飼用嗜酸小球菌液體生料發酵工藝研究

王小姣， 杜全能， 陳思宇，朱文娟，胡 超， 蘭時樂*

（1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙 410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

飼用嗜酸小球菌液體生料發酵工藝研究

王小姣1， 杜全能1， 陳思宇2，朱文娟2，胡 超2， 蘭時樂2*

（1.湖南農業大學東方科技學院，湖南長沙 410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128）

為提高嗜酸小球菌液體發酵的活菌數，本試驗采用生料發酵技術和單因素試驗法研究了發酵培養基組成以及發酵條件對嗜酸小球菌活菌數的影響，并采用正交試驗法對發酵條件進行優化。結果表明：適宜的發酵培養基配方和條件為葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨 0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、發酵溫度40℃、種齡60 h、接種量20%。在上述優化條件下發酵36 h，嗜酸小球菌的活菌數對數值為11.258 lg cfu/mL。研究結果顯示了液體生料發酵技術適合于飼用嗜酸小球菌的生產。

嗜酸小球菌；生料發酵；活菌數；單因素試驗；正交試驗

嗜酸小球菌（Pediococcus acidilactici），又名乳酸片球菌，是一種無芽孢、革蘭氏染色陽性乳酸菌，其分布范圍較廣，目前已從人的糞便（Mathys，2009； Millette，2008）、酸馬奶（郝彥玲，2009）、發酵香腸（Albano 和 Cosansu，2007）、羊的瘤胃（Cobos，2011）、 牛 糞 （Rodriguez-Palacios，2009） 等 樣品中分離得到，并對其產乳酸片球菌素進行了大量的研究，且取得了一系列的研究成果。嗜酸小球菌作為動物益生菌，其安全性和益生性已得到國際主要權威機構的認證，是專業被選擇用來改善動物消化道微生態系統的安全、環保飼料添加劑（余德光，2008）。關于嗜酸小球菌在動物上的應用，國內在日本鰻鱺（余德光，2008）、凡納濱對蝦（余德光，2006）、鱖（夏耘，2016）的生長和免疫功能、體液免疫因子以及腸道微生物構成等方面進行了研究，結果表明，嗜酸小球菌能有效促進水生生物的生長，提高免疫力和抑制鱖仔稚魚腸道內病原菌的繁殖，顯示了嗜酸小球菌在動物養殖中良好的應用前景。本研究以嗜酸小球菌為研究對象，通過生料發酵技術和單因素試驗法研究嗜酸小球菌液體發酵培養基組成以及發酵條件，并采用正交試驗法對發酵條件進行優化，以期為嗜酸小球菌的規?；a及其在動物飼養中的推廣應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 嗜酸小球菌，由健康的杜×長×大三元雜交商品豬腸道中分離。

1.1.2 培養基 斜面培養基：大豆蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母抽提粉0.5%，乳糖2%，葡萄糖2%，碳酸鈣1%，pH 5.8~6.2。

種子培養基：蛋白胨1%，牛肉膏 1%，酵母提取粉 0.5%，葡萄糖 2%，Tween80 0.1%，K2HPO40.2%，無水乙酸鈉0.5%，檸檬酸二銨0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·H2O 0.025%，pH 6.2~6.6。

以上培養基均在112℃條件下滅菌30 min。

基礎發酵培養基：葡萄糖3%，酵母粉0.4%，無水乙酸鈉0.5%，蛋白胨0.6%，K2HPO40.15%，NaC1 3%，pH自然。

1.1.3 主要儀器與藥品

1.1.3.1 主要儀器設備：電子天平（TMP-510，湘儀天平儀器設備有限公司）；分析天平（AL204，梅特勒—托利多儀器有限公司）；細菌培養箱（MJ-160C，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；高壓滅 菌 鍋 （SS-325，TOMY.KOGYO.CO，LTD）； 單 人單面超凈工作臺（SW-CJ-1B（U），蘇州設備凈化有限公司）。

