基于雙重猝滅原理的分子信標定量檢測凝血酶

翟琨+李奉權+史伯安+向東山

摘 要 利用G堿基和有機猝滅基團對熒光基團的雙重猝滅作用構建了分子信標，建立了一種基于雙重猝滅原理的檢測凝血酶的簡單方法。此分子信標中熒光基團設計為羧基熒光素（FAM），有機猝滅基團設計為Black Hole Quencher 1 （BHQ1），BHQ1連接3個含有G堿基的核苷酸，分子信標的環設計為凝血酶的核酸適配體。體系中沒有凝血酶時，分子信標呈莖環結構，熒光基團FAM與有機猝滅基團BHQ1及G堿基相互靠近，FAM的熒光在BHQ1及G堿基的雙重猝滅下，其熒光信號很弱； 當體系中有凝血酶存在時，分子信標與凝血酶特異性結合，形成G四聯體結構，莖環結構被破壞，FAM遠離猝滅基團BHQ1及G堿基，其熒光得到恢復。在最適條件下，體系的熒光強度（ΔI）與凝血酶的濃度（C）在0.4～40 nmol/L范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為ΔI=24.63C （nmol/L）+13.06 （R2=0.9972），檢出限為0.18 nmol/L （3σ， n=9）。實際血樣加標回收率為96.3%～98.7%。

1 引 言

凝血酶（Thrombin，TB）是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白酶，在人體凝血過程中發揮了重要作用[1，2]。適配體是通過指數富集的配體系統進化技術，經體外篩選得到的能與蛋白質或小分子的特定區域相結合的寡聚核苷酸片段（DNA或RNA），可以特異性地識別相應的靶分子[3～8]。迄今，已篩選到的凝血酶核酸適配體序列有兩個，一個是由 15個堿基構成的能識別凝血酶的肝素結合位點的適配體，另一個是由29個堿基構成的能識別凝血酶血纖維蛋白結合位點的適配體[9，10]。目前，這兩種凝血酶核酸適配體都已被廣泛用于凝血酶的檢測[11～14]。

分子信標是一種可形成發夾結構的莖環雙標記的寡核苷酸探針，具有選擇性好、檢測速度快以及無需與未反應的探針分離即可實時檢測等特點，廣泛應用于核酸檢測分析[15～17]。目前分子信標在凝血酶的檢測中已有應用，但使用的多為傳統的分子信標，熒光背景較高，影響了定量分析的靈敏度[18，19]。

本研究基于鳥嘌呤（G堿基）對FAM具有較好的猝滅作用[20，21]的原理，利用G堿基和有機猝滅基團對FAM的雙重猝滅作用，設計了一種結構簡單、合成容易的具有雙重猝滅作用的分子信標，穩定性好， 熒光背景信號低， 與凝血酶反應速度快，基于此建立了快速定量檢測凝血酶的新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與及試劑

RF5301PC熒光光譜儀（日本Shimadzu公司）； 凝血酶（上海麥克林生化科技有限公司（中國））； 牛血清蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、牛血紅蛋白（HB），購于上海邦景實業有限公司； 其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司； 實驗所用緩沖溶液為0.1 mol/L TrisHCl 緩沖溶液； 所有的分子信標均由上海生工生物技術有限公司（中國）合成，其序列如表1所示。

2.2 樣品制備及檢測

將分子信標及凝血酶分別用0.1 mol/L TrisHCl （pH 8.0）緩沖溶液配制成400 nmol/L儲備液，并分別稀釋成不同濃度的溶液，備用。取50 μL凝血酶溶液加入到50 μL的分子信標溶液中，混合均勻，補加TrisHCl緩沖溶液至500 μL，室溫下反應30 min，檢測熒光信號。本研究采用同步熒光分析法，因為FAM的最大激發波長與最大發射波長之差（斯托克斯位移）為26 nm，因此實驗中同步掃描的波長間隔（Δλ）設置為26 nm，熒光分光光度計的激發及發射狹縫寬度均設置為10 nm。

2.3 選擇性實驗

在4份50 μL 400 nmol/L凝血酶溶液中，分別加入50 μL蒸餾水、50 μL 濃度為4×10

Symbolm@@ 4 mol/L的牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、牛血紅蛋白（HB）溶液，再分別加入50 μL 400 nmol/L分子信標溶液，最后加入TrisHCl緩沖溶液至500 μL，混合均勻，常溫下反應30 min后，進行熒光檢測。

