基于高密度遺傳圖譜的玉米籽粒灌漿特性遺傳解析

高星，李永祥，楊明濤，李琲琲，李春輝，宋燕春，張登峰，王天宇，黎裕，石云素

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基于高密度遺傳圖譜的玉米籽粒灌漿特性遺傳解析

高星，李永祥，楊明濤，李琲琲，李春輝，宋燕春，張登峰，王天宇，黎裕，石云素

（中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081）

灌漿是玉米籽粒形成的重要生理過程，直接決定了籽粒的最終產量。了解玉米籽粒灌漿特性相關性狀對粒重形成的作用，解析灌漿特性的遺傳基礎，為玉米高產育種實踐提供指導。以中國玉米骨干自交系黃早四（HZS）、旅28（Lv28）為親本構建的包含172個家系的重組自交系（recombination inbred line，RIL）群體為試驗材料。首先，利用Logistic模型與Richards模型，進行玉米籽粒灌漿過程擬合度的比較分析。其次，利用方差分析、相關性分析及回歸分析分別比較親本籽粒灌漿特性的差異，研究群體中不同灌漿特性相關性狀的關系及其對百粒重的貢獻。然后，利用GBS方法，對群體進行基因型分型，選擇親本間多態性標記，構建遺傳圖譜。最后，利用完備區間作圖法（inclusive composite interval mapping，ICIM）進行灌漿特性與生育期相關性狀的QTL分析。籽粒灌漿一般呈現慢-快-慢的變化趨勢，可分為緩增期、快增期以及減緩期3個階段。通過比較不同灌漿模型的擬合度發現，基于Richards模型的預測值與表型值間的決定系數顯著高于Logistic模型。比較親本間灌漿特性的差異發現，黃早四的平均灌漿速率為旅28的1.28倍，但旅28的灌漿持續時間為黃早四的1.07倍，親本之間在灌漿特性方面差異明顯。群體表型相關性分析發現，除緩增期灌漿持續時間（T1）外，其他灌漿特性相關性狀均與百粒重（HKW）存在顯著的正相關關系。回歸分析發現，快增期灌漿持續時間（T2）與灌漿速率（G2）可分別解釋百粒重表型變異的57.50%和30.00%。利用多態性SNP標記構建了全長為1 471 cM，標記間平均遺傳圖距為1 cM的遺傳圖譜。多個環境下共檢測到26個灌漿特性相關QTL、3個百粒重相關QTL及14個生育期相關的QTL，分布在玉米除第7染色體外的其他染色體上，LOD值介于3.27—9.05，單個QTL貢獻率為5.97%—21.16%。同時，利用聯合環境分析發現，控制不同性狀的QTL定位在染色體相同或相近的位置，形成了多個分布于玉米基因組bin 1.05、bin 2.03、bin 4.05、bin 4.06、bin 7.04、bin 9.04的QTL富集區域。其中，在位于bin 4.05（48.24 Mb—135.73 Mb）和bin 9.04（110.40 Mb—114.73 Mb）的區間之內，共定位到多個僅與灌漿速率相關的主效QTL。Richards模型能夠更好地模擬玉米籽粒的灌漿過程。在灌漿特性相關性狀中，快增期灌漿速率與灌漿持續時間對于玉米粒重的增加具有重要作用。單環境檢測發現，灌漿持續時間相關位點僅能在單環境中得以檢測，表現為環境敏感類型。聯合環境分析發現，在bin 4.05和bin 9.04區間內分別檢測到僅與灌漿速率相關的主效QTL，可作為玉米籽粒灌漿研究的重點區域。

玉米；灌漿速率；灌漿持續時間；數量性狀位點

0 引言

【研究意義】籽粒灌漿是玉米籽粒形成的重要過程，灌漿速率快慢與灌漿持續時間長短直接決定了籽粒的最終產量[1-2]，因此，具備合適的籽粒灌漿特性對玉米高產育種至關重要。中國多樣的生態類型造就了玉米種質資源的廣泛變異，對中國玉米基礎種質資源，特別是對骨干親本開展灌漿特性相關研究，解析其遺傳基礎，對于指導骨干親本高效利用和玉米高產育種實踐具有重要的理論研究價值與生產指導意義。【前人研究進展】籽粒灌漿是一個動態變化的過程，可分為緩增期、快增期及減緩期3個階段[3]。緩增期主要完成庫容建成，灌漿速率慢，有少量干物質的積累。快增期籽粒灌漿速率逐漸增加并達到最大值，完成大部分籽粒干物質的積累。減緩期籽粒灌漿速率持續降低，籽粒含水量下降達到生理成熟[4]。一般來講，籽粒灌漿呈現慢-快-慢的非線性變化過程，可用Logistic模型和Richards模型描述灌漿的變化規律[5-6]。玉米籽粒的大小受到灌漿速率與灌漿持續時間的共同影響，Borrás等[7]研究表明，灌漿速率能夠解釋84%的粒重表型變異。秦泰辰等[2]研究亦表明，灌漿速率對粒重的貢獻大于灌漿持續時間。但Daynard等[8]和Yang等[9]研究表明，粒重與灌漿持續時間顯著相關。遺傳基礎研究方面，籽粒的灌漿過程受到諸多要素的影響，表現為復雜的數量性狀特點。分子標記技術的發展和數量遺傳學統計方法的建立，為解析復雜數量性狀（包括籽粒灌漿特性）的遺傳基礎提供了有力支撐。在水稻中，Takai等[10]和Liu等[11]利用灌漿過程中不同階段的灌漿特性表型值，分別運用連鎖分析與關聯分析方法檢測到一些與灌漿特性相關位點。在小麥中，Wang等[12]利用連鎖分析方法檢測到39個灌漿特性相關QTL，其中包括17個平均灌漿速率相關QTL、16個最大灌漿速率相關QTL以及6個灌漿持續時間相關QTL。玉米方面，Liu等[13]利用黃C與許178構建的203個家系RIL群體，共檢測到32個灌漿特性相關的QTL，分布于玉米除第9染色體外的其余染色體上。Zhang等[14]利用黃C與許178構建的243個家系的永久F2群體，運用條件QTL分析方法，在4個環境6個取樣時期共檢測到47個灌漿特性相關的QTL，其中有多個QTL能夠在不同環境下檢測到。【本研究切入點】盡管在玉米籽粒灌漿特性遺傳研究方面取得了一定進展，定位到了一些相關的QTL，但針對中國玉米骨干親本灌漿特性開展的研究仍然較少，因此，需要利用高密度遺傳圖譜與玉米骨干親本構建的遺傳群體開展灌漿特性的遺傳研究。【擬解決的關鍵問題】本研究以在灌漿特性方面具有顯著差異的玉米骨干親本黃早四與旅28構建的RIL群體為試驗材料，比較Logistic模型及Richards模型在擬合玉米灌漿過程上的差異，研究不同灌漿特性相關性狀間的相關關系，分析各性狀對粒重的貢獻，挖掘控制灌漿特性的重要遺傳區段，為精細定位與候選基因的發掘提供基礎，對指導中國玉米骨干親本高效利用和高產育種提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

