PARP-1抑制劑下調SIRT1基因表達誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡的機制

徐清華

·論著·

PARP-1抑制劑下調SIRT1基因表達誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡的機制

徐清華

目的觀察PARP-1抑制劑Olaparib對非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響及可能機制。方法常規培養A549細胞，分別給予不同劑量Olaparib(0、5、10、20、50 μmol/L)和(或)SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)、SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)處理24 h，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western-blot檢測細胞SIRT1及凋亡相關基因表達。結果Olaparib處理A549細胞24 h后，細胞存活率、SIRT1及抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達逐漸降低，凋亡率及促凋亡基因Bax、Caspase-3蛋白表達逐漸增加，呈劑量依賴性(Plt;0.05)。單獨給予EX527處理A549細胞能夠模擬Olaparib的上述作用(Plt;0.05)，但SRT1720和Olaparib聯合組能夠拮抗Olaparib的上述作用(Plt;0.05)。結論PARP-1抑制劑Olaparib通過下調SIRT1基因表達抑制A549細胞增殖，并誘導其凋亡。

非小細胞肺癌；PARP-1抑制劑；Olaparib；SIRT1；凋亡

目前，我國肺癌發病率和病死率逐年升高，高居惡性腫瘤死因的首位，其中超過80%的患者為非小細胞肺癌[1]。現階段，外科手術、放化療及生物治療是臨床治療非小細胞肺癌的常用手段，但患者5年生存率低，易復發，且不良反應明顯[2,3]。因此，研究療效確切、不良反應小的分子靶向藥物對于非小細胞肺癌的治療具有廣闊應用前景。聚腺苷二磷酸核糖聚合[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制劑是新型抗癌藥物，能夠靶向抑制DNA損傷修復過程。體外試驗和臨床試驗均證實PARP-1抑制劑具有較強的抗腫瘤效果[4,5]。然而，PARP抑制劑調控肺癌細胞增殖和凋亡的分子機制尚未闡明。沉默信息調節因子1(silent informationregulator 1，SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙酰化酶，參與調控DNA損傷修復、能量代謝、細胞增殖和凋亡等[6]。已有研究發現，SIRT1在結腸癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤細胞表達上調，通過調控p53、Noxa等多種蛋白質的去乙酰化過程發揮抗凋亡作用[6]。本研究采用人非小細胞肺癌細胞株A549為研究對象，首先觀察PARP-1抑制劑Olaparib對A549細胞增殖和凋亡的影響，并進一步以SIRT基因為靶點，探討Olaparib調控A549細胞增殖和凋亡的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人非小細胞肺癌細胞株 A549購自中科院細胞庫；Olaparib購自美國Selleck 公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國GIBCO公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；小鼠抗人SIRT1、Bax、Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；960型酶標儀購自美國Sigma公司；BD FACSCalibur流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 細胞培養 A549細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中常規培養。細胞貼壁后加入不同劑量Olaparib(0、5、10、20、50 μmol/L)、SRT1720(1 μmol/L)或EX527(1 μmol/L)處理24 h，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT法 A549細胞接種于96孔培養板中，調整細胞密度為1×104/孔，藥物干預 24 h后棄去培養基，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h后于酶標儀570 nm波長處測定吸光度值。細胞存活率(%)=(試驗組A570/對照組A570)×100%。

1.4 流式細胞術 A549細胞接種于6孔培養板中，調整細胞密度為5×104/孔，藥物干預 24 h后棄去培養基，收集細胞，加入400 μl Binding buffer重懸細胞，加入AnnexinV和PI溶液，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western-blot 收集細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS-PAGE電轉移至PVDF膜上，分別加入小鼠抗人SIRT1、Bax、Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBST洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，PBST洗3次。ECL法顯色、定影，用Image Pro.Plus 4.5 軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 不同劑量Olaparib對A549細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，A549細胞在0、5、10、20、50 μmol/L Olaparib干預24 h后細胞OD570、存活率逐漸降低，呈劑量依賴性(Plt;0.05)，提示Olaparib能夠明顯抑制A549細胞增殖。見表1。

項目Olaparib劑量(μmol/L)對照組5102050OD5700.86±0.130.75±0.11*0.62±0.09#0.44±0.13#0.26±0.13#存活率(%)10087.21±4.57*72.09±4.48#51.16±4.09#30.23±3.53#

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01

2.2 不同劑量Olaparib對A549細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，A549細胞在0、5、10、20、50 μmol/L Olaparib干預24 h后細胞凋亡率逐漸增加，呈劑量依賴性(Plt;0.05)，提示Olaparib能夠明顯促進A549細胞凋亡。見表2。

項目Olaparib劑量(μmol/L)對照組5102050凋亡率(%)2.08±0.299.80±1.02*15.76±2.16#24.95±3.31#38.93±4.67#

