2； Rats

缺血性腎病是指腎動脈狹窄或阻塞，超過管腔60%，造成腎臟血流動力學改變，腎臟嚴重缺血而導致慢性腎臟病[1]。本課題組在臨床應用散結通絡方治療缺血性腎病晚期患者有顯效的基礎上[2]，通過對缺血性腎病晚期大鼠腎組織病理變化及應用免疫組化法測定基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2）在腎組織中表達的變化，探討散結通絡方干預缺血性腎病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，2～3月齡，體重190～220 g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2012-0001。經北京中醫藥大學倫理委員會批準。飼養于北京中醫藥大學實驗動物房，每籠10只，溫度（23±2）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環，自由飲水，普食。

1.2 主要試劑

MMP2抗體（BA0569）、TIMP2抗體（BA0576）（武漢博士德生物工程有限公司）；血肌酐測試盒（D130916）（南京建成生物工程有限公司）；尿微量白蛋白檢測試劑盒（Axis-Shield PoC AS）。

1.3 藥物

散結通絡方（北京康仁堂藥業有限公司配方顆粒劑），具體組成如下：生黃芪10 g、當歸10 g、黨參10 g、熟大黃5 g、川芎10 g、地龍10 g、海藻10 g、牡蠣30 g、莪術10 g、夏枯草30 g。

1.4 方法

1.4.1 分組 將36只雄性SD大鼠按照隨機數字表法分為假手術組（12只）、模型組（12只）、藥物組（12只）。

1.4.2 建模 大鼠適應性生長1周后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（0.4 mL/kg）腹腔麻醉后剪開腹腔，藥物組和模型組剝離出左側腎動脈，將0.25 mm×40 mm的針灸針與腎動脈長軸平行放置，用1號手術縫合線將腎動脈和針灸針扎在一起，抽出針灸針，關閉腹腔（動脈結扎為同一人操作）。假手術組只打開腹腔后縫合。術后次日自由進食水。藥物組2只死于麻醉意外，模型組2只建模次日死亡，假手術組無死亡，為數據一致，假手術組隨機取10只大鼠。

據缺血性腎病文獻[3]制訂造模成功的標準，具體如下：①實驗動物傷口愈合。②體重下降，飲食運動量減少，體毛無華。③尿蛋白及血肌酐升高。④手術側腎臟體積縮小。鏡檢：腎小管損傷為主，腎小管結構明顯破壞，小管上皮細胞脫落、凋亡及壞死變性，小管萎縮，腎間質炎癥細胞彌漫性浸潤，腎小球系膜細胞增生，皮髓質膠原纖維廣泛沉積，腎間質纖維化伴腎小球硬化。

1.4.3 給藥方法 各組大鼠均從術后次日開始灌胃。藥物組：散結通絡方10.85 g/（kg·d）（人臨床用量的7倍），每日1次；模型組和假手術組：生理鹽水3 mL，每日1次。連續用藥28 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 生化指標 大鼠于代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液，測定24 h尿蛋白定量。于10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，腹主動脈取血3～5 mL，3000 r/min離心5 min，血清保存于-20℃冰箱，外送檢測血肌酐。

1.5.2 腎組織染色評定腎小球硬化指數評分與腎小管間質損傷評分 取左側腎臟，沖洗，去包膜，常規固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm切片，行HE、Masson染色。光鏡下各選20個視野行腎小球硬化指數評分與腎小管間質損傷評分[4]。腎小球硬化指數評分按正常、輕、中、重度分為0～3級。腎小球硬化指數評分=[（1×n1+2×n2+3×n3）/每片腎小球總數]×100%。n1～n3為1～3級腎小球個數。腎小管間質損傷評分分別按正常、輕、中、重度為0～3級，相應記為0～3分。

1.5.3 免疫組化法檢測MMP-2、TIMP-2 切片烤片，脫蠟，水化；熱修復后冷卻；PBS沖洗；加3% H2O2去離子水，室溫孵育20 min，PBS沖洗；滴加稀釋一抗（抗MMP-2、抗TIMP-2），4℃過夜；室溫20 min，PBS沖洗；滴加聚合物輔助劑，孵育20 min，PBS沖洗；滴加辣根酶標記抗山羊IgG聚合物，37℃孵育20 min，PBS沖洗；DAB顯色，鏡下觀察細胞著色，常規脫水、透明、封片。采用Image-Pro P1us 6.0專業圖像分析軟件，比較各組平均光密度值。