黃早四是中國重要的玉米育種骨干親本之一，具有早熟和灌漿速率快的優良特性[15-16]；而旅28是旅大紅骨類群中的代表性自交系，豐產性好，配合力高，但灌漿偏慢，生育期偏中晚[17]。2個親本均在中國玉米育種中發揮了重要作用。本研究以玉米自交系黃早四與旅28配制雜交組合，以“單粒傳法”連續自交7代，構建包含172個家系的重組自交系（recombination inbred line，RIL）群體為試驗材料[18]。

2015年在中國農業科學院作物科學研究所昌平試驗基地（15CP：40°10′N，116°13′E）和順義試驗基地（15SY：40°13′N，116°35'E）及2016年在中國農業科學院作物科學研究所新鄉試驗基地（16XX：35°05′N，113°42′E），共3個環境下種植172個家系及其親本。15CP和15SY 2個地點為春播，16XX為夏播。每份材料種植4行，行長3 m，行距0.6 m，株距25 cm。全部田間試驗中施肥、灌溉、防蟲與除草和當地生產上大田的田間管理一致。于各試驗基地氣象站收集最高溫度、最低溫度、平均溫度等氣象數據，以30℃為上限溫度，以10℃為下限溫度，計算每日有效溫度，以有效積溫作為灌漿的時間值擬合灌漿過程，計算灌漿參數[19]。

1.2 田間取樣及表型鑒定

小區50%植株吐絲記為吐絲期（day to silking，DS），選擇生育時期相對一致的植株掛牌標記。自授粉后10 d開始取樣，取樣間隔為5 d，直至果穗中部籽粒出現黑層，并記為生理成熟期（day to physiological maturity，DPM）。每個家系每次取2個果穗，剝取果穗中間籽粒，于105℃殺青30 min，75℃烘干72 h，調查粒數與籽粒干重，計算每個取樣點百粒重。

1.3 籽粒灌漿過程的擬合分析

以取樣點有效積溫為自變量，各取樣點百粒重為因變量，利用Curve Expert 1.4軟件中的Logistic模型W=A/(1+Be-kt)[5]和Richards模型W = A/(1+Be-kt)1/N[6,20]分別擬合籽粒的灌漿過程，式中A為最大百粒重（hundred kernel weight，HKW），t為取樣點有效積溫，B、k和N均為常數，通過比較分析確定玉米籽粒灌漿過程的最優擬合模型。

根據Richards模型速率方程的2個拐點t1= -ln((N2+3N+N(N2+6N+5)1/2)/2B)/K，t2=-ln((N2+3N- N(N2+6N+5)1/2)/2B)/K以及達到95%最大百粒重時間t3=-ln (((100/95)N-1)/B)/K可將灌漿過程分為3個階段（緩增期、快增期、減緩期），分別計算各階段灌漿速率（緩增期灌漿速率，G1；快增期灌漿速率，G2；減緩期灌漿速率，G3）、灌漿持續時間（緩增期灌漿持續時間，T1；快增期灌漿持續時間，T2；減緩期灌漿持續時間，T3）以及籽粒生長量（緩增期籽粒生長量，W1；快增期籽粒生長量，W2；減緩期籽粒生長量，W3）。平均灌漿速率Gmean= 2(N+2)/AK以及最大灌漿速率Gmax[6]。

1.4 表型數據的統計分析

利用SAS軟件進行表型數據的統計分析，采用“Proc TTest”程序比較不同灌漿模型以及不同灌漿階段決定系數的差異，采用“Proc GLM”程序分析群體不同灌漿相關性狀在不同環境中的差異。采用“Proc Mixed”程序計算多環境下各灌漿特性相關性狀的最優線性無偏估計（best linear unbiased prediction，BLUP），并利用“Proc Corr”程序分析各灌漿相關性狀間的相關關系，采用“Proc Reg”程序研究各灌漿特性相關性狀對百粒重表型變異的貢獻率，運用R軟件繪制散點圖與頻數分布圖。

1.5 遺傳圖譜構建

基于GBS測序數據[21]，在全基因組范圍內篩選多態性SNP標記，將等位基因頻率MAF＜0.05的SNP標記過濾，使用隱馬爾科夫模型（hidden markov model，HMM）對每個RIL家系進行基因型分型，基因型雜合位點設置為缺失。在所有多態性SNP標記中選擇遺傳距離為1 cM均勻分布的標記，構建遺傳圖譜[22-23]。

