潰瘍性結腸炎患者β-內啡肽表達與免疫功能變化的相關性

劉 琳，劉 麗，張 蕊，趙東強，劉學臣，張 迪

(1.河北醫科大學第二醫院 消化內科，河北 石家莊 050000；2.邯鄲市中心醫院 消化內科，河北 邯鄲 056000)

·論著·

潰瘍性結腸炎患者β-內啡肽表達與免疫功能變化的相關性

劉 琳1，2，劉 麗1，張 蕊1，趙東強1，劉學臣1，張 迪1

(1.河北醫科大學第二醫院 消化內科，河北 石家莊 050000；2.邯鄲市中心醫院 消化內科，河北 邯鄲 056000)

目的探討β-內啡肽(β-EP)對潰瘍性結腸炎(UC)患者免疫機制的調節作用。方法UC患者30例，輕度活動期8例，中度活動期10例，重度活動期12例。同期結腸息肉患者15例為對照組。采用放射免疫法檢測血液中β-EP、白細胞介素1β(IL-1β)的表達水平，同時應用免疫組織化學染色方法檢測結腸黏膜組織中β-EP 、IL-1β的表達水平；采用流式細胞術對血漿中的T細胞亞群 (CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)表達進行檢測。結果病例組血液中β-EP、IL-1β、CD4+、CD4+/CD8+各項指標的表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)；且隨病情嚴重程度不同，其表達水平也有差異，依次為：輕度活動組<中度活動組<重度活動組(P<0.05)。血漿中β-EP分別在活動期和緩解期的變化與IL-1β、CD4+、CD4+/CD8+的變化呈正相關(r=0.522，P<0.01；r=0.532，P<0.05；r=0.964，P<0.01)。結論β-EP通過調節T細胞亞群及IL-1β的分泌參與了UC免疫機制的調節，在一定程度上可以反映UC患者病情的嚴重程度。

結腸炎， 潰瘍性；β內啡肽；白細胞介素1β；T淋巴細胞亞群；免疫調節

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis， UC)是一種病因尚不十分明確的慢性非特異性炎癥性腸道疾病，其特點是病情常反復發作，難以治愈，且有一定的惡變率。其病因學的研究一直是熱點和難點[1]，包括氧化應激[2]、腸道菌群失調[3-4]、細胞凋亡、遺傳、免疫、飲食等方面。目前大部分研究表明免疫調節紊亂是UC發病的中心環節，T細胞亞群及細胞因子失調在UC發病中起著重要的作用。

β-內啡肽(β-endorphin， β-EP)是人體內生成的阿片活性物質， 可通過與免疫細胞表面的阿片受體及非阿片受體結合，介導免疫調節作用，在自身免疫性疾病及腦血管疾病等方面的研究較多，但關于β-EP在UC中的研究目前國內外鮮有報道。

通過檢測UC患者結腸組織及血漿中β-EP的表達，分析UC活動期及緩解期血漿中β-EP的變化與T細胞亞群、白細胞介素1β(IL-1β)變化的相關性，探討β-EP在UC免疫調節中可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2011年3月至2012年2月就診于河北醫科大學第二醫院消化內科門診及病房的UC患者共30例，留取患者處于病情活動期時的外周靜脈血及結腸黏膜活檢組織，并收集病情緩解期的外周靜脈血。其中男14例，女16例，年齡17～59歲，平均年齡38.1歲。入選病例均符合2012年中華醫學會消化病學分會對炎癥性腸病診斷與治療的共識意見中UC的診斷標準[5]。按照Southerland DAI標準分為輕度、中度以及重度活動期，其中包括輕度活動期患者8例，中度活動期患者10例，重度活動期患者12例。另外，選取同時期結腸息肉患者15例作為對照組，留取其外周靜脈血及正常結腸黏膜組織。其中男7例，女8例，年齡21～62歲，平均年齡40.1歲，對照組血常規、生化全項、結腸鏡、病理學等檢查均無明顯異常，并排除糖尿病、心腦血管疾病、惡性腫瘤及已經確診的自身免疫性疾病等。各組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1主要試劑 人β-EP放免試劑盒購自第二軍醫大學神經生物學教研室；人碘[125]IL-1β放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所；熒光標記單克隆抗體和溶血素購自美國Beckman Coulter公司；鼠抗人β-EP單克隆抗體和鼠抗人IL-1β單克隆抗體購自武漢博士得生物工程有限公司。

