碳點熒光探針的制備及其在食品分析中的應用

葉松齡+黃佳佳+羅林+傅慧君+孫遠明+沈玉棟+雷紅濤+徐振林

摘 要 碳點作為一種新型熒光碳納米材料，具有優良的光學性能和小尺寸特性，以及良好的生物相容性、低毒性以及易于實現表面功能化等特點，是潛在的可以代替傳統半導體量子點等熒光探針的良好選擇。基于其獨特的熒光特性和高靈敏度，碳點熒光探針在食品分析領域具有很好的應用潛力。本文對近年來熒光碳點的研究進展進行了綜述，簡述碳點的性能并對碳點的制備方法進行總結對比，重點介紹了碳點熒光探針在食品分析領域的應用，對目前碳點應用的限制進行了分析， 對其發展前景和展望。

1 引 言

熒光碳點（Carbon dots， CDs）是一種粒徑小于10 nm且近似球型的零維熒光碳納米粒子。碳點的首次發現是2004年Xu等[1]對電弧放電法產生的煙灰中的單壁碳納米管進行分離純化時的意外收獲，在用凝膠電泳法處理單壁碳納米管的懸浮液時發現，分子量不同的3組熒光納米粒子，在紫外燈照射下分別發出藍綠色、黃色和橘紅色的熒光。經過后續一系列研究， 2006年Sun等[2]采用激光刻蝕的方法獲得熒光性能較好的碳納米粒子，并首次將其稱為碳點。與傳統半導體量子點相比，碳點不僅具有可與之媲美的熒光性能，且本身并不含有任何有毒重金屬元素，具有低毒性和良好的生物相容性，易于實現表面功能化，因此一經發現便引起研究者的廣泛研究興趣。對碳點的研究重點集中在碳點的制備和應用兩個方面，且更多是研究其在生物成像[3～5]、生化分析檢測[6～8]和光電催化[9，10]等領域的應用，在食品分析檢測領域方面的應用研究并不多，而實際上碳點作為熒光探針在食品分析檢測中具有非常大的應用潛力。本文對碳點的制備及其在食品分析檢測領域的應用進行了系統的綜述，并對目前碳點應用的限制和發展進行了分析和展望。

2 碳點及其性能

碳點通常為球體或近球體結構，是一個三維團簇結構，其三個維度尺寸均在納米尺度[11]，可以通過控制合成碳點的反應溫度[12]、反應時間[13]等因素得到不同粒徑大小的碳點，但這一形成機制目前并不明確[14]。碳點表面一般存在大量的親水性官能團如羥基、羰基等，可穩定分散于水溶液中，更有利于表面修飾。由于獨特的結構，與傳統的半導體量子點相比，碳點具有獨特的性能：（1）目前合成的熒光碳點大多在紫外區有強烈的光吸收，還可延伸至可見光區，一般位于270～320 nm處； （2）碳點具有寬而連續的激發光譜，與傳統量子點一樣，在單色光源激發下可以得到不同發射波長的熒光，即“一元激發多元發射”[2]，這為實現生物分子的多組分同時檢測提供了可能[15，16]； （3）熒光穩定性高且耐光漂白，即使在持續激發光照射幾個小時后其熒光強度也幾乎沒有降低[17]； （4）熒光強度可調性，可根據溶液pH值的變化而變化，且不同條件合成的碳點對pH響應也不同[18～20]； （5）具有光電荷轉移特性，可作為優良的電子供體和電子受體[21， 22]； （6）部分碳點具有上轉換發光（UCPL）性質，即在較長激發光的激發下，碳點發出較短波長熒光的現象[23， 24]，如Shen等[25]報道中的經PEG鈍化后的碳點，在激發波長為600～800 nm時，上轉換的發射波長移至390～468 nm； （7）除了光致發光性能，與半導體量子點相似，碳點還具有電化學發光的發光特性[26]。研究認為碳點的電致發光的熒光不受粒子尺寸和修飾劑的影響而更多是取決于表面態。碳點的ECL和PL機理如圖1所示。

3 碳點的制備

自碳點被發現至今，其制備方法的研究一直是研究熱點。目前已經建立了一系列碳點合成的方法，這些方法大體上可歸納為兩大類：自上而下法（Topdown）和自下而上法（Bottomup）。