1.6 QTL分析

利用QTL IciMapping V4.1軟件，采用完備區間作圖方法[24]，在單環境以及聯合環境下進行QTL檢測。PIN值設置為0.001，步長（walking speed）為1 cM，在全基因組范圍內對目標性狀進行掃描，在=0.05顯著水平下將數據模擬運算（Permutation）1 000次來確定LOD閾值，當某位置檢測到的LOD值大于閾值時，則確定該位置存在1個QTL。

2 結果

2.1 不同灌漿模型的擬合度比較分析

Logistic模型W = A/(1+Be-kt)與Richards模型W = A/(1+Be-kt)1/N在玉米灌漿相關研究中均有應用。利用2種模型分別對3個環境下不同RIL家系的灌漿過程進行擬合，通過比較不同參數最終確定最優模型。針對整個灌漿過程而言，基于Logistic模型與Richards模型的預測值與觀測值間的決定系數均值分別為97.09%和97.48%，兩者均可模擬籽粒的灌漿過程，但Richards方程的決定系數顯著高于Logistic方程（＜0.05）。同時，還對3個灌漿階段分段進行了模擬比較，結果發現，Logistic模型不同階段的決定系數分別為54.47%（緩增期）、93.42%（快增期）和80.21%（減緩期），而Richards模型各階段的決定系數分別為82.23%（緩增期）、95.28%（快增期）和80.74%（減緩期）。兩模型緩增期的決定系數平均差值為27.76%，存在顯著差異（＜0.05）。另外，還利用Logistic模型擬合計算不同階段籽粒生長量占最大百粒重的比例，發現不同RIL家系所得比例為固定值，分別為20.23%（緩增期）、59.53%（快增期）和15.23%（減緩期），而Richards模型計算所得比值因材料而異，變化范圍分別為7.57%—49.01%（緩增期）、41.97%—60.96%（快增期）和4.01%—26.47%（減緩期），該結果更加切合實際。因此，Richards模型更加適合玉米籽粒灌漿過程的擬合運算。

2.2 玉米籽粒灌漿相關性狀表型分析

籽粒物質積累隨著灌漿過程的推進而不斷增加，但親本在各灌漿特性相關性狀的變化幅度上存在不同程度的差異。3個環境平均條件下，黃早四在緩增期、快增期、減緩期的灌漿速率（每百粒灌漿速率）分別為0.018（G1）、0.061（G2）和0.027 g·100-kernel-1·℃day-1（G3），旅28在緩增期、快增期、減緩期的灌漿速率分別為0.016（G1）、0.050（G2）和0.022 g·100-kernel-1·℃day-1（G3），黃早四的平均灌漿速率是旅28的1.28倍（表1）。同時發現，黃早四在授粉后279 ℃day左右達到最大灌漿速率，而旅28授粉后333℃day左右才能達到最大灌漿速率，也就是旅28達到最大灌漿速率的時間（從授粉日期算起）較黃早四要推遲2—3 d。旅28灌漿持續時間長于黃早四，為黃早四的1.07倍。3個環境平均條件下，緩增期、快增期、減緩期黃早四的灌漿持續時間分別為190.53（T1）、240.30（T2）和195.44 ℃day（T3），旅28在緩增期、快增期、減緩期的灌漿持續時間分別為198.80（T1）、253.78（T2）和209.99 ℃day（T3）。且黃早四的吐絲期與生理成熟期均早于旅28。黃早四籽粒灌漿速率快但灌漿持續時間短，而旅28籽粒灌漿時間長但灌漿速率相對較慢（圖1）。

在RIL群體中，生育期相關性狀、灌漿特性相關性狀和百粒重均存在較大的變異范圍，大部分性狀表型值峰度與偏度的絕對值均小于1，呈現正態分布或近似正態分布，滿足QTL定位要求。方差分析發現，不同環境下百粒重（HKW）、快增期灌漿持續時間（T2）、快增期籽粒生長量（W2）、減緩期灌漿持續時間（T3）、減緩期籽粒生長量（W3）、吐絲期（DS）和生理成熟期（DPM）均存在顯著性差異（＜0.01），但各階段灌漿速率、平均灌漿速率（Gmean）及最大灌漿速率（Gmax）均無顯著差異（表2）。不同階段灌漿持續時間的廣義遺傳力分別為26.59%（緩增期灌漿持續時間，T1）、26.41%（快增期灌漿持續時間，T2）和5.41%（減緩期灌漿持續時間，T3），不同階段灌漿速率的廣義遺傳力分別為33.53%（緩增期灌漿速率，G1）、67.50%（快增期灌漿速率，G2）和57.94%（減緩期灌漿速率，G3）。可見，灌漿持續時間受環境因素影響較大，遺傳力較低，但灌漿速率相關性狀在不同環境間的表現相對穩定，遺傳力較高。

表1 3個不同環境下親本灌漿特性與生育期相關性狀的表型差異

HKW：百粒重；T1：緩增期灌漿持續時間；G1：緩增期灌漿速率；W1：緩增期籽粒生長量；T2：快增期灌漿持續時間；G2：快增期灌漿速率；W2：快增期籽粒生長量；T3：減緩期灌漿持續時間；G3：減緩期灌漿速率；W3：減緩期籽粒生長量；Gmax：最大灌漿速率；Gmean：平均灌漿速率；DS：吐絲期；DPM：生理成熟期。下同