1.1.3.2 主要藥品：牛肉膏、蛋白胨（BP，上海盛思生化科技有限公司）；酵母提取粉（BP，北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司）；檸檬酸二銨、葡萄糖、四水硫酸錳、七水硫酸鎂、磷酸氫二鉀、無水乙酸鈉、吐溫80、乳糖、氫氧化鈉 （AR，國藥集團化學試劑有限公司）；瓊脂（BP，合肥博美生物科技有限責任公司）；大豆蛋白胨（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸鈣（AR，上海泗聯化工廠有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養 斜面培養：將保存于4℃冰箱的嗜酸小球菌接種于新鮮的斜面培養基上，于37℃恒溫培養3~5 d，備用。

液體種子培養：將培養3~5 d的斜面菌種接種于裝有100 mL/250 mL三角瓶中的液體種子培養基中，于37℃下恒溫靜置培養36 h，備用。

發酵培養：將培養成熟的液體種子，按15%（V/V）接種量接種于發酵培養基中，于37℃下靜置培養2 d。

1.2.2 發酵培養基篩選 培養條件用1.2.1中的發酵培養，在單因素試驗基礎上，替換基礎發酵培養基中的葡萄糖、酵母提取粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、氯化鈉的添加量，考察其對嗜酸小球菌活菌數的影響。

1.2.3 發酵條件的篩選及優化 在發酵培養基篩選試驗結果的基礎上，分別改變發酵溫度、種齡、接種量、發酵時間等發酵條件，考察其對嗜酸小球菌活菌數的影響，并采用正交試驗法對影響活菌數較大的發酵條件進行優化。正交試驗設計如表1。

表1 因素水平表

1.2.4 活菌數的測定 參照楊文博（2004）提供的方法對發酵液中的活菌數進行測定，活菌數以對數值表示?；罹鷶涤嬎愎剑?/p>

活菌數對數值 （lg cfu/mL）=某一稀釋度下的平均菌落數×稀釋倍數×1/V；

式中：V為接種體積，mL。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的篩選

2.1.1 葡萄糖添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響改變基礎發酵培養基中的葡萄糖添加量，分別加入2%、2.5%、3%、3.5%、4%的葡萄糖，于37℃下靜置培養2 d，測定活菌數。結果見圖1。

圖1 葡萄糖添加量對活菌數的變化曲線

圖1結果表明，在一定范圍內，隨著葡萄糖添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數隨之增加。當葡萄糖添加量為2.5%時，嗜酸小球菌活菌數對數值達到8.778 lg cfu/mL。但葡萄糖的添加量繼續增加，嗜酸小球菌活菌數下降明顯。主要原因可能為葡萄糖添加量過大，改變了培養基中的C/N，從而影響了嗜酸小球菌的生長。

2.1.2 酵母提取粉添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響 改變基礎發酵培養基中酵母提取粉的添加量，分別加入 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的酵母提取粉，于37℃下靜置培養2 d，測定活菌數，考察酵母提取粉添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響。結果見圖2。

圖2 酵母提取粉的添加量對活菌數的變化曲線

從圖2中可以看出，隨著酵母抽提粉添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數也隨之增加。當酵母抽提粉添加量為0.3%時嗜酸小球菌活菌數對數

值達到9.152 lg cfu/mL。

2.1.3 蛋白胨添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響在上述試驗結果的基礎上，在發酵培養基中分別加入 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的蛋白胨，其他條件不變，于37℃下靜置培養2 d，測定活菌數，考察蛋白胨添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響。結果見圖3。

圖3 蛋白胨添加量對活菌數的變化曲線

從圖3可知，在蛋白胨添加量為0.6%~1.0%時，各處理之間嗜酸小球菌的活菌數對數值無顯著差異，且蛋白胨添加量超過0.6%，活菌數呈下降趨勢。從生產成本考慮，選擇蛋白胨添加量為0.6%進行后續試驗。

2.1.4 K2HPO4添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響 在上述試驗結果的基礎上，分別于發酵培養基中添加 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、的K2HPO4，其他條件不變，37℃下靜置培養2 d，測定活菌數?？疾霮2HPO4添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響。結果見圖4。