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01

2.3 不同劑量Olaparib對A549細胞SIRT1基因表達的影響 Western-blot結果顯示，A549細胞在0、5、10、20、50 μmol/L Olaparib干預24 h后細胞SIRT1蛋白表達逐漸降低，呈劑量依賴性(Plt;0.05)，提示Olaparib能夠明顯下調A549細胞SIRT1表達。見表3。

項目Olaparib劑量(μmol/L)對照組5102050SIRT1蛋白1.08±0.140.87±0.11*0.70±0.08#0.52±0.05#0.32±0.04#

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01

2.4 不同劑量Olaparib對A549細胞凋亡相關基因表達的影響 Western-blot結果顯示，A549細胞在0、5、10、20、50 μmol/L Olaparib干預24 h后細胞Bax、caspase-3蛋白表達逐漸增加，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，呈劑量依賴性(Plt;0.05)，提示Olaparib能夠明顯上調A549細胞促凋亡基因表達，下調抗凋亡基因表達。見表4。

2.5 Olaparib通過下調SIRT1基因表達抑制A549細胞增殖 MTT實驗結果顯示，A549細胞在SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)干預后細胞OD570、存活率明顯降低(Plt;0.05)；與Olaparib組和EX527組比較，SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)預處理A549細胞后再給予Olaparib(50 μmol/L)細胞OD570、存活率明顯升高，提示Olaparib通過下調SIRT1基因表達抑制A549細胞增殖。見表5。

指標Olaparib劑量(μmol/L)對照組5102050Bax0.40±0.050.56±0.06*0.74±0.08#0.85±0.09#0.99±0.12#Bcl-20.85±0.120.73±0.10*0.62±0.09#0.40±0.06#0.29±0.04#Caspase-30.32±0.030.41±0.04*0.53±0.05#0.64±0.06#0.80±0.10#

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01

組別OD570存活率(%)對照組0.86±0.13100Olaparib(50μmol/L)組0.26±0.1330.23±3.53#EX527(1μmol/L)組0.23±0.1025.68±3.60#SRT1720(1μmol/L)+Olaparib(50μmol/L)組0.74±0.1169.95±8.79*△

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01;與Olaparib組、EX527組比較,△Plt;0.05

2.6 Olaparib通過下調SIRT1基因表達誘導A549細胞凋亡 流式細胞術結果顯示，A549細胞在SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)干預后細胞凋亡率明顯增加(Plt;0.05)；與Olaparib組和EX527組比較，SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)預處理A549細胞后再給予Olaparib(50 μmol/L)細胞凋亡率明顯降低(Plt;0.05)，提示Olaparib通過下調SIRT1基因表達誘導A549細胞凋亡。見表6。

2.7 Olaparib通過下調SIRT1基因表達調節A549細胞凋亡相關基因表達 Western-blot結果顯示，A549細胞在SIRT1抑制劑EX527(1 μmol/L)干預后細胞Bax、caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達明顯降低(Plt;0.05)；與Olaparib組和EX527組比較，SIRT1激動劑SRT1720(1 μmol/L)預處理A549細胞后再給予Olaparib(50 μmol/L)細胞Bax、caspase-3蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高(Plt;0.05)，提示Olaparib通過下調SIRT1基因表達調節A549細胞凋亡相關基因表達。見表7。

組別凋亡率(%)對照組2.08±0.29Olaparib(50μmol/L)組38.93±4.67#EX527(1μmol/L)組40.58±5.02#SRT1720(1μmol/L)+Olaparib(50μmol/L)組8.69±0.93*△

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01;與Olaparib組、EX527組比較,△Plt;0.05

組別BaxBcl-2Caspase-3對照組0.40±0.050.85±0.120.32±0.03Olaparib(50μmol/L)組0.99±0.12#0.29±0.04#0.80±0.10#EX527(1μmol/L)組1.05±0.14#0.24±0.03#0.86±0.11#SRT1720(1μmol/L)+Olaparib(50μmol/L)組0.55±0.07*△0.64±0.08*△0.48±0.08*△

注：與對照組比較,*Plt;0.05，#Plt;0.01;與Olaparib組、EX527組比較,△Plt;0.05

3 討論

PARP是存在于真核細胞中的一種多功能酶超家族，在單鏈DNA斷裂修復和凋亡中發揮重要作用。PARP缺失或抑制PARP能夠降低DNA修復效率，并增強腫瘤細胞對化療的敏感性。目前，有關PARP抑制劑在腫瘤治療中的研究已經進入臨床試驗階段，結果顯示PARP抑制劑單藥能夠有效發揮抗腫瘤活性。國內外研究發現PARP抑制劑DPQ、3-AB能夠抑制肝癌細胞、骨肉瘤細胞增殖，并促進其凋亡[7,8]。Olaparib是2014年美國FDA批準上市的一種PARP抑制劑。臨床研究結果顯示，Olaparib聯合鉑類化療方案能夠明顯延長卵巢癌、乳腺癌、輸卵管癌患者無進展生存期，且毒副作用小，患者耐受性好[9-11]。王維等[12]研究發現，Olaparib能夠增強Lewis肺癌細胞及移植瘤對放療的敏感性，其機制可能與Olaparib促進腫瘤細胞DNA雙鏈斷裂及Bax/Bcl-2促凋亡體系蛋白表達有關。然而，Olaparib對肺癌細胞增殖和凋亡的影響及具體分子機制尚不清楚。

