一種基于磁性石墨烯的紙基電化學發(fā)光夾心免疫分析方法

陳鈺+王捷+劉仲明

摘 要 基于電化學發(fā)光及磁懸浮免疫分析策略，結(jié)合磁性石墨烯獨特的物理化學特性以及紙基電極價格低廉、樣品用量少的優(yōu)勢，建立了一種新型免疫分析方法。以人免疫球蛋白 G（IgG）為分析物，采用1乙基3（3二甲基氨丙基）碳化二亞胺/N羥基硫代琥珀酰亞胺（EDC/NHS）法將一抗（Ab1，捕獲抗體）固定在磁性石墨烯上，通過直接標記法進行二抗（Ab2，信號抗體）的電化學發(fā)光試劑標記，采用磁懸浮夾心免疫技術(shù)最大程度減少非特異性吸附，通過紙基電化學發(fā)光檢測技術(shù)測定目標物的濃度。考察了捕獲抗體及信號抗體的固定（標記）效果，發(fā)現(xiàn)采用的磁性石墨烯不僅提高了免疫物質(zhì)的負載量，還可以促進電子傳遞，構(gòu)建的磁懸浮紙基電化學發(fā)光夾心免疫分析法的電化學發(fā)光響應峰面積在0.32～1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，與 IgG濃度對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，檢出限為6.4 pg/mL。本方法可實現(xiàn)IgG的定量檢測，在低成本、快速免疫檢測領(lǐng)域有一定的應用前景。

1 引 言

電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）將電化學、光譜學和免疫學緊密結(jié)合，具有電化學電位的可控性、發(fā)光分析的高靈敏度及免疫反應的特異性，在醫(yī)療診斷具有良好的應用前景[1]。磁懸浮免疫分析（MSIA）不僅保持了懸浮分析的所有優(yōu)點，利用磁性免疫復合物在近似均相的條件下實現(xiàn)快速的免疫反應，還可在外加磁場作用下高效分離免疫復合物與游離蛋白，已應用于臨床免疫學檢驗中[2]。

目前已有商品化的ECLIA儀器，如羅氏系列ECLIA系統(tǒng)，可進行多種臨床樣品的定量檢測，檢測下限可達pmol/mL，線性范圍最大超過7個數(shù)量級。但是這些管道式儀器存在樣品用量大、反應池需定期清洗、儀器價格和配套診斷試劑價格昂貴等不足之處。可拋式傳感器件由于一次性使用的特點，可以避免以上管道式傳感器件存在的問題。2007 年首次提出的紙基微流控芯片[3]是當前制作可拋式傳感器件的重要方案之一，研究者基于紙芯片進行了ECL檢測[4～9]，但要實現(xiàn)在實際檢測中的廣泛應用，還需解決紙芯片的加工和修飾、紙芯片流體控制、ECLIA 檢測靈敏度以及穩(wěn)定性問題。目前文獻報道的疏水材料尚不能解決阻擋低表面張力的樣品滲透或者成本過高的問題； 以毛細作用驅(qū)動紙芯片流體運輸?shù)姆绞匠Ｔ斐蓸悠吩诹鲃舆^程中揮發(fā)，無法滿足復雜樣品的多步預處理與反應、多組分同時檢測等要求。目前報道的紙基電化學發(fā)光檢測方法在靈敏度、穩(wěn)定性方面尚達不到商品化高精密儀器的水平。

磁性納米材料由于兼具納米材料的特性和磁響應性，作為分離/固定生化物質(zhì)的理想載體，廣泛應用于分離/富集、免疫分析等領(lǐng)域[10～18]。可通過物理[19]或化學[18，20，21]方法對不同類型的磁性納米材料進行表面功能化，進而固定抗體或抗原獲得磁性免疫復合物，建立磁高效分離[18～20，22]或可以反復再生[18]的免疫分析方法。

本研究選擇一種更為簡便的方式——紙基電極，即在印刷電極上，緊密覆蓋與電極區(qū)域大小相等的紙片，由于免疫過程與檢測過程的分離，構(gòu)建的紙基電極無需復雜的幾何通道和疏水界面，少量體積的分析物即可通過毛細作用迅速運輸至電極表面，結(jié)合磁性石墨烯獨特的理化性質(zhì)，以人IgG為模型分析物，最終建立一種簡便、靈敏、低成本可拋式紙基電化學發(fā)光檢測新方法（見圖1），為避免管道式分析儀器樣品用量大、成本高等問題提供一種新策略。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