1.2.2放射免疫分析測定血液中β-EP和IL-1β的表達 晨起空腹條件下取肘靜脈血4 ml，β-EP采血管中加入0.3 M EDTA-Na2溶液40 μl、抑肽酶30 μl，IL-1β采血管中加入EDTA-K2溶液輕緩混勻， 迅速低溫離心機離心(3 000 r/min，10分鐘)，取血漿，于-80 ℃冰箱保存。測定時在室溫下自溶。試管編號；加樣，IL-1β依照平衡飽和操作，β-EP依照順序飽和加樣程序加樣；孵育24小時；分離劑分離，棄上清；γ-放射免疫計數器上測量每管沉淀的cpm值。

1.2.3免疫組織化學法測定結腸黏膜組織中β-EP和IL-1β的表達 由內鏡醫師行電子結腸鏡檢查及黏膜活檢，于UC和對照組患者直腸和乙狀結腸交界處，取活檢組織2塊，置入4%的多聚甲醛溶液固定24小時；常規石蠟包埋連續切片。一塊組織行HE染色，另一塊組織行免疫組織化學染色：滴加山羊血清封閉液；滴加一抗 (稀釋1∶100)， 4 ℃過夜；滴加生物素標記二抗 (羊抗鼠)；滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液；DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.4流式細胞術測定血漿中T細胞亞群的水平 清晨空腹取肘靜脈血1 ml，EDTA-K2抗凝，室溫下不超過18小時檢測。取流式專用試管1支，分別加入5 μl CD3-PC5、10 μl CD4-FITC、10 μl CD8-PE，立刻加抗凝血50 μl；后加入溶血素及PBS混勻，離心(1 500 r/min，5分鐘)，棄上清，留細胞沉淀；上機分析，采用CellQuest軟件進行上樣，由軟件自動統計出所需結果。

2 結 果

2.1血液中各細胞因子水平的表達

2.1.1血液中β-EP、IL-1β的表達水平 UC患者活動期與緩解期患者血液中β-EP、IL-1β的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)；且活動期β-EP、IL-1β的表達水平為：重度活動組>中度活動組>輕度活動組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

2.1.2血液中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表達水平 UC患者活動期與緩解期患者血液中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表達水平均較正常對照組明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；且活動期CD4+、CD4+/CD8+的表達水平為：輕度活動組<中度活動組<重度活動組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，2。

表1 血液中UC活動期、緩解期與對照組各細胞因子表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05； 與UC緩解期比較，#P<0.05

表2 UC各組與對照組血液中各細胞因子表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度活動組比較，#P<0.05；與中度活動組比較，△P<0.05

2.2結腸組織中細胞因子的表達

2.2.1光學顯微鏡下表現 對照組結腸黏膜上皮完整，固有層內可見少量炎性細胞浸潤，腺體排列整齊；UC各組結腸黏膜鏡下表現為彌漫性炎癥，固有層內可見大量炎性細胞浸潤，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、單核細胞等，并且隱窩結構紊亂，部分破壞，隱窩內及隱窩上皮均可見大量中性粒細胞等炎性細胞浸潤，并可見潘氏細胞化生。見圖1。