自上而下法主要是將碳的前驅體通過化學、電化學或者物理方法等使其從大變小，得到納米尺度的碳點[33]，主要包括電弧放電法[1，34]、激光刻蝕法[2，35，36]、電化學氧化法[17，37，38]和化學氧化法[39～41]等。自下而上法通常以小分子為反應前驅體，大多是采用化學方法合成熒光碳點，主要包括模板法[42～44]、微波法[45～47]和水熱合成法[48～50]等。以上方法得到的只是碳點粗產物，還需通過離心、透析或電泳等分離方法進行純化。一般而言，自上而下法制得的碳點性能較好，但存在制備過程較復雜、部分儀器較為昂貴、熒光量子產率較低和收集困難等問題； 自下而上法所用碳源來源豐富，過程較簡單，易于控制，熒光量子產率較高，但后續的分離純化較困難，且對碳點性能有較大影響。目前，制備碳點方法以自下而上法較多，近年來微波法和水熱法以其資源易得、過程綠色環保的特點更受研究者的青睞。典型的制備方法及其所得碳點的性能參數如表1和表2所示。

4 碳點在食品分析檢測中的應用

與傳統的半導體量子點一樣，碳點通過與待測物的作用從而改變表面電子空穴對之間的復合效率，導致其熒光的增強或猝滅，從而實現對待測物的定性或定量分析[51]。由于碳點的低毒性、良好的生物相容性，以及優良的光學特性，以碳點作為熒光探針的分析方法具有高效簡便、高靈敏度和選擇性好等優點，在食品分析檢測方面得到越來越廣泛的重視和應用。

4.1 食品添加劑檢測

食品添加劑的種類繁多，其濫用及超標或超范圍使用問題也非常突出，因此對其進行定量分析檢測十分必要。

Lin等[52]以甘油為碳源，PEG1500N為鈍化劑，通過微波法處理得到表面經過絲氨酸修飾后的碳點，該碳點在亞硝酸鹽和酸化的H2O2的作用下有強的發光，可用于定量檢測樣品中的亞硝酸鹽。在1.0 ×10mol/L范圍內，碳點的熒光強度變化與亞硝酸鹽含量呈線性相關，并成功應用于牛奶中亞硝酸鹽的測定。Yuan等[53]通過在空氣中加熱N羥乙基乙二胺三乙酸（HEDTA）制備得到發藍色熒光的碳點，發現該碳點與日落黃之間存在熒光能量共振轉移而使碳點發生熒光猝滅，由此可用于分析檢測樣品中日落黃的含量，碳點的熒光強度與日落黃的濃度在0.3～8.0 μmol/L 呈良好線性關系，檢出限為79.6 nmol/L，并應用于軟飲料樣品中日落黃的測定。如圖2所示，Xu等[54]將新鮮蘆薈通過水熱法處理得到的碳點能與檸檬黃相互作用形成基態復合物而導致熒光猝滅，該反應為靜態猝滅過程。在0.25～32.50 μmol/L范圍內碳點熒光信號變化與檸檬黃的濃度呈線性關系，檢出限為73 nmol/L。該方法已成功用于玉米饅頭、糖果和蜂蜜樣品中檸檬黃含量的檢測。近年來，熒光光譜檢測技術已經逐步應用于食品添加劑檢測領域并取得一定進展[55～58]，但結合碳點探針方法的報道仍較少，且研究的對象范圍較狹窄，可以改良樣品前處理方法，進一步提高該類方法的靈敏度和選擇性。endprint

4.2 金屬離子檢測

一些常見金屬離子，包括Al3+、Hg2+、Cu2+等，可通過食物鏈在人體內長期蓄積，從而對人體產生多方面的危害[59，60]。因此加強對食品中金屬離子尤其是有毒重金屬離子的檢測是保證食品安全中重要措施。利用碳點與金屬離子形成的“熒光猝滅”現象，可實現對金屬離子的快速高靈敏檢測。