HKW: hundred kernel weight; T1: grain filling duration of the lag phase; G1: mean grain filling rate of the lag phase; W1: the increase of grain weigh in the lag phase; T2: grain filling duration of the effective grain filling phase; G2: mean grain filling rate of the effective grain filling phase; W2: the increase of grain weigh in the effective grain filling phase; T3: grain filling duration of the maturation drying phase; G3: mean grain filling rate of the maturation drying phase; W3: the increase of grain weigh in the maturation drying phase; Gmax: maximum grain filling rate; Gmean: mean grain filling rate; DS: day to silking; DPM: day to physiological maturity. The same as below

表2 灌漿特性與生育期相關性狀在RIL群體中的表現

**表示不同環境下表型在0.01水平下達到顯著水平

**represents the phenotype in different environments reach the significance levels of probability at 0.01

HZS：黃早四；Lv28：旅28；16XX：2016年新鄉；15SY：2015年順義；15CP：2015年昌平

2.3 玉米灌漿特性相關性狀相關性分析與回歸分析

相關性分析結果表明（圖2），除緩增期灌漿持續時間（T1）外，百粒重與其他灌漿特性相關性狀均存在顯著正相關關系，尤其與平均灌漿速率（Gmean，=0.56，＜0.01）、快增期灌漿速率（G2，=0.55，＜0.01）、緩增期灌漿速率（G1，=0.49，＜0.01）、減緩期灌漿速率（G3，=0.49，＜0.01）以及快增期灌漿持續時間（T2，=0.30，＜0.01）達到了極顯著水平。快增期灌漿持續時間（T2）、減緩期灌漿持續時間（T3）均與各階段灌漿速率以及平均灌漿速率（Gmean）存在顯著的負相關關系（＜0.01）。此外，將吐絲期（DS）、生理成熟期（DPM）與不同階段灌漿持續時間作相關性分析發現，快增期灌漿持續時間（T2）與生理成熟期（DPM，=0.17，＜0.01），吐絲期（DS）與生理成熟期（DPM，=0.60，＜0.01），均存在顯著的正相關關系。

以百粒重為因變量，不同灌漿特性相關性狀表型值為自變量，利用逐步回歸方法，分析不同灌漿特性相關性狀對粒重的貢獻，所得最優回歸方程為HKW = 462.076 G2**+ 0.028 T1*+ 0.264 T2**- 0.132 T3**- 29.440。回歸分析表明，快增期灌漿持續時間（T2）、快增期灌漿速率（G2）、減緩期灌漿持續時間（T3）、緩增期灌漿持續時間（T1）均達到顯著水平（＜0.05），分別能解釋百粒重57.50%、30.00%、4.01%和0.22%的表型變異，其他灌漿特性相關性狀均不顯著。其中，快增期灌漿持續時間（T2）與快增期灌漿速率（G2）共解釋百粒重變異的87.50%，且快增期內百粒重由3.83 g增加至17.11 g，重量增加量占最大百粒重的58.08%。可見，快增期對于百粒重形成具有決定性作用，且快增期灌漿持續時間對于粒重的貢獻大于灌漿速率。

HKW：百粒重；Gmean：平均灌漿速率；G1：緩增期灌漿速率；G2：快增期灌漿速率；G3：減緩期灌漿速率；T1：緩增期灌漿持續時間；T2：快增期灌漿持續時間；T3：減緩期灌漿持續時間；DS：吐絲期；DPM：生理成熟期。下同。*和**分別表示p= 0.05、p = 0.01水平下達到顯著水平，ns表示未達到顯著水平

2.4 玉米籽粒灌漿相關性狀QTL分析

利用GBS技術，對RIL家系進行基因型分型，獲得20萬個高質量的多態性SNP標記，從中篩選出1 471個遺傳距離為1 cM的標記，構建了總長度為 1 471 cM的遺傳連鎖圖譜。利用QTL IciMapping V4.1軟件，采用完備區間作圖方法對灌漿特性相關性狀進行QTL分析，3個環境共檢測到26個灌漿特性相關QTL、3個百粒重相關QTL以及14個生育期相關的QTL，分布在玉米基因組除第7染色體之外的其余染色體上，單個QTL表型貢獻率為5.97%—21.16%（表3）。同時，利用該軟件的多環境聯合分析模塊（QTL mapping for multi-environmental trials，MET），共檢測到18個灌漿特性相關QTL、3個百粒重相關QTL以及6個生育期相關QTL，分布在第1、2、3、4、5、7、9和10染色體上，單個QTL表型貢獻率為4.00%—18.85%（表4）。

2.4.1 百粒重 單環境下共檢測到3個影響百粒重的QTL，分別在第4染色體（2個）、第5染色體（1個）上。其中，第4染色體上的QTL可以在15CP、15SY共同檢測到，表型貢獻率分別為13.02%和19.82%，增效基因均來自于黃早四（表3）。在聯合環境分析中，第1、4、9染色體上各檢測到1個百粒重相關QTL（、和），表型貢獻率分別為4.74%、14.02%和5.00%，分別增加百粒重0.62、1.12和0.70 g，除外，其他QTL增效基因均來自黃早四（表4和圖3）。

2.4.2 緩增期灌漿特性 利用3個環境下緩增期灌漿速率，灌漿持續時間以及籽粒生長量的表型值，在單環境下共檢測到13個QTL，其中包含8個灌漿速率相關QTL，3個灌漿持續時間相關QTL以及2個籽粒生長量相關QTL，分別位于第1、3、4、5、8、9染色體上，可解釋表型變異的7.61%—18.17%（表3）。在聯合環境分析中，第4染色體上檢測到2個灌漿速率相關的QTL和2個籽粒生長量相關的QTL，其表型貢獻率為4.89%—11.76%，增效等位基因均來自于黃早四。其中，qG4-1和qW4-1共定位于48.24 Mb—65.82 Mb區間上，分別增加灌漿速率0.0012 g·100-kernel-1·℃day-1，增加籽粒生長量0.49 g（表4和圖3）。

