VEGF、Ki-67和TCF4在基底細胞癌中的表達及意義

張勝逆 康瑞花 張濤 趙建偉 丁秋允 趙桂香 張紅巖 劉春梅

·論著·

VEGF、Ki-67和TCF4在基底細胞癌中的表達及意義

張勝逆 康瑞花 張濤 趙建偉 丁秋允 趙桂香 張紅巖 劉春梅

目的探討VEGF、Ki-67、TCF4在基底細胞癌的表達模式及其之間的相關性，為臨床的預后判斷提供幫助。方法采用免疫組化方法和免疫印跡法對58例基底細胞癌和46例脂溢性角化病的標本進行檢測。結果VEGF、Ki-67、TCF4在基底細胞癌中的陽性率分別為60.10%(35/58)、83.27%(38/58)、91.07%(53/58)高于脂溢性角化病的26.20%(12/46)、27.39%(13/46)、21.74%(10/46)，差異有統計學意義(Plt;0.05)；VEGF、Ki-67、TCF4在BCC表達顯著性升高，差異有統計學意義(Plt;0.01)。結論BCC的發生發展可能與VEGF、Ki-67、TCF4的異常高表達有關。

基底細胞癌；血管內皮生長因子；Ki-67；T細胞因子4；免疫組化；免疫印跡

基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)是源自表皮或其附屬器的皮膚惡性腫瘤，為最常見的皮膚惡性腫瘤之一[1-3]。BCC的好發部位以顏面部居多，盡管其惡性程度較低，但手術后可能會留有永久性瘢痕甚至出現容顏毀損，對患者生理和心理帶來極大的不利影響[4]，值得我們對BCC的病因和發病機制進行深入探討。目前其病因及發病機制尚不清楚，有研究報道BCC發病機制可能與WNT信號通路有關[5],本研究采用免疫組化和免疫印跡檢測血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Ki-67、T細胞因子4(T cell factor 4，TCF4)在BCC及脂溢性角化病(seborrheic keratosis, SK)中的表達特征及相關性，更進一步闡述血管生成因素、細胞增殖在BCC發生發展中的作用以及對于腫瘤惡性程度以及轉移、預后的影響，以進一步探討BCC的發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10月至2016年2月于河北大學附屬醫院皮膚科和普外科就診并手術患者，結合臨床表現、病理確診為BCC和SK。選取58例BCC標本，其中男32例，女26例;年齡47～82歲，平均年齡(57.2±3.2)歲；病程1.3～4年，平均(3.52±0.86)年。選取46例SK標本作為對照組，其中男25例，女21例;年齡42～76歲，平均(55.4±3.1)歲。2組在年齡、性別比方面差異無統計學意義(Pgt;0.05)。同時對來自外科外傷患者切除的20例正常皮膚標本進行檢測。本研究通過河北大學附屬醫院的倫理委員會審批，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 小鼠抗人VEGF單克隆抗體，購自美國santa公司；小鼠抗人Ki-67單克隆抗體，購自美國santa公司；小鼠抗人TCF4單克隆抗體，購自美國santa公司；SP免疫組化系列工作液試劑盒，購自北京中杉公司；DAB顯色液，購自北京中杉公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化：石蠟切片常規脫蠟水化，微波抗原修補，加入一抗為VEGF、Ki-67、TCF4(濃度1∶200，小鼠抗人單克隆一抗，美國santa公司)，4℃孵育12 h。二抗(兔抗小鼠)采用北京中杉公司S-P試劑盒，DAB(北京中杉公司)顯色經蘇木素復染，脫水、透明后封片。每次染色均設陰性和陽性對照。采用 NIS-Elements Basic Research 多媒體彩色病理圖像分析系統對VEGF、Ki-67、TCF4表達進行定位觀察分析，每張切片分別觀察200倍及400倍視野圖像。

1.3.2 免疫印跡：取BCC及SK標本組織100 mg，勻漿后低溫離心，應用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。測定蛋白濃度后聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至硝酸纖維素膜上，然后一抗4℃孵育12 h，二抗孵育后ECL顯色、曝光。對蛋白質含量進行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達量。