1.6 統計學方法

運用SPSS 20.0軟件，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡改變

2.1.1 HE染色 假手術組：腎組織結構清晰，腎小球和腎小管結構正常，腎間質無炎癥細胞浸潤。模型組：腎小管結構明顯破壞，小管上皮細胞大量脫落、壞死，小管顯著萎縮，腎間質大量炎癥細胞彌漫性浸潤，小球系膜細胞增生，腎小球硬化。藥物組：腎組織病變較模型組減輕，小管基底膜相對完整，小管上皮細胞部分空泡變性，炎癥細胞浸潤減輕，腎小球輕度硬化。見圖1（封三）。

2.1.2 Masson染色 假手術組：腎組織結構清晰，腎間質無纖維組織增生。模型組：皮髓質膠原纖維廣泛沉積。藥物組：膠原纖維增生較模型組減輕。見圖2（封三）。

2.2 病理評分

模型組和藥物組腎小球硬化指數及腎小管間質損傷評分均顯著高于假手術組（P < 0.01），而藥物組腎小球硬化指數及腎小管間質損傷評分低于模型組（P < 0.01）。見表1。endprint

注：與假手術組比較，*P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.01

2.3 血肌酐、24 h尿蛋白

與假手術組比較，模型組和藥物組血肌酐、24 h尿蛋白升高（P < 0.01）；與模型組比較，藥物組血肌酐、24 h尿蛋白降低（P < 0.01）。見表2。

2.4 MMP-2、TIMP-2的表達

MMP-2、TIMP-2陽性表達主要在腎間質細胞胞漿，腎小球少量表達。假手術組均呈弱陽性表達；模型組MMP-2呈陽性，TIMP-2呈強陽性；藥物組MMP-2呈強陽性，TIMP-2呈陽性。見圖3～4（封三）。

2.5 MMP-2、TIMP-2的光密度值

與假手術組比較，藥物組與模型組MMP-2、TIMP-2表達均增高（P < 0.01）；與模型組比較，藥物組MMP-2升高，TIMP-2降低（P < 0.01）。見表3。

3 討論

散結通絡方是本課題組針對缺血性腎病晚期病變研制的復方，依據臨床[2]及實驗研究[5-6]，結合絡病理論[7]，提出了缺血性腎病基本病機為腎絡損傷，腎絡絀急，進而腎絡郁滯、瘀阻、瘀塞致腎絡微型癥瘕。病初腎絡郁滯，脈絡郁滯致脈絡瘀阻。腎絡瘀塞為腎絡絀急、瘀阻發展致腎絡阻塞血流中斷，形成腎絡微型癥瘕?！安煌ā睘樨灤┦冀K的病理變化，故治療以“通”為用，本研究針對病變晚期腎絡瘀塞形成腎絡微型癥瘕病機，治法以破瘀消癥、散結通絡為主。方中黃芪、當歸、黨參為益氣補血之佳品，改善腎絡氣血中斷之不足?！把袣馑帯贝ㄜ籂I氣助血，活血祛瘀，破除脈絡瘀阻，改善氣血壅滯。地龍搜風通絡，更助氣血運行。熟大黃瀉火解毒力緩，不傷正氣。海藻、牡蠣消癥散結，與莪術、夏枯草配伍共奏散結通絡、清熱排毒之效。

缺血性腎病晚期病變以腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）為主要病理表現[3]。本研究中，模型組術后28 d時腎組織病理改變與之符合，且血肌酐及24 h尿蛋白定量明顯增高，以上病理改變及生化指標提示本研究造模成功。研究發現，RIF與細胞外基質（ECM）過度沉積和降解抑制密切相關[8]。正常情況下ECM處于一種合成與降解不斷更新的動態平衡之中，病理情況下ECM異常合成或降解障礙將導致RIF。基質金屬蛋白酶系統（MMPs/TIMPs）是調節ECM降解的關鍵系統，能降解除多糖以外的所有ECM成分。過量ECM沉積造成腎間質積聚、腎組織結構破壞及功能喪失，是慢性腎臟病終末期主要病理變化。MMPs/TIMPs在ECM的沉積與降解中發揮了重要作用。MMP-2可特異性降解Ⅰ、Ⅱ型膠原，分解多種ECM。TIMP-2能特異性抑制MMP-2，使ECM積聚。MMP-2/TIMP-2表達失衡與RIF關系密切。近年來諸多學者從動物實驗及臨床中西藥等相關試驗中均證實MMP/TIMP系統是調控RIF發生和發展的重要因素[9-20]。腎組織MMP/TIMP系統失衡，MMP表達降低，TIMP表達增加，可促進RIF，與本研究結果一致。本研究結果提示，與模型組比較，藥物組MMP-2表達增高，TIMP-2表達減少，且與假手術組比較，兩者均表達增加。由此推斷MMPs/TIMPs系統在正常腎組織中少量表達，且呈動態平衡；而在病理情況下，MMPs/TIMPs系統被激活，兩者均增高，RIF水平與MMP-2水平呈負相關，與TIMP-2呈正相關。