3 結果與討論

3.1 檢測原理

利用雙重猝滅分子信標檢測凝血酶的原理如圖1所示。體系中沒有凝血酶存在時，分子信標呈莖環結構，熒光基團FAM與猝滅基團BHQ1及G堿基相互靠近，FAM的熒光在BHQ1及G的雙重猝滅下，其熒光信號很弱； 體系中存在凝血酶時，分子信標的環即凝血酶的適配子序列與凝血酶特異性結合形成G四聯體結構，莖環結構被破壞，FAM熒光基團遠離猝滅基團BHQ1及G堿基，熒光得到恢復。凝血酶濃度越高，與其結合的分子信標越多，即更多的環被打開，因此體系的熒光信號越強，通過FAM熒光信號增強的程度可實現對凝血酶的定量檢測。

3.2 雙重猝滅分子信標的構建

本研究中，凝血酶的檢測是基于有機猝滅基團和G堿基對熒光基團的雙重猝滅作用。選擇能被G堿基猝滅的有機染料FAM 作為分子信標的熒光基團， BHQ1作為分子信標的猝滅基團，因為BHQ1的最大吸收波長為535 nm，FAM的最大發射波長為525 nm，因此在BHQ1與FAM相互靠近時，FAM的熒光能被BHQ1很好地猝滅。另外，與BHQ1相連接的G堿基數目越多，猝滅的效果越好[22]。本研究設計了G堿基數目分別為3個、2個、1個及沒有G堿基的4種分子信標（即MB1、MB2、MB3、MB4），并與沒有猝滅基團的分子信標（MB6）的猝滅效果進行比較（圖2）。結果表明，隨著G堿基數目的增加，分子信標的背景熒光逐漸降低，但降低的程度逐漸減小。這主要是因為增加的G堿基與熒光基團的距離逐漸增加的緣故。因此，選擇MB1對凝血酶進行檢測。

圖2 分子信標莖的不同G堿基數目對猝滅效果的影響（a→e： MB1，MB2，MB3，MB4，MB6），各分子信標的濃度均為32 nmol/Lendprint

Fig.2 Effect of the number of G base in the stem of MB on quenching effect （a→e： MB1， MB2， MB3， MB4， MB6）. Concentration of each MBs is 32 nmol/L， respectively

3.3 雙重猝滅分子信標性能評價

對不同猝滅基團猝滅FAM的效果進行考察（圖3）。結果表明，當分子信標中既沒有G堿基也沒有猝滅基團（MB6）時，體系具有較強的熒光信號（圖3d）； 當分子信標中只有有機猝滅基團（MB4）或只有G堿基（MB5）時，分子信標的熒光信號顯著減弱（圖3b， 3c），說明有機猝滅基團BHQ1和G堿基對FAM都具有很好的猝滅作用； 當分子信標中既有G堿基， 又有有機猝基團BHQ1（MB1）時，分子信標的熒光信號變得非常微弱（圖3a），說明G堿基和有機猝基團BHQ1對FAM的雙重猝滅效果更好。根據計算，經典分子信標（MB4）的猝滅效率為90.3%，信背比（沒有猝滅基團的分子信標所產生的信號與有猝滅基團的分子信標所產生的信號之比）為10.3； 雙重猝滅分子信標的猝滅效率為97.5%，信背比為39.8。因此，基于雙重猝滅的分子信標的熒光背景遠低于經典分子信標。

3.4 工作曲線及檢出限

考察了凝血酶的濃度與相應的體系熒光強度之間的關系，圖4為不同濃度的凝血酶所對應的同步熒光光譜圖。在0.4～ 40.0 nmol/L范圍內，體系的熒光強度（ΔI）與凝血酶的濃度（C）具有良好的線性關系（圖4插圖），線性回歸方程為ΔI= 24.63 C （nmo/L）+13.06 （R2=0.9972），檢出限為0.18 nmol/L（3σ， n=9）。對3.0 nmol/L凝血酶重復測定9次，響應值的相對標準偏差（RSD）為 3.7%，說明此方法精密度良好。

3.5 選擇性

對建立的檢測方法的特異性進行了考察（圖5）。結果表明， 40 nmol/L凝血酶溶液中加入40.0 μmol/L的BSA、OVA及HB后，各體系的熒光強度幾乎無變化，說明這幾種干擾蛋白的存在對凝血酶的檢測沒有明顯影響，表明此分析方法具有良好的選擇性。

與文獻報道的利用適配體或熒光方法檢測凝血酶方法相比（表2），本方法檢出限更低。

3.6 血清樣品的加標回收實驗

取人血清樣品，離心后稀釋500倍； 取2份稀釋后的血清樣品，分別加入不同濃度水平的凝血酶，利用本方法進行檢測（表3）。兩個加標水平的回收率為96.3%和98.7%，說明本方法具有較高的準確性。

4 結 論

利用G堿基和有機猝滅基團對熒光基團的雙猝滅作用構建了一種結構簡單的基于雙重猝滅原理的分子信標，并建立了一種檢測凝血酶的簡單方法，獲得了更低的檢出限（0.18 nmol/L）。endprint