紙芯片電化學發(fā)光測試儀由本實驗室與西安新啟特儀器儀表有限公司聯(lián)合研制，結(jié)構(gòu)見圖2：光電倍增管（PMT）接收窗直徑10 mm，紙基工作電極位于接收窗中心，兩者間距3 mm； 紙基電極的觸點和電路的導線采用彈性連接； 電路中取樣電阻、分壓電阻等關(guān)鍵器件采用溫度控制。紙基電極（Paperbased SPE），由直徑為6 mm 1#濾紙片（英國Whatman公司）緊壓于TE100印刷碳電極（SPE，三電極體系，臺灣禪譜公司）電極區(qū)域制成。15 mL磁分離架、8孔磁分離架（德國Millipore公司）； PalmSens3便攜式恒電位儀（荷蘭Plamsensor公司）； Multiskan GO 全波長酶標儀（芬蘭Thermo Fisher Scientific公司）； BRUKERAXS 轉(zhuǎn)靶X射線粉末衍射（瑞士BRUKER 公司）； Gemini SEM場發(fā)射掃描電子顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）； Zeba脫鹽離心柱（美國Thermo Scientific公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 磁性石墨烯固定一抗 稱取2.5 mg 磁性石墨烯于5 mL水中，超聲分散，再加入5 mL 0.02 mol/L MES緩沖液（pH 5.5）混勻，分別加入90 mg EDC、100 mg NHS充分溶解，150 r/min下振蕩25 min，磁分離，水洗3次。量取50 μL 1 mg/mL Ab1， 用10 mL 0.02 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.3）稀釋，加入活化好的磁性石墨烯中，37℃ 150 r/min 振蕩孵育2 h。磁分離，超純水洗滌3次，分散于10 mL抗體稀釋液（含1% BSA的0.01 mol/L PBS，pH 7.4）中，4℃保存，待用。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定捕獲抗體反應性 取5 mg 磁性石墨烯分散于10 mL 抗體稀釋液中， 37℃振蕩混勻2 h，備用； 分別取500 μL磁性石墨烯、磁性石墨烯固定的Ab1分散液，加入200 μL 1000倍稀釋的HRP標記的兔抗羊IgG， 37℃振蕩混勻2 h； 磁分離，LIVZON洗液洗滌5次，每次8 min； 加入200 μL 1∶1配制的顯色底物A&B，顯色10 min； 取100 μL顯色后液體于ELISA板中，加入50 μL 2 mol/L H2SO4 終止反應， 450 nm波長下測定吸光值。endprint

2.2.3 酯化釕標記二抗 參考文獻[23]方法并略有改進。取100 μL 1 mg/mL Ab2加入2 mL 0.1 mol/L PBS （pH 8.5）中，加入100倍摩爾比的9.8 mmol/L酯化釕（溶于DMF），常溫150 r/min振蕩孵育2 h。使用Zeba脫鹽柱去除游離酯化釕，2280 r/min離心2 min，收集酯化釕標記的Ab2。

2.2.4 免疫檢測 磁性石墨烯固定Ab1、不同濃度抗原、酯化釕標記的Ab2各取50 μL，37℃150 r/min振蕩孵育30 min； 磁分離，超純水洗滌3次，分散于5 μL 80 mmol/L N丁基二乙醇胺（0.1 mol/L PBS，pH 8.5）共反應物中，備用。移取上述混合液滴加至紙基電極上，在0.2～1.5 V范圍內(nèi)以0.1 V/s的速率進行循環(huán)伏安掃描，在PMT 1000 V下檢測電化學發(fā)光響應。