由此推斷，散結通絡方可能通過上調MMP-2、下調TIMP-2在腎組織中的表達來調控MMP/TIMP系統平衡，從而抑制腎間質纖維化程度，延緩缺血性腎病發展進程。

[參考文獻]

[1] 劉慧蘭.缺血性腎病的診斷與治療[J].中國全科醫學，2006，9（2）：95-96.

[2] 陳桂梅.“散結通絡方”干預慢性缺血性腎病的臨床觀察及動物實驗研究[D].北京：北京中醫藥大學，2016.

[3] 畢增祺，鄭法雷.慢性缺血性腎病的臨床表現與主要病理生理改變[J].中華內科雜志，2000，39（6）：418-419.

[4] Radford MG Jr，Donadio JV Jr，Bergstralh EJ，et al. Predicting renal outcome in IgA nephropathy [J]. J AM Soc Nephrol，1997，8（2）：199-207.

[5] 黃悅.益氣活血通絡法治療早期IRD的臨床研究[D].北京：北京中醫藥大學，2012.

[6] 李偉，劉蘭英，李嬌艷，等.益氣通絡方對慢性缺血性腎病早期大鼠AngⅡ、α-SMA表達的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志，2014，20（1）：52-53.

[7] 吳以嶺.脈絡論[M].北京：中國科學技術出版社，2010：184-186.

[8] LIU Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis [J]. Nat Rev Nephrol，2011，7（12）：684-696.

[9] 賀玉珍，張李梅，牟授菡，等.褐藻多糖硫酸酯對TGF-β1孵育的人腎小球系膜細胞MMP-2、TIMP-2表達的影響[J].濱州醫學院學報，2012，35（2）：104-107.

[10] 曾海飛，何澤云，徐琴，等.六味地黃湯對5/6腎切除大鼠MMP-2，TIMP-2表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2013，33（7）：13-17.

[11] 郭碧林，朱春玲.Egr-1蛋白、MMP-2、TGF-β1在腎小管間質纖維化大鼠中的表達及意義[J].中國現代醫學雜志，2013，23（7）：27-33.

[12] 陳榮權，陳香美，崔世維，等.基質金屬蛋白酶/組織金屬蛋白酶抑制物表達失衡在衰老大鼠腎小管間質損害中的意義[J].中華醫學雜志，2014，84（11）：58-63.

[13] 陸迅，魏明剛.黃芪多糖對腎間質纖維化大鼠的保護作用[J].中華中醫藥雜志，2014，29（6）：1998-2001.

[14] 馬秀娜.阿托法他汀對高血壓腎病患者基質金屬蛋白酶-2和尿微量白蛋白/肌酐的影響[J].醫療裝備，2016， 29（13）：94.

[15] 陳文軍，袁國棟，檀金川.紅花黃色素注射液對膜性腎病大鼠的腎保護作用及對基質金屬蛋白酶抑制物-1、基質金屬蛋白酶-9表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32（3）：65-68.

[16] 劉紅霞，張昱，李澎，等.加味黃芪赤風湯含藥血清對LPS誘導的小鼠腎小球系膜細胞Col-Ⅳ、MMP-2及TIMP-2表達的影響[J].中國中西醫結合雜志，2016，36（5）：592-596.

[17] 楊秀，馬立彬，謝祥成，等.大黃素對糖尿病大鼠腎組織基質金屬蛋白酶-2及金屬蛋白酶組織抑制劑-2表達的影響[J].中國糖尿病雜志，2016，24（2）：159-162.

[18] 曲萌，董佳婧，姜銳.紅參發酵產物對高糖下大鼠腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質降解的影響[J].吉林大學學報：醫學版，2017，43（2）：245-249.

[19] 董喜環.血清NGAL、CysC、RBP及MMP-2聯合檢測對糖尿病腎病的診斷價值[J].國際檢驗醫學雜志，2016， 37（14）：1965-1967.

[20] 童曄玲，任澤明，陳璇，等.三七總皂苷對TNF-α誘導的腎小球系膜細胞增殖及MMPs/TIMPs表達的影響[J].中國現代應用藥學，2017，34（6）：820-823.

（收稿日期：2017-07-02 本文編輯：張瑜杰）endprint