表3 單環境條件下灌漿特性與生育期相關性狀QTL定位結果

加性效應為正值代表增效基因來源于旅28，加性效應為負值代表增效基因來源于黃早四。下同

The additive and negative value of the additive effect of the QTL indicates that the allele is contributed by Lv28 or HZS, respectively. The same as below

表4 聯合環境下灌漿特性及生育期相關性狀QTL分析

2.4.3 快增期灌漿特性 利用3個環境下快增期灌漿特性相關性狀的表型值，在單環境下共檢測到5個QTL，其中包含1個灌漿速率相關QTL，1個灌漿持續時間相關QTL以及3個籽粒生長量相關QTL，分布于第1、4、5、9染色體上，表型貢獻率均在10%以上，是控制相應性狀的主效QTL（表3）。在聯合環境分析中檢測到5個灌漿特性相關QTL，分布于第1、4、7、9染色體上，表型貢獻率為4.00%—8.59%，除qG9外，其他QTL的增效等位基因均來自于黃早四。

2.4.4 減緩期灌漿特性 利用3個環境下減緩期灌漿速率，灌漿持續時間以及籽粒生長量的表型值共檢測到5個QTL，其中包含2個灌漿速率相關QTL和3個籽粒生長量相關QTL，分布在第1、4、5、9染色體上，表型貢獻率為7.61%—14.46%，其中有3個QTL表型貢獻率在10%以上，是影響相應性狀的主效QTL（表3）。在聯合環境分析中，分別在第4染色體上檢測到1個灌漿速率相關的QTL，表型貢獻率為7.69%；在第5染色體上檢測到1個籽粒生長量相關的QTL，能夠解釋6.94%的表型差異（表4和圖3）。

W1：緩增期籽粒生長量；W2：快增期籽粒生長量；W3：減緩期籽粒生長量；Gmax：最大灌漿速率；箭頭方向表明增效基因來源，左：增效基因來源于旅28，右：增效基因來源于黃早四

2.4.5 平均灌漿速率與最大灌漿速率 在3個環境條件下共檢測到3個影響平均灌漿速率以及最大灌漿速率的QTL，分別在第3、4染色體上，相應表型貢獻率分別為8.90%、11.41%和12.31%，增效基因均來自于黃早四（表3），其中第4染色體上影響平均灌漿速率及最大灌漿速率的QTL共定位于相同區間。在聯合環境分析中，分別在第1、4、7、9染色體上，檢測到7個與平均灌漿速率、最大灌漿速率相關的QTL，除qG9和qG9增效基因來源于旅28外，其他QTL增效基因均來自黃早四（表4，圖3）。

2.4.6 生育期相關性狀 在3個環境條件下共檢測到8個吐絲期相關的QTL，6個生理成熟期相關的QTL，分別在第1、2、3、5、6、10染色體上，表型貢獻率為5.97%—21.16%，其中有6個QTL表型貢獻在10%以上，是影響相應性狀的主效QTL（表3）。其中，第2染色體物理位置為21.29 Mb—24.05 Mb區間內同時檢測到吐絲期與生理成熟期相關的QTL。第10染色體上與吐絲期相關的QTL可以在15CP和15SY中共同檢測到。聯合環境分析中，共檢測到2個與吐絲期相關QTL，4個生理成熟期相關的QTL，其中、和共定位于染色體相同或鄰近位置，且增效基因均來源于旅28。

聯合環境分析發現，控制不同性狀的QTL成簇出現，形成了多個QTL富集區域。在第1染色體物理位置為92.17 Mb—172.29 Mb區間內檢測到、qG1、qG1和qW1，增效基因均來自于黃早四；在第2染色體物理位置為21.29 Mb—24.05 Mb區間內檢測到、和，增效基因來自于旅28；在第4染色體物理位置為48.24 Mb—135.73 Mb內檢測到qG4-1、qW4-1、qG4、qG4、qG4和qG4，增效基因均來自于黃早四；物理位置為158.42 Mb—162.21 Mb區間內檢測到、qW4-2和qW4，這些QTL共定位到染色體相同區域，增效基因均來自于黃早四；在第9染色體物理位置為110.40 Mb—114.73 Mb區間范圍內檢測到qG9、qG9和qG9，增效基因均來自旅28。灌漿特性相關的QTL與生育期相關的QTL分別定位在不同的染色體上。

3 討論

3.1 不同模型對灌漿過程的擬合分析

動植物生長一般呈現慢-快-慢的非線性變化趨勢，Logistic模型以及Richards模型均廣泛應用于描述動植物的生長發育規律，同時在玉米籽粒灌漿研究中均有應用[5, 25]。Logistic模型作為Richards模型的一種特殊形式，其曲線是以W = A/2為中心點旋轉對稱所得，而Richards模型曲線取決于參數N[6]。本研究通過比較分析發現，整個灌漿過程中，基于Richards模型的預測值與觀測值間的決定系數都要高于Logistic模型，尤其在緩增期，基于Richards模型的決定系數為82.23%，而Logistic模型的決定系數僅為54.47%。同時，利用Logistic模型計算緩增期、快增期以及減緩期籽粒生長量占最大百粒重比例，發現不同RIL家系所得比值為固定值，而Richards模型計算所得比值卻因材料而異。可見，Richards模型更加準確，且更能反映籽粒的真實灌漿進程，因此，更加適合玉米籽粒灌漿過程的擬合運算。