圖4 K2HPO4添加量對活菌數的變化曲線

磷是微生物生長繁殖和代謝不可缺少的營養物質，同時也是蛋白質和核酸合成的必要組成元素。在菌體的生長、繁殖、代謝中起著極其重要的作用。適量的磷有利于菌體生長和產物的代謝，磷過量則會影響微生物的生長。從圖4結果可以看出，隨著K2HPO4添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數對數值也隨之增加。當K2HPO4添加量為0.15%時活菌數對數值達到最大，為9.226lgcfu/mL。但K2HPO4添加量超過0.15%，嗜酸小球菌活菌數下降。

2.1.5 CH3COONa添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響 在培養基中分別添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的 CH3COONa， 其他條件不變，于37℃恒溫條件下，靜置培養2 d，測定活菌數。結果見圖5。

圖5 CH3COONa添加量對活菌數的變化曲線

從圖5可知，在一定范圍內，隨著CH3COONa添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數對數值顯著增加，當CH3COONa添加量為0.6%時嗜酸小球菌活菌數對數值最高。故選擇0.6%CH3COONa添加量作為該培養基最適添加量。

2.1.6 NaCl添加量對嗜酸小球菌活菌數的影響改變培養基中NaCl的添加量，分別在培養基中添加 2%、2.5%、3%、3.5%、4%的 NaCl， 其他條件不變，于37℃恒溫條件下，靜置培養2 d，測定活菌數。結果見圖6。

圖6 NaCl的添加量對活菌數的變化曲線

一般來講，無機鹽在低濃度下，可以促進微生物的生長，但濃度太高，會起到抑菌或殺菌作用。從圖6結果可知，在一定范圍內，隨著NaCl添加量的增加，嗜酸小球菌的活菌數對數值增加。當NaCl添加量為3%時嗜酸小球菌活菌數最高，其對數值為9.826 lg cfu/mL。但NaCl添加量超過3%，嗜酸小球菌活菌數略下降。由于本研究采用的是生料發酵技術，培養基未經過高溫滅菌，通過添加NaCl來抑制雜菌的生長。如果培養基中添加的抑菌物質濃度太低，雜菌生長旺盛，導致營養物質的消耗、代謝副產物的積累以及生長環境的改變而影響目的菌的生長，但NaCl添加量太大，在抑制雜菌的同時，也抑制了嗜酸小球菌的生長。

2.2 發酵條件的篩選

2.2.1 發酵溫度對嗜酸小球菌活菌數的影響 將發酵培養基分別放置于 31、34、37、40、43 ℃， 恒溫靜置培養2 d，其他條件不變，測定活菌數。結果見圖7。

圖7 發酵溫度對活菌數的變化曲線

細菌生長過程中溫度分為最適生長溫度、最低生長溫度以及最高生長溫度。溫度過低時，菌體代謝活動降低甚至停止生長；溫度過高，導致菌體蛋白質變性、酶失活、核酸結構遭到破壞等，從而影響微生物的生長，甚至導致微生物的死亡。從圖7可知，當培養溫度為37℃時，活菌數對數值最高，為9.912 lg cfu/mL。

2.2.2 種齡對嗜酸小球菌活菌數的影響 分別將培養 24、36、48、60、72 h 的液體種子接入發酵培養基中，其他條件不變，培養2 d，測定活菌數。結果見圖8。

圖8 種齡對活菌數的變化曲線

種齡也是影響微生物發酵的主要因素之一。種齡過大，細胞處于衰亡期，菌體代謝活力降低；而種齡過小，接入發酵培養基后，由于種子液中細胞數量少，導致延滯期長，延長了發酵周期。從圖8結果可知，在種齡24~48 h，嗜酸小球菌活菌數對數值隨種齡的增加而增加。當種齡為48 h時，活菌數對數值最高，為10.253 lg cfu/mL。

2.2.3 接種量對嗜酸小球菌活菌數的影響 按體積比 （V/V）分別在發酵培養基中接入10%、15%、20%、25%、30%的液體種子，其他條件不變，37℃發酵2 d，測定活菌數。結果見圖9。