圖1 各組結腸黏膜組織HE染色(×200) a.對照組；b.輕度活動組；c.中度活動組；d.重度活動組

2.2.2免疫組織化學染色結果 在對照組結腸黏膜中，β-EP及IL-1β主要表達在黏膜的上皮細胞及腺上皮細胞，胞漿呈棕黃色; UC結腸黏膜中可見大量炎性細胞浸潤，伴有不同程度的隱窩結構破壞，β-EP及IL-1β在UC患者結腸黏膜組織中也主要表達在上皮細胞及腺上皮細胞，陽性細胞要比正常結腸黏膜組織染色深，且陽性細胞的數目明顯增多。見圖2，3。

圖2 UC患者結腸黏膜β-EP免疫組織化學染色(×400) a.對照組；b.輕度活動組；c.中度活動組；d.重度活動組

圖3 UC患者結腸黏膜IL-1β免疫組織化學染色(×400) a.對照組；b.輕度活動組；c.中度活動組；d.重度活動組

2.2.3結腸黏膜組織中β-EP、IL-1β的表達水平 UC結腸黏膜組織中β-EP、IL-1β的表達明顯高于對照組(P<0.05)；各組β-EP和IL-1β表達水平均依次為：輕度活動組<中度活動組<重度活動組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 UC各組與對照組結腸黏膜組織中β-EP、IL-1β表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度活動組比較，#P<0.05；與中度活動組比較，△P<0.05

2.3相關性分析 血漿中β-EP在UC活動期與緩解期的變化與CD4+的變化呈正相關(y=0.0365x-11.056，r=0.532，P=0.032)；與CD4+/CD8+的變化呈正相關(y=0.0891x-0.3226，r=0.964，P=0.000)；與IL-1β的變化呈正相關(y=0.0055x-0.0453，r=0.522，P=0.003)。

3 討 論

UC是一種病因以及發病機制尚不完全明確的慢性炎癥性腸病，其內鏡下特點為病變呈連續性、彌漫性分布，絕大多數起病于直腸，逆行向近段結腸進展，嚴重者甚至累及全結腸以及末端回腸。臨床特點為慢性反復發作性，常累及全身多個系統和器官，如眼部病變及皮膚受損[6]。目前國內外尚沒有針對UC的根治性治療措施。UC的發病機制一直都是研究焦點與熱點，主要集中在免疫[7]、遺傳、氧化應激[8-9]等方面。

研究發現UC患者中其他免疫相關性疾病的發生率也是上升的[10]，如類風濕性關節炎、銀屑病、強直性脊柱炎等[11]。自身免疫性胰腺炎較其他原因引起的胰腺炎患者UC的發病率要高[12-13]。有研究表明，由結腸黏膜免疫系統的異常反應所導致的急慢性炎癥反應在UC的發生、發展及轉歸過程中起著重要作用，有可能是由于抗原的持續刺激或(及)免疫調節紊亂，免疫反應表現出過度亢進和(或)難以自限性。研究發現免疫抑制藥物在治療UC方面有很好的效果，進一步說明了UC的發生發展與免疫反應失調、活躍有關[14]。T淋巴細胞作為免疫反應環節中抗原遞呈的核心，同時又是非常重要的免疫調節劑之一。另外，血管內皮細胞、上皮細胞等腸道非免疫細胞也都參與了免疫炎癥反應。在UC發病中T細胞功能異常起著非常重要的作用[15-16]。有研究結果顯示CD4+T細胞介導的組織損傷與UC的免疫異常或紊亂有一定的相關性[17]。本研究結果表明UC患者中存在著CD4+T細胞的異常活化，CD4+T、CD4+/CD8+參與了UC的發病過程，在一定程度上反映疾病的嚴重程度。腸黏膜中的CD4+T細胞異常活化，可激活巨噬細胞等效應細胞，釋放IL-1β、IL-6、IL-13等促炎細胞因子，使T淋巴細胞在受損腸黏膜和固有層內大量集聚，兩者共同作用使T淋巴細胞凋亡抵抗增加，腸道黏膜穩態削弱，進一步導致炎癥細胞和炎癥遞質異常，引起腸黏膜的損傷，成為UC發病過程中的中心環節。