3.2 灌漿速率與灌漿持續時間共同影響籽粒重量的形成

灌漿速率與灌漿持續時間共同決定粒重的形成，但不同階段灌漿速率與灌漿持續時間對籽粒形成的貢獻不盡相同。有研究表明灌漿速率對于粒重的貢獻大于灌漿持續時間[2]。而李紹長等[26]的研究發現，同一品種粒重差異由灌漿速率決定，不同品種粒重差異由灌漿持續時間決定。本研究以包含172個家系的RIL群體為試驗材料，進行相關性分析，結果顯示，除緩增期灌漿持續時間外，其他灌漿特性相關性狀對于粒重的增加均存在顯著的正相關關系，與已有研究結果基本相同。

在不同年代玉米品種的更替過程中（尤其在育種歷史時期的前段），伴隨著產量水平的逐步增加，選育品種的生育期也呈現一定的延長趨勢[27]。而本研究結果表明，材料的生理成熟期與籽粒形成的最主要貢獻因素—快增期灌漿持續時間（可解釋生理成熟期表型變異的17.75%，可解釋百粒重表型變異的57.50%）呈現顯著的正相關關系。該結果在一定程度上解釋了玉米前期育種進程中產量增益的生理學基礎，即育種家通過對生理成熟期的間接選擇（晚熟高產品種），相對延長了籽粒灌漿持續時間，從而不斷提高了籽粒產量。

3.3 籽粒灌漿特性與生育期相關性狀的QTL分析

灌漿特性與生育期相關性狀都是多基因控制的數量性狀，較易受環境因素的影響。本研究在單環境下檢測到26個與灌漿特性相關的QTL和14個生育期相關的QTL，在多環境聯合分析中檢測到18個與灌漿特性相關QTL以及6個生育期相關的QTL。不同環境間灌漿速率的遺傳力較高，表型較穩定，而灌漿持續時間的遺傳力較低易受環境因素的影響。聯合環境分析中僅能檢測到灌漿速率與籽粒生長量相關QTL。Liu等[13]在bin 1.05檢測到與授粉后16—23 d灌漿速率相關，bin 4.06、bin 5.02區間內分別檢測到與授粉后32—40 d灌漿速率有關的和，bin 9.04區間內檢測到與授粉后32—40 d灌漿速率相關的以及與授粉后41—46 d灌漿速率相關的，Zhang等[14]在bin 7.03區間內檢測到不同環境和不同灌漿階段均與灌漿速率相關。本研究采用高密度遺傳圖譜在相同或鄰近區間內亦檢測到與灌漿速率以及籽粒生長量相關，且側翼標記區間更小的QTL。

本研究中，在第4染色體跨著絲粒的bin 4.05遺傳區段（48.24 Mb—135.73 Mb）分別檢測到平均灌漿速率、最大灌漿速率、緩增期灌漿速率、快增期灌漿速率以及減緩期灌漿速率相關的多個QTL，且增效等位變異全部來自黃早四。中國玉米骨干親本遺傳基礎研究中發現，玉米骨干親本黃早四的遺傳改良中，該遺傳區段可被84%以上的黃改系所保留[28]。Chen等[29]在玉米染色體bin 4.05區間內發現了控制粒重以及籽粒體積相關QTL，Li等[18]也在bin 4.05區間內發現了控制粒重以及粒寬相關QTL。另外，在第9染色體bin 9.04（110.10 Mb—114.73 Mb）區間內檢測到平均灌漿速率、最大灌漿速率以及快增期灌漿速率相關的QTL，且增效等位變異均來自旅28。Peng等[30]在bin 9.04區間內檢測到籽粒產量相關QTL，Zhang等[31]同樣在該區間檢測到灌漿速率相關位點。可見，該位點通過控制灌漿速率對玉米籽粒的形成同樣具有重要的作用。

在玉米育種中，晚熟品種容易獲得高產[5]。但在一定的光熱條件下，玉米的產量增益，不可能僅僅依靠生育期的無限延長，因此，提高籽粒充實期間的灌漿速率對于高產育種更具現實意義。在此條件下，挖掘與熟期相關QTL相互獨立的灌漿速率相關主效遺傳位點，對提高育種選擇效率意義重大。本研究中檢測到的QTL呈現多個富集區域，但灌漿特性相關位點與生育期相關位點分別定位于不同染色體的不同區域，且增效等位變異分別來自不同的骨干親本，這為不同骨干親本灌漿速率相關優異等位變異的高效聚合提供了重要的信息。而相關位點的深入研究，將對揭示玉米籽粒灌漿特性遺傳調控機制和候選基因挖掘奠定扎實的基礎。

4 結論

以黃早四與旅28構建的RIL群體為試驗材料，利用玉米灌漿特性相關性狀與粒重的回歸分析發現，快增期灌漿持續時間和快增期灌漿速率分別能解釋百粒重表型變異的57.50%和30.00%，是玉米籽粒形成的決定性生理性狀。QTL分析發現，僅能在單環境下檢測到灌漿持續時間相關QTL，經聯合環境分析發現，在第4染色體的bin 4.05及第9染色體的bin 9.04區段內定位了大量的灌漿速率相關QTL，且這些遺傳區段與生育期相關QTL相互獨立。

[1] WANG G, KANG M S, MORENO O. Genetic analyses of grain-filling rate and duration in maize., 1999, 61(3): 211-222.

[2] 秦泰辰, 李增祿. 玉米籽粒發育性狀的遺傳及與產量性狀關系的研究. 作物學報, 1991, 17(3): 185-191.

QIN T C, LI Z L. Studies on the inheritance of the kernel growth characters and their relation to the yield characters in maize (L.)., 1991, 17(3): 185-191. (in Chinese)

[3] BORRáS L, WESTGATE M E. Predicting maize kernel sink capacity early in development., 2006, 95: 223-233.