從圖9可知，嗜酸小球菌活菌數對數值隨接種量的變化明顯。當接種量為20%時，活菌數對數值為10.869 lg cfu/mL。當接種量超過20%，活菌數明顯下降。接種量過大，由種子液帶到發酵培養基中的副產物過多，同時前期菌體量過大，物質消耗過快，從而影響或抑制微生物的生長。

2.2.4 發酵時間對嗜酸小球菌活菌數的影響 將發酵培養基置于37℃培養箱中發酵，分別于24、36、48、60、72 h 取樣，測定活菌數。 結果見圖 10。

圖9 接種量對活菌數的變化曲線

從圖10可知，當發酵時間為48 h時，活菌數對數值最大，為10.815 lg cfu/mL。培養時間超過48 h，活菌數降低?？赡苁且驗殡S著培養時間的延長，培養基中營養物質逐漸消耗，代謝產物大量積累。同時，嗜酸小球菌通過對糖的代謝產生大量乳酸而使培養基pH值下降，導致菌體停止生長甚至死亡。

圖10 發酵時間對活菌數的變化曲線

2.3 培養基發酵條件優化 在單因素試驗基礎上，選擇發酵溫度、種齡、接種量、發酵時間進行四因素三水平正交試驗。試驗結果見表2。

由表2極差R可知，影響嗜酸小球菌活菌數各因素的主次關系為A＞D＞C＞B，即發酵溫度＞發酵時間＞接種量＞種齡。嗜酸小球菌液體發酵最優條件組合為A3B3C2D1，即嗜酸小球菌適宜的發酵條件為發酵溫度40℃、發酵時間60 h、接種量20%、種齡36 h?；罹鷶祵抵禐?1.258 lg cfu/mL。

3 討論與結論

培養基營養成分和發酵條件對微生物發酵過程能產生重要的影響 （Carvalho和Mapari，2005；閔麗娥，2001）。如培養基中碳源、氮源種類及比例、碳氮比、培養溫度、培養基的初始pH、接種量、種齡、培養時間等。許多研究表明，通過對培養基組成和發酵工藝參數的優化，能顯著提高發酵液中的細胞濃度（朱承亮，2008；Chiara，2003）。 乳酸菌制劑有效活菌數是衡量其應用效果的主要指標。目前，微生物的發酵方式從滅菌與否可分為熟料發酵和生料發酵。由于生料發酵具有生產工藝簡單且能耗低、營養成分破壞少等優點，越來越受到微生物工作者的重視。嗜酸小球菌是一種乳酸菌，已有研究表明，該菌在動物養殖上具有很好的益生效果（夏耘等，2016；余德光等，2006、2005），但嗜酸小球菌的發酵培養基組成和發酵條件，特別是生料發酵工藝的研究鮮見報道。本研究以從健康豬腸道中分離的嗜酸小球菌為研究對象，采用液體生料發酵技術，研究了發酵培養基組成和發酵條件對嗜酸小球菌活菌數的影響，在此基礎上，采用正交試驗法對嗜酸小球菌的培養條件進行優化，得出適宜的發酵培養基組成和發酵條件為葡萄糖2.5%、酵母抽提粉0.3%、蛋白胨0.6%、K2HPO40.1%、CH3COONa 0.6%、NaCl 3%、發酵溫度40℃、種齡60 h、接種量20%、發酵時間36 h。在此培養條件下，嗜酸小球菌活菌數對數值為11.258 lg cfu/mL。

表2 正交試驗結果

[1]郝彥玲，黃榮，趙潞，等.新疆酸馬奶中乳酸片球菌所產細菌素05-8的理化特性及分子量確定[J].中國乳品工業，2009，11：12～14.

[2]閔麗娥，劉克武，黃裕村，等.幾種碳源和維生素對紅曲生理活性物質生成的影響[J]．釀酒科技，2001，2：23 ～ 24．

[3]夏耘，余德光，謝駿，等.養殖水體添加嗜酸小球菌對鱖發育過程腸道微生物構成的影響[J].淡水漁業，2016，46（6）：71 ～ 76.