1.4 結果判定 VEGF以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性細胞；Ki-67、TCF4陽性表達表現為細胞核著色，呈棕色、棕黃色。計數腫瘤細胞密集域共10個，選擇400倍視野進行陽性率的計算，取平均值，完全陰性或陽性率lt;10%者為(-)， 10%～25%為(+)， 26%～50%為(++)，gt;50%為(+++)。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 TCF4陽性為細胞核著色，TCF4 在正常上皮的基底部位細胞中有少數弱陽性表達，其他部位基本為陰性表達(圖1-1)。在BCC 組織細胞中，TCF4主要在細胞核呈弱陽性、陽性表達，并彌漫均勻的分布于整個腫瘤組織。在BCC皮損中53例陽性，陽性率為91.07% (圖1-2)；SK皮損10例陽性表達, 陽性率為21.74%(圖1-3)。VEGF 在正常組織呈陰性表達(圖1-4)；在腫瘤部位的胞質，胞膜及在間質處均可見散在棕色顆粒，在BCC皮損中35例陽性，陽性率為60.10%(圖1-5)；SK皮損12例陽性表達, 陽性率為26.20%(圖1-6)；Ki-67陽性為細胞核著色，Ki-67在正常皮膚組織的基底層、棘細胞層僅個別細胞有著色，為陰性表達(lt;5%)(圖1-7)；在 BCC 組織細胞中， Ki-67主要在細胞核呈弱陽性、陽性表達，在BCC皮損中38例陽性，陽性率為83.27%(圖1-8)；SK皮損13例陽性表達，陽性率為27.39%(圖1-9)；VEGF、Ki-67、TCF4在BCC皮損中的表達明顯高于SK組，差異有統計學意義(Plt;0.05)(表1)。Spearman等級相關分析：Ki-67和TCF4呈正相關(rs=0.879，Plt;0.01)；VEGF和Ki-67呈正相關(rs=0.946，Plt;0.01)；VEGF和TCF4呈正相關(rs=0.756，Plt;0.01)。見圖1，表1。

圖1-1 TCF4在正常皮膚的表達

圖1-2 TCF4在BCC的表達

圖1-3 TCF4在SK的表達

圖1-4 VEGF在正常皮膚的表達

圖1-5 VEGF在BCC的表達

圖1-6 VEGF在SK的表達

圖1-7 Ki-67在正常皮膚的表達

圖1-8 Ki-67在BCC的表達

圖1-9 Ki-67在SK的表達

2.2 Western蛋白印跡結果 BCC組VEGF(1.41±0.015 vs 0.67±0.008)、KI-67(1.26±0.021 vs 0.54±0.012)、TCF4(1.08±0.007 vs 0.36±0.001)蛋白表達水平均明顯高于SK組(Plt;0.01)。見圖2，表2。

圖2 Western blot顯示VEGF、Ki-67、TCF4在BCC及SK中表達差異

組別VEGFKi-67TCF4BCC1.41±0.0151.26±0.0211.08±0.007SK 0.67±0.0080.54±0.0120.36±0.001P值3.56×10-56.22×10-67.85×10-4

3 討論

BCC是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發于顏面部的暴露部位，隨著病程進展腫瘤以浸潤性生長方式破壞鄰近組織，影響功能和美觀，嚴重時轉移至重要器官而危及生命，然而其確切的發病機制仍不清楚，亟待解決[6-8]。

本研究在前期研究發現BCC的發生發展與WNT信號通路密切相關，在BCC的發病過程中存在WNT1、β-catenin的表達的異常升高，提示了這種異常表達模式可能是促進腫瘤進展的重要因素，其可能的通路作用與BCC的發生是密切相關的[9]。研究顯示WNT信號通路是調控細胞生長、增殖的重要信號通路，WNT-β-catenin-TCF信號轉導通路異常激活可導致胚胎發育缺陷及多種腫瘤的發生、發展[10]。研究發現，WNT信號轉導通路的激活與皮膚腫瘤的發生發展有著密切的關系[11]。通路中的TCF基因家族(包含4個不同的蛋白TCF1、TCF3、TCF4和LEF)在正常組織發育和分化過程中起至關重要的作用，既能促進細胞增殖分化，又可抑制細胞過度生長，防止腫瘤發生[12]。其中，TCF4被證實為與腫瘤關系最密切的核內轉錄因子。研究報道，TCF4在肺癌，結腸癌，肝癌，腎癌，胃癌等腫瘤發生中表達明顯增強，推測異常升高的TCF4，刺激下游靶基因的表達，進而參與腫瘤的發生發展[13]。

本研究采用免疫組化方法及免疫印跡的方法分別檢測了良、惡性角質形成細胞腫瘤(脂溢性角化病、基底細胞癌)組織中TCF4的表達情況。本研究結果顯示：在基底細胞癌皮損中，TCF4在細胞核呈現不同程度的陽性表達，表達率高達陽性率為91.07%，而在脂溢性角化皮損及正常皮膚表皮全層表達顯著減低。Western blot也證實其在表達量上也存在著顯著性差異，這表明在BCC中TCF4的表達模式發生了異質性改變，這種改變可能與BCC的發生相關。Zhao等[14]發現在肝癌細胞系BEL-7402中TCF4呈高表達，楊連赫等[15]的研究表明TCF4在肺癌組織中呈強陽性表達，而在正常肺組織中不表達。在本研究中，TCF4在基底細胞癌和脂溢性角化病、正常皮膚組織中表達的強烈反差可推測TCF4的高表達與基底細胞癌的進展密切相關，從而提示TCF4的表達水平能夠在一定程度上反映腫瘤細胞的活動性，進而推測TCF4的高表達可能與腫瘤細胞的惡性程度和分化程度有關。