[4] JOHNSON D R, TANNER J W. Calculation of the rate and duration of grain filling in corn (L.)., 1972, 12(4): 485-486

[5] 王曉慧, 張磊, 劉雙利, 曹玉軍, 魏雯雯, 劉春光, 王永軍, 邊少鋒, 王立春. 不同熟期春玉米品種的籽粒灌漿特性. 中國農業科學, 2014, 47(18): 3557-3565.

WANG X H, ZHANG L, LIU S L, CAO Y J, WEI W W, LIU C G, WANG Y J, BIAN S F, WANG L C. Grain filling characteristics of maize hybrids differing in maturities., 2014, 47(18): 3557-3565. (in Chinese)

[6] 朱慶森, 曹顯祖, 駱亦其. 水稻籽粒灌漿的生長分析. 作物學報, 1988, 14(3): 182-193.

ZHU Q S, CAO X Z, LUO Y Q. Growth analysis on the process of grain filling in rice., 1988, 14(3): 182-193. (in Chinese)

[7] BORRáS L, OTEGUI M E. Maize kernel weight response to post flowering source–sink ratio., 2001, 49: 1816-1822.

[8] DAYNARD T B, TANNER J W, DUNCAN W G. Duration of the grain filling period and its relation to grain yield in corn,L.., 1971, 11(1): 45-48.

[9] YANG W, PENG S, DIONISIO-SESE M L, LAZA R C, VISPERAS R M. Grain filling duration, a crucial determinant of genotypic variation of grain yield in field-grown tropical irrigated rice., 2008, 105: 221-227.

[10] TAKAI T, FUKUTA Y, SHIRAIWA T, HORIE T. Time-related mapping of quantitative trait loci controlling grain-filling in rice (L.)., 2005, 56(418): 2107-2118.

[11] LIU E B, LIU X L, ZENG S Y, ZHAO K M, ZHU C F, LIU Y, BRERIA M C, ZHANG B J, HONG D L. Time-course association mapping of the grain-filling rate in rice (L)., 2015, 10(3): e119959.

[12] WANG R X, HAI L, ZHANG X Y, YOU G X, YAN C S, XIAO S H. QTL mapping for grain filling rate and yield-related traits in RILs of the Chinese winter wheat population Heshangmai×Yu8679., 2009, 118: 313-325.

[13] LIU Z H, JI H Q, CUI Z T, WU X, DUAN L J, FENG X X, TANG J H. QTL detected for grain-filling rate in maize using a RIL population., 2011, 27: 25-36.

[14] ZHANG Z H, LIU Z H, CUI Z T, HU Y M, WANG B, TANG J H. Genetic analysis of grain filling rate using conditional QTL mapping in maize., 2013, 8(2): e56344.

[15] 曾三省, 任蕤, 劉新芝. 黃早四在我國玉米育種和生產中的重要地位. 玉米科學, 1996, 4(1): 1-6.

ZENG S X, REN R, LIU X Z. The important position of Huangzaosi in maize breeding and production in China., 1996, 4(1): 1-6. (in Chinese)

[16] 黎裕, 王天宇. 我國玉米育種種質基礎與骨干親本的形成. 玉米科學, 2010, 18(5): 1-8.

LI Y, WANG T Y. Germplasm base of maize breeding in China and formation of foundation parents., 2010, 18(5): 1-8. (in Chinese)

[17] 陳剛, 陳麗, 高洪敏,景希強, 李思烈. 丹玉自交系的創造及在我國玉米育種和種子生產中的作用. 中國農業科學, 2000, 33(z1): 99-104.

CHEN G, CHEN L, GAO H M, JING X Q, LI S L. Development of Danyu inbred lines and the role they played in maize breeding and production in China., 2000, 33(z1): 99-104. (in Chinese)

[18] LI C H, LI Y X, SUN B C, PENG B, LIU C, LIU Z Z, YANG Z Z, LI Q C, TAN W W, ZHANG Y, WANG D, SHI Y S, SONG Y C, WANG T Y, LI Y. Quantitative trait loci mapping for yield components and kernel-related traits in multiple connected RIL populations in maize., 2013, 193: 303-316.

[19] CROSS H Z. Diallel analysis of duration and rate of grain filling of seven inbred lines of corn., 1975, 15(4): 532-535.

[20] RICHARDS F J. A flexible growth function for empirical use., 1959, 10(2): 290-301.

[21] ELSHIRE R J, GLAUBITZ J C, SUN Q, POLAND J A, KAWAMOTO K, BUCKLER E S, MITCHELL S E. A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species., 2011, 6(5): e19379.

[22] BIAN Y, YANG Q, BALINT-KURTI P J, WISSER R J, HOLLAND J B. Limits on the reproducibility of marker associations with southern leaf blight resistance in the maize nested association mapping population., 2014, 15: 1068.

[23] LI C H, LI Y, BRADBURY P J, WU X, SHI Y S, SONG Y C, ZHANG D F, RODGERS-MELNICK E, BUCKLER E S, ZHANG Z W, LI Y, WANG T Y. Construction of high-quality recombination maps with low-coverage genomic sequencing for joint linkage analysis in maize., 2015, 13: 78.

[24] Li H H, Ye G Y, Wang J K. A modified algorithm for the improvement of composite interval mapping., 2006, 175: 361-374.

[25] 劉萍, 王從亮, 王鳳格, 陸衛平, 郭景倫, 王繼豐, 劉小兵. 糯玉米不同品種的果穗增重與籽粒灌漿特性. 作物學報, 2006, 32(10): 1589-1591.

LIU P, WANG C L, WANG F G, LU W P, GUO J L, WANG J F, LIU X B. Ear growth and grain filling characteristics of different cultivars in waxy maize., 2006, 32(10): 1589-1591. (in Chinese)

[26] 李紹長, 陸嘉惠, 孟寶民, 董志新. 玉米子粒胚乳細胞增殖與庫容充實的關系. 玉米科學, 2000, 8(4): 45-47.