[4]楊文博 主編.微生物學實驗[M].北京：化學工業出版社，2004.

[5]余德光，謝駿，王廣軍，等.嗜酸小球菌對日本鰻鱺生長和免疫的影響[J].湛江海洋大學學報，2005，25（4）：14 ～ 17.

[6]余德光，朱紅友，王廣軍，等．嗜酸小球菌對凡納濱對蝦體液免疫因子的影響[J].海洋水產研究，2006，27（5）：51 ～ 55．

[7]朱承亮.乳酸菌高密度培養技術的研究：[碩士學位論文][D].杭州：浙江大學，2008.

[8]Albano H，Todorov SD，van Reenen CA，et al.Characterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidi/actici isolated from “Alheira”，a fermented sausage traditionally produced in Portugal[J].Int J Food Microbio1，2007，116（2）：239 ～ 247.

[9]Cosansu S，Kuleasan H，Ayhan K，et al.Antimicrobial activity and protein profiles of Pediococcus spp.isolatedfrom Turkish"Sucuk"[J].Journal of Food Processing and Preservation，2007，31（2）：190 ～ 200.

[10]Cobos MA，Ley de Coss A，Ramirez N D，et al.Pediococcus acidilactici isolated from the rumen of lambs with rumen acidosis，16SrRNA identification and sensibility to monensin and lasalocid[J].Res Vet Sci，2011，90（1）：26 ～ 30.

[11]Carvalho J C，Oishi B O，Pandey A，et al.Biopigments from Monascus：strain selection citrinin production and color stability[J].Brazilian Archives of Biology and Technology，2005，48： 885 ～ 894.

[12]Chiara S ，Vincenzo A ，Vivien V，et al.Cell density cultivation of probiotics and lactic acid production[J].Biotechnology and Bioengineering，2003，82（2） ：213 ～ 222.

[13]Mathys S，Meile L，Lacroix C.Co-cultivation of abacteriocin-producing mixed culture ofBifidobacterium thermophilum RBL67 and Pediococcus acidi/actici UVA1 isolated from babyfaeces[J].JAppl Microbio1，2009，107（1）：36 ～ 46.

[14]Millette M，Dupont C，Shareck F，et al.Purification and identification of the pediocin produced by Pediococcus acidilactici MM33，a new human intestinal strain[J].Appl Microbio1，2008，104（1）：269 ～ 275.

[15]Mapari S A S，Nielsen K F，Larsen T O，et al.Exploring fungal biodiversity for the production of water～soluble pigments as potential natural food colorants[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16：231 ～ 238.

[16]Rodriguez-Palacios A，Staempfli H R，Duffield T，et al.Isolation of bovine intestinal Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici with inhibitory activity against Escherichia coli 0157and F5[J].Journal of Applied Microbiology，2009，106（2）：393 ～ 401.■

In order to improve the viable count of Pediococcus acidilactici by using liquid-state fermentation，the effects of the cultural medium compositions and fermentation conditions on the viable count were studied by using single-factor experiments with the viable count as index.Then the fermentation conditions were optimized by using orthogonal experiment.The results showed that the optimizal medium compositions and fermentation conditions were as follows：glucose 2.5%，yeast extract 0.3%，peptone 0.6%，K2HPO40.1%，CH3COONa 0.6%，NaCl 3%，fermentation temperature 40 ℃，the seed age 60 h，the inoculation amount 20%and the fermentation time 36 h.Under these conditions cultured for 36 h，the viable count of Pediococcus acidilactici reached 11.258 lg cfu/mL.It showed that the liquid fermentation technology was suitable for the production of feeding Pediococcus acidilactici.

Pediococcus acidilactici；uncooked material fermentation；viable count；single-factor experiment；orthogonal experiment

S816.3

A

1004-3314（2017）21-0016-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172104

湖南省重點研發項目（2016NK2103）；湖南農業大學東方科技學院大學生創新項目（DFCXY201454）

*通訊作者