Yan等[61]以檸檬酸為碳源，4，7，10三氧1， 13十三烷二胺為鈍化劑，利用一步水熱法制備可特異性識別Al3+的碳點，如圖3所示，在4～40 μmol/L的范圍內碳點的熒光強度與Al3+的濃度呈線性關系，檢測限為0.0329 μmol/L，且幾乎不受其它離子的影響， 采用此方法實現了對油條、饅頭、薯條、面包等食品中Al3+的檢測。Liu等[62]報道了一種新型熒光探針（NCNPs），并成功用于牛奶和海帶樣品中的Hg2+的檢測。該探針是以檸檬酸為碳源、（NH4）3PO4為氮源，經過水熱處理制備得到的一種氮摻雜碳點。碳點表面的NH或吡咯狀NH與Hg2+之間有較其它金屬離子更強的相互作用以引起熒光猝滅，從而實現對Hg2+的特異性檢測，檢出限為2.3 nmol/L。表面修飾后或復合型碳點能在復雜環境中對特定離子進行特異性檢測[51]。Zhu等[63]使用天然海帶作為碳源，通過水熱法制備熒光碳點，并用聚乙烯亞胺（PEI）修飾碳點表面，成功用于檢測酸奶樣品中的Cu2+。利用碳點檢測金屬離子的過程中，多數情況是利用金屬離子引起碳點的熒光內濾效應導致的熒光猝滅[64，65]。相對于傳統檢測方法，基于碳點探針方法的靈敏度和選擇性都有較明顯的優勢，但從目前的研究來看，靶向金屬離子的種類并不多，且可能由于實際處理樣本較復雜而較少能運用到實際食品中的檢測。近年來的研究發現，可以利用多種碳點組裝的熒光傳感器對多種金屬離子進行同時檢測。Gui等[66]基于碳點的上轉換熒光，將聚亞乙基亞胺功能化的碳點和表面修飾有羧基的碳點組合，開發了一種新型熒光傳感器，能夠可逆和同時檢測Cu2+和Hg2+，其中不同濃度的Cu2+和Hg2+的加入會分別引起465和600 nm處的熒光發射峰強度的線性變化，其檢出限分別為0.05和0.08 mol/L。

4.3 食品營養成分分析

利用碳點表面電子轉移產生的熒光猝滅的原理，可檢測食品中具有金屬絡合物能力的營養成分。金屬離子與碳點表面間的靜電相互作用和發生電子轉移使碳點的熒光猝滅。再根據被檢測的物質與該金屬離子有更強的絡合作用從而破壞“金屬離子碳點”體系，使碳點的熒光恢復， 最終實現對目標物的定量檢測。

谷胱甘肽（Glutathione， GSH）廣泛存在于動植物和微生物中，對維持機體適宜的氧化還原環境起到至關重要的作用[67]。Xu等[68]利用檸檬酸鈉和尿素通過水熱法制備得到碳點，加入Hg2+后與碳點表面間發生電子轉移， 使碳點發生明顯的熒光猝滅，在體系中加入對Hg2+有更強絡合作用的GSH后，碳點熒光恢復，形成對GSH的“Offon”型熒光探針，檢出限達到37 nmol/L。該探針被成功應用到西紅柿、圣女果、葡萄、黃瓜和菠菜等果蔬樣品中GSH的檢測。Hg2+還可以被較低毒性的Cu2+代替[69]，同樣可以實現對食品中GSH的高效檢測。Purbia等[70]用微波輔助水熱法合成的碳點與Cu2+形成熒光探針，用于維生素B1的檢測，如圖4所示，Cu2+的加入使碳點熒光猝滅，加入維生素B1后， 通過共價鍵作用與Cu2+結合，使其從碳點表面脫離從而使碳點熒光恢復。 該方法檢測維生素B1的靈敏度高、抗干擾性強，檢出限為280 nmol/L，線性范圍10～50 μmol/L。由于食品的多樣性和食品營養成分組成的復雜性，樣品的基質效應對檢測結果的準確性有較大的影響，因此需要選擇恰當的前處理方法，開發具有更好穩定性和選擇性的碳點材料用于檢測。

4.4 食源性致病菌檢測

近年來，在世界范圍內因食源性疾病導致的食品安全突發事故時有發生，而食源性致病菌是其主要誘因，常見的致病菌有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等[71，72]。