SIRT1基因是Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶sirtuin家族的重要成員，具有催化轉錄因子、信號分子、DNA修復蛋白等非組蛋白去乙酰化作用，參與調控物質代謝、神經保護、慢性炎癥等生理和病理過程[13,14]。 近年來，多項證據表明SIRT1基因與腫瘤形成密切相關，其表達上調在腫瘤生長、侵襲和遷移中發揮重要作用[15]。然而，SIRT1基因表達在肺癌發生發展中的作用尚存在不一致的結論。Chen等[16-18]研究發現SIRT1在肺腺癌組織表達升高，與腫瘤細胞的侵襲轉移及預后密切相關，而SIRT1抑制劑通過上調促凋亡基因的表達抑制腫瘤生長。相反，Lim等[19]研究發現SIRT1通過去乙酰化缺氧誘導因子HIF1-α發揮抗腫瘤作用。張春艷等[20]研究發現，白藜蘆醇通過上調人肺齒槽上皮細胞HPAECs中SIRT1的表達，從而抑制活性氧簇(ROS)的產生及其介導的肺損傷過程。因此，對SIRT1在誘導肺癌發生發展中的作用有待闡述清楚。

本研究表明，與對照組比較，Olaparib組A549細胞存活率顯著降低，凋亡率顯著增加，且有明顯的劑量依賴關系，同時SIRT1、Bcl-2基因表達顯著降低，Bax基因表達顯著增加，說明Olaparib具有促進A549細胞凋亡的作用。這與章俊等[21]報道的PARP-1抑制劑ABT-888抑制VP-16誘導的A549細胞增殖并促進其凋亡的研究結果一致。本研究還發現，Olaparib促凋亡的機制可能與SIRT1基因有關，因為SIRT1激動劑SRT1720能夠模擬Olaparib的作用，相反SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉或阻斷Olaparib的作用，結果均提示Olaparib可能通過下調SIRT1表達調控A549細胞活力和凋亡。

綜上所述，PARP抑制劑作為新型腫瘤靶向治療藥物，通過抑制DNA損傷修復誘導A549細胞凋亡，其促凋亡機制與下調SIRT1基因表達有關。但是PARP抑制劑是如何調控SIRT1基因表達的尚待后續研究。本研究為非小細胞肺癌的防治提供了新思路和新策略。

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Theapoptosisofnon-smallcelllungcancerA549cellsinducedbyPARPinhibitor-Olaparibinvitrothroughdown-regulatingtheexpressionofSIRT1gene

XUQinghua.

DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofLangfangCity,Hebei,Langfang065000,China

ObjectiveTo investigate the effects of PARP inhibitor-Olaparib on the growth and apoptosis of non-small cell lung cancer A549 cells and its possible action mechanism.MethodsThe A549 cells were routinely cultured and treated with different doses of Olaparib (0、5,10,20,50μmol/L) and/or SRT1720(1μmol/L),EX527(1μmol/L)for 24h.Then MTT method was used to evaluate the proliferation of A549 cells.Flow cytometer was used to analyze the apoptosis of A549 cells,and Western Blot was performed to detect the expressions of SIRT1 and apoptosis-related genes.ResultsAfter A549 cells were treated by different concentrations of Olaparib for 24h,the survival rate,the expression levels of SIRT1 and Bcl-2 of A549 cells were gradually decreased with the increase of Olaparib dosage,meanwhile the apoptosis rate,the expression levels of Bax and Caspase-3 of A549 cells were also gradually increased with the increase of Olaparib dosage,with a dose-dependent manner (Plt;0.05). Moreover simple EX527 could simulate the effects of Olaparib on A549 cells (Plt;0.05),however, the SRT1720 combined with Olaparib could resist the effects of Olaparib as mentioned above.ConclusionPARP inhibitor-Olaparib can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of A549 cells by down-regulating the expression levels of SIRT1 gene.

non-small cell lung cancer; PARP inhibitor; Olaparib; SIRT1; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.22.003

065000 河北省廊坊市人民醫院藥學部

R 734.2

A

1002-7386(2017)22-3374-04

2017-05-16)