LI S C, LU J H, MENG B M, DONG Z X. The relationship between endosperm cell differentiating and grain filling., 2000, 8(4): 45-47. (in Chinese)

[27] CAVALIERI A J, SMITH O S. Grain filling and field drying of a set of maize hybrids released from 1930 to 1982., 1984, 5(25): 856-860.

[28] WU X, LI Y X, SHI Y S, SONG Y C, WANG T Y, HUANG Y B, LI Y. Fine genetic characterization of elite maize germplasm using high-throughput SNP genotyping., 2014, 127: 621-631.

[29] CHEN L, LI C H, LI Y X, SONG Y C, ZHANG D F, WANG T Y, LI Y, SHI Y S. Quantitative trait loci mapping of yield and related traits using a high-density genetic map of maize., 2016, 36: 134.

[30] PENG B, LI Y X, WANG Y, LIU C, LIU Z Z, TAN W W, ZHANG Y, WANG D, SHI Y S, SUN B C, SONG Y C, WANG T Y, LI Y. QTL analysis for yield components and kernel-related traits in maize across multi-environments., 2011, 122: 1305-1320.

[31] ZHANG J, GUO J J, LIU Y, ZHANG D M, ZHAO Y F, ZHU L Y, HUANG Y Q, ZHANG Z Q, CHEN J T. Genome-wide association study identifies genetic factors for grain filling rate and grain drying rate in maize., 2016, 212(2): 1-12.

（責任編輯 李莉）

Genetic Dissection of Grain Filling Related Traits Based on a High-Density Map in Maize

GAO Xing, LI YongXiang, YANG MingTao, LI BeiBei, LI ChunHui, SONG YanChun, ZHANG DengFeng, WANG TianYu, LI Yu, SHI YunSu

(Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

The grain filling rate and grain filling duration are major determinants of grain yield. Examination of the contributions of growth period and grain filling related traits to kernel weight, and study of quantitative trait loci (QTL) for grain filling rate and duration to dissect the genetic basis of grain filling are helpful to the practice for the breeding of high yield in maize.To identify QTL for grain filling rate and duration, a recombinant inbred line (RIL) population including 172 families was developed from the cross between Huangzaosi (HZS) and Lv28 which are foundation parents used in maize breeding of China. Firstly, the differences between the Logistic and the Richards models for the fitting of maize grain filling process were compared and the parameters of the grain filling were calculated. Secondly, the differences between HZS and Lv28 in grain filling characteristic were compared. Correlation analysis and regression analysis were applied to elucidate the relationship among growth period and grain filling related traits and the contribution to hundred-kernel weight (HKW). Thirdly, the approach of genotyping-by-sequencing (GBS) was used to detect polymorphic SNP markers between the parents and among the RILs. Finally, the inclusive composite interval mapping (ICIM) was used to identify QTL of growth period and grain filling related traits.The genetic map was constructed with 1 471 filtered SNP markers, the total length was 1 471 cM with the average length 1 cM. The grain filling process tended to be a slow-fast-slow pattern and could be divided into three phases: the lag phase, the effective grain filling phase and the maturation drying phase. The use of model fitting of the grain filling process could reflect the dynamic changes of grain filling, but the Richards model and the Logistic model were different in simulating the grain filling dynamic process. The r2measure of predicted values obtained by the Richards model with phenotypic values was higher than that by the Logistic model. The grain filling characteristics showed significant differences between the two parents, since the grain filling rate of HZS was 1.28 times higher than that of Lv28, while the grain filling duration of Lv28 was 1.07 times longer than that of HZS. Correlation analysis showed that the grain filling related traits and HKW reached a significant positive correlation except for the grain filling duration in the lag phase. Regression analysis showed that the grain filling rate and the grain filling duration could explain 57.50% and 30.00% of the phenotypic variation of HKW, respectively. The effective grain filling phase played an important role in the formation of HKW. A total of 26 QTL were detected for grain filling related traits, 3 QTL were detected for HKW and 14 QTL were detected for growth period related traits under the single environment, which were distributed on the chromosomes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 and 10. The LOD values ranged from 3.27 to 9.05, and the range of phenotypic variation explained was 5.97%-21.16%. Under the joint environments, the QTL controlling the grain filling related traits were located at the same or similar positions of chromosomes and formed some QTL clustering regions on bin 1.05, bin 2.03, bin 4.05, bin 4.06, bin 7.04 and bin 9.04. Importantly, some QTL for grain filling rate in different grain filling phases were detected to be clustered on the region of 48.24 cM-135.72 cM on chromosome 4 and the region of 110.10 cM-114.73 cM on chromosome 9.Maize grain filling dynamic process could be simulated well with the Richards model. The grain filling rate and duration of the effective grain filling phase played an important role in the formation of HKW. The inheritance of grain filling related traits were strongly influenced by the environments, so some QTL could be detected only in one environment. Under the joint environments, some QTL related to grain filling rate were detected on bin 4.05 and bin 9.04.

maize (L.); grain filling rate; grain filling duration; QTL

2017-04-05；接受日期：2017-05-08

國家重點研發計劃（2016YFD0100103，2016YFD0100303）、農業部公益性行業（農業）科研專項、作物種質資源保護與利用專項（201303007，2015NWB030-04）、國家科技支撐計劃課題（2013BAD01B02-3）、國際合作項目（2014DFG31860）、中國農業科學院科技創新工程

高星，E-mail：gaoxingcaas@163.com。通信作者李永祥，E-mail：yongxiangli@163.com。通信作者石云素，E-mail：shiyunsu@mail.caas.net.cn