IL-1β作為誘導UC腸道炎癥反應極其重要的細胞因子之一，大量試驗研究和臨床研究均表明了IL-1β的升高與UC的發生發展有著密不可分的關系[17]。本試驗結果證實了UC中確實存在著IL-1β等促炎細胞因子增多、免疫調節紊亂，這種異常不僅僅存在于結腸黏膜組織中，同時也存在于血漿中，其免疫紊亂程度與疾病嚴重程度相關，可以在一定程度上反映病情的嚴重程度。

β-EP是阿片類激素中最具活性和功能的代表，與類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病有關[18]。β-EP在UC中的表達及作用，目前國內外研究結果尚不十分明確。僅姬培震等[19]，周天宇等[20]報道UC大鼠模型中β-EP水平較正常組明顯升高。本研究結果對外周血的檢測與之相符，且更進一步發現β-EP在UC患者中的表達水平隨著病情嚴重程度的加重而進一步的升高。其可能的機制是，在UC活動期，機體的免疫功能亢進，CD4+、CD4+/CD8+表達較對照組明顯升高；免疫調節紊亂，促使促炎細胞因子分泌增多，IL-1β較對照組明顯升高。機體受到亢進的免疫系統進一步損傷，為了維持機體的免疫平衡狀態，機體代償性分泌β-EP介導對免疫功能的負向調節，下調分泌增多的促炎性細胞因子及免疫介質，抵抗其對機體的免疫損傷，因此β-EP在UC活動期患者中的表達上調，且隨著病情炎癥程度的加重逐漸升高。組織中β-EP的表達水平反映了結腸組織受到免疫損傷的程度。而血漿中β-EP的表達可能是機體對抗免疫亢進、免疫紊亂的防御反應，反映了全身炎癥反應程度、免疫損傷的程度和調節免疫的能力。

為了進一步評價β-EP對UC免疫功能的影響，本研究發現β-EP變化與CD4+、CD4+/CD8+、IL-1β的變化在一定程度上呈正相關。這表明β-EP在UC的發生、發展過程中，發揮了一定的免疫抑制作用，其原因可能是通過影響CD4+、CD4+/CD8+、IL-1β來參與免疫反應調節。但是，β-EP進行細胞免疫功能的抑制性調節的分子學機制，以及它在這種抑制性調節中起多大作用需進一步研究證明。

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β-endorphinexpressionandimmunefunctioninpatientswithulcerativecolitis

Liu Lin1，2， Liu Li1， Zhang Rui1， Zhao Dongqiang1， Liu Xuechen1， Zhang Di1

1.DepartmentofGastroenterology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China；2.DepartmentofGastroenterology，HandanCentralHospital，Handan056000，China

LiuLi，Email：loraliu@163.com

ObjectiveTo explore the immune mechanism of β-endorphin(β-EP) in ulcerative colitis(UC) patients.MethodsThirty UC patients were enrolled， including mild activity 8 cases， moderate activty 10 cases and severe activity 12 cases. In the same period，15 patients with colon polyps served as control group. Blood β-EP and interleukin-1β(IL-1β) were measured by radioimmunoassay. After peripheral blood lymphocyte separation， CD3+T cells， CD4+T cells and CD4+/CD8+T cells percentage were detected by flow cytometry. β-EP and IL-1β in colon mucosa were measured by immunohistochemistry.ResultsPlasma expressions of β-EP， IL-1β， CD4+T cells， CD4+/CD8+T cells percentage in patients with UC were significantly higher than those of control group (P<0.05). And the expressions showed significant difference with the disease severity: patients with mild UC

colitis， ulcerative; beta-endorphin; interleukin-1beta; T-lymphocyte subsets; immunomodulation

劉麗， Email：loraliu@163.com

R574.62

A

1004-583X(2017)11-0969-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.013

2017-09-28 編輯:張衛國