3 結(jié)果與討論

3.1 一抗的固定與表征

磁性石墨烯的X射線衍射（XRD）圖譜如圖3A所示，在30.1°（220） 、35.4°（311）、 43.02°（400）、53.4°（422）、57°（511）和62.6°（440）處可見尖銳的強峰，對應Fe3O4的fcc立方結(jié)構(gòu)，將（311）位置處Bragg反射峰寬代入Scherrer公式[24]，估算出顆粒粒徑尺寸為40 nm。此磁性石墨烯可形成近似均相的懸浮溶液（見圖3B），在磁場的作用下可以迅速聚集（圖3C）。

處存在蛋白質(zhì)酰胺Ⅲ帶NH面內(nèi)變形振動，說明Ab1與磁性石墨烯通過酰胺化反應成功偶聯(lián)。磁性石墨烯的SEM圖像（圖5Ba）呈現(xiàn)由隨機皺縮的多層薄片相互緊密結(jié)合形成無序的固體表面，這種表面為負載Ab1提供了高比表面積； 當磁性石墨烯固定Ab1后， 表面（圖5Bb）表現(xiàn)出更為粗糙的結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)有利于接近免疫復合物。采用ELISA考察固定后Ab1的反應性，結(jié)果顯示， 固定組的吸光度顯著高于未固定組（圖5C），間接證明了磁性石墨烯表面有Ab1存在。

3.2 二抗的標記與表征

使用紫外可見吸收光譜考察Ab2的電化學發(fā)光標記效果，由圖6可見，酯化釕分別在245 nm（金屬到配體電荷轉(zhuǎn)移（d →π*））、282 nm（配體內(nèi)的電荷躍遷（π→ π*））[25]、456 nm（自旋允許的金屬到配體電荷轉(zhuǎn)移（d→π*））[13]處有特征吸收峰； Ab2分別在204 nm（肽鍵）及280 nm（共軛雙鍵）處有特征吸收峰。Ab2通過酰胺鍵與酯化釕共價結(jié)合形成釕標抗體（RuAb2）復合物，在455 nm處出現(xiàn)的吸收峰證明了釕復合物與Ab2結(jié)合。

3.3 紙基電極電化學發(fā)光傳感器的響應特性

采用磁性石墨烯修飾電極，不僅可以通過磁分離將非特異性吸附影響降至最低，而且其高的電子傳遞性能，使其具有更快的生物反應動力學，30 s內(nèi)即可獲得較高信噪比的響應曲線。此外，本方法試劑和樣本用量少（150 μL/次），檢測成本低； 紙基電極所需檢測體積小，5 μL 磁性免疫復合物重懸液即可滿足分析需求。

3.3.1 線性范圍和檢出限 對人IgG抗原進行梯度稀釋，考察構(gòu)建的紙基電極電化學發(fā)光傳感器的響應特性（圖7）。在最優(yōu)的檢測條件下，傳感器的電化學發(fā)光強度隨IgG濃度的增加而增大，且電化學發(fā)光響應峰面積在0.32～1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，與IgG濃度對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，檢出限為6.4 pg/mL（S/N>3），所構(gòu)建的分析方法可用于人IgG定量檢測，具有較高的靈敏度。

3.3.2 選擇性和重復性 在優(yōu)化的條件下檢測BSA、人IgA、AFP和人IgG的電化學發(fā)光響應情況，考察所構(gòu)建方法的特異性。如圖8所示，3種干擾物質(zhì)的電化學發(fā)光強度遠低于IgG的電化學發(fā)光強度，說明BSA、人IgA、AFP基本不干擾對人IgG的檢測，

4 結(jié) 論

本研究在ECLIA及MSIA的基礎上，利用電化學發(fā)光靈敏度高、動態(tài)范圍寬、抗干擾能力強的特性，利用免疫磁性顆粒使免疫反應在近均相的條件下實現(xiàn)快速的反應動力學，通過外加磁場快速高效地分離游離蛋白和免疫復合物； 利用磁性石墨烯的高效負載能力和信號傳遞性能，進一步提高分析靈敏度，縮短檢測時間； 利用可拋式紙基電極，簡化了操作步驟，減少了試劑（樣品）用量，降低檢測成本，最終構(gòu)建的基于磁性石墨烯的紙基電化學發(fā)光夾心免疫分析方法具有較寬的線性范圍，較高的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性，可實現(xiàn)IgG的定量檢測，在低成本、快速免疫檢測領(lǐng)域有一定的應用前景。endprint