有研究表明，當WNT信號通路異常激活后， TCF4在WNT信號傳導中可調控下游基因表達[10]，進一步激活c-myc、cyclinD1、TCF-1及Ki-67等，發揮進一步的生物學功能。本研究中我們采用Spearman等級相關分析發現TCF4和Ki-67呈正相關(rs=0.879，Plt;0.01)，這表明TCF4的異常高表達的直接結果之一是促進了Ki-67的異常擴增，促進細胞過度增殖，細胞周期出現紊亂，導致細胞分裂異常。Ki-67的表達與細胞有絲分裂密切相關，隨細胞周期不同而發生改變，是反映腫瘤細胞增殖活性的指標。Ki-67 僅在增殖細胞的胞核中表達，半衰期短，脫離細胞周期后迅速降解，其表達高低是反應腫瘤細胞增殖能力的重要參考之一[16]。研究證明，Ki-67的表達程度與腫瘤的惡性程度呈正相關，表達越高其惡性程度及細胞增殖能力越強。本研究結果顯示，只在少數正常上皮的基底部位有散在的細胞核弱陽性表達，其余幾乎均為陰性表達。而在基底細胞癌腫瘤組織細胞中陽性表達程度顯著增高38例陽性，陽性率為83.27%； SK皮損13例陽性表達，陽性率為27.39%。Western blot也證實其在表達量上也存在著明顯差異，說明在BCC可能在生物學本質上并不傳統認為具備所謂“惰性”，而是增殖程度較高的惡性腫瘤；并且其表達程度與TCF4呈正相關，說明在BCC的發生過程中在多種致癌因素作用下可能是由于TCF4的異常表達激活了Ki-67的高表達，從而使得基底細胞發生過度增殖而發生惡變。

腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長和轉移的基礎[17,18]，之前研究對于BCC中血管生成的研究較少，本研究發現，在皮膚BCC中VEGF蛋白的表達明顯高于SK組和對照組，本組資料顯示VEGF在BCC有較高的表達，陽性率為60.10%；經統計學分析后顯示VEGF在BCC皮損中的表達明顯高于SK組，有顯著性差異；而在正常皮膚及幾乎不表達，這說明VEGF參與了BCC細胞間質腫瘤微環境的代謝，為腫瘤的生長和進一步浸潤提供了基礎，尤其是腫瘤的生長和轉移，它依賴于人體內的新生血管。有研究顯示在在腫瘤細胞中，WNT-β-catenin-TCF通路可以通過靶向調節miR-23b而促進VEGF的表達[19，20]，腫瘤的血管形成受到多種調控因子的調節，其中血管內皮生長因子VEGF作為最重要的血管生長因子之一。VEGF的生物學功能包括促進血管形成和增加血管通透性，對血管內皮細胞的增殖、基底膜水解、遷移和血管構建的調控作用較強，且特異性高。近年來陸續發現，在一些腫瘤細胞上也存在VEGF受體的表達，提示腫瘤中可能存在VEGF的自分泌機制。有研究表明，人肝細胞癌組織中有VEGF的表達，且VEGF的表達于肝癌細胞的生長和轉移密切相關[19]。從而我們認為，在BCC的發展過程中由于BCC腫瘤細胞不斷自分泌VEGF促進了腫瘤微環境的形成，對其浸潤性生長和轉移提供了有力的條件。同時，我們對VEGF、Ki-67、TCF4兩兩之間進行Spearman相關性分析，研究結果表明兩兩之間表達均呈正相關，由此可以推測VEGF、Ki-67、TCF4在功能上存在協同作用，一致性的高表達可能參與了BCC的發生。

本研究顯示，VEGF、Ki-67、TCF4在BCC的形成機制中可能起到一定的作用?？赡苋咧g通過協同作用改變WNT通路，導致細胞增值分化異常而致腫瘤發生。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.22.016

071000 河北省保定市，河北大學附屬醫院皮膚科(張勝逆、趙建偉、丁秋允、趙桂香、張紅巖、劉春梅)，胃腸外科(張濤)；河北醫科大學第四醫院皮膚科(康瑞花)

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2016-04-16)