夏圣等[73]將抗沙門菌Ha因子抗體偶聯碳點CDs制備免疫納米熒光碳點，可有效結合抗O4磁珠富集的細菌，分離后，通過測定熒光光譜分析樣品中乙型副傷寒沙門氏菌的污染情況。結果表明，該方法對乙型副傷寒沙門氏菌的檢測限為103 CFU/mL，檢測時間約為2 h。Weng等[74]以檸檬酸銨為碳源通過加熱的方法制備碳點，發現甘露糖修飾的碳點由于甘露糖與大腸桿菌的凝集素單位的選擇性結合而能夠對大腸桿菌進行特異性標記和檢測，如圖5所示，并成功應用于自來水、蘋果汁、人尿液等實際樣品中大腸桿菌的檢測。應用碳點熒光探針對食源性致病菌的檢測方法中，尋找合適的表面配體是關鍵之一，既能與碳點牢固結合，在保證碳點的化學和光學性能穩定的同時，又能保證同目標物的有效結合。阿米卡星是一種常見的氨基糖苷類抗生素，Chandra等[75]將其作為大腸桿菌的結合配體，與水熱法合成的碳點結合形成熒光探針用于檢測大腸桿菌，其熒光強度與大腸桿菌的濃度在3.9×105～7.6×102 CFU/mL的范圍內呈線性關系，檢出限為552 CFU/mL，并且成功應用于不同果汁樣品（如蘋果汁、菠蘿汁和橙汁）中大腸桿菌的檢測。

4.5 有機污染物檢測

農獸藥的廣泛使用，自然環境和生產加工過程中的污染等，均可造成食品中的有害有機物污染，嚴重威脅食品安全。近幾年，已經建立了多種基于碳點熒光探針的檢測方法，包括熒光測定法、免疫分析法、電化學傳感器法等方法。 Chang等[76]制備了能發射強烈黃色熒光的碳點，423 nm激發時，最大發射波長為 524 nm， 農藥對氧磷可以濃度依賴的方式對該碳點的熒光猝滅，檢出限為（0.22±0.02） μmol/L， 并成功用于白菜樣品中的對氧磷檢測。除了常用的基于熒光猝滅的方法，還可以與分子印跡等方法結合開發靈敏度更高和選擇性更好的傳感器，進一步拓展其應用。Li等[77]開發一種由分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）和適配體組成的雙識別系統的生物傳感器，其中MIPs是將碳點標記的DNA適配體與林可霉素和鄰氨基苯酚通過電聚合的方法在由氧化石墨烯修飾的電極上合成的。該方法實現對林可霉素的雙重識別，具有高的靈敏度，檢出限為1.6 ×10mol/L， 并成功應用于雞肉、牛肉等多種肉類樣品中林可霉素的檢測，但穩定性仍需進一步改進。這些檢測方法可對食品中有害有機污染物進行快速靈敏的檢測，典型方法如表3所示。

5 總結與展望

碳點作為一種新型納米材料，因其突出的熒光性能、低毒性和生物相容性的特點，在食品安全領域得到了越來越廣泛的研究，具有良好的應用潛力。然而，對于碳點的開發利用仍處于初級研究階段，其熒光機理尚不十分明確。在合成制備方面，碳源的選擇呈現多樣性且方法趨于靈活簡便，但多數仍處于實驗室階段，對碳點后續純化的步驟往往比較繁瑣和耗時，且會對碳點的熒光量子產率和熒光活性有較大的影響。在食品分析應用方面，從目前的報道可看出碳點在該領域有很大的應用潛力； 由于食品組成成分的復雜性，仍存在較多有待解決的問題，例如檢測的特異性不強而靈敏度也有待提高，而且現建立的方法檢測的多是單一目標物，對于同時檢測多個目標物的報道非常少，需進一步的研究和開發。

因此，選擇合適的碳源和對合成工藝的優化，以達到降低生產成本，提高產率、化學穩定性和重現性是實現碳點大規模應用的關鍵。在后續的摻雜或表面功能化應用中，與其它方法（如免疫分析、電化學傳感器、分子印跡聚合物等方法）的聯用會進一步拓寬應用范圍，提高方法的靈敏度、準確度以及特異性，這是碳點的一個重要發展方向。近年來，免疫分析方法、傳感器等技術在食品安全檢測領域的應用不斷拓展，將碳點與免疫分析、傳感器等方法結合，有望為食品安全監管提供有效的新技術和新方法。endprint