植物核苷二磷酸激酶研究進展

朱馨妮 汪珊珊 周佳琴 朱世華

（1. 寧波大學海洋學院，寧波 315211；2. 寧波大學科學技術學院，寧波 315211）

植物核苷二磷酸激酶研究進展

朱馨妮1汪珊珊1周佳琴2朱世華2

（1. 寧波大學海洋學院，寧波 315211；2. 寧波大學科學技術學院，寧波 315211）

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinases，NDPKs）是一類高度保守的蛋白，大小一般在70-100 kD，在生物體內大多數以六聚體形式存在，僅在少數原核生物中以四聚體形式存在。NDPK主要參與維持核苷二磷酸和核苷三磷酸的平衡。目前在植物中已發現4種NDPK：NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ，相關研究主要集中在前3種。NDPKⅠ與植物生長發育、非生物脅迫、感病應激和激素響應有關；NDPKⅡ參與光合作用和活性氧清除；NDPKⅢ參與能量代謝和細胞程序性死亡；NDPKⅣ僅在擬南芥和水稻基因組中發現，預測定位于內質網，功能未知。除了上述的主要作用外，NDPK在某些植物中還有特殊功能，如參與DNA復制、參與淀粉和纖維素的合成、參與生長素調節和發揮核酶活性等。這些作用機制是否存在物種特異性還有待進一步的研究。對NDPK的系統進化、生物功能的最新進展進行了綜述。最后對NDPK的發展趨勢進行了展望，有助于將來對NDPK進行更深入和全面的研究。

核苷二磷酸激酶；NDPK；系統進化；功能

核苷二磷酸激酶是一類高度保守的基因，其編碼的NDPK在生物體內普遍存在。NDPK的大小一般在70-100 kD，在真核生物中幾乎都是由兩個六聚體組成的復合物，其單體是6個α-螺旋圍繞著一個四股反向平行的β-折疊，只在一小部分的原核生物中以四聚體形式存在。NDPK最早于1953年在酵母和鴿子的組織中發現［1］。在植物中，第一個NDPK于1971年在豌豆中得到分離純化［2］，并于1991年公布了NDPK基因序列。在此后的研究中，從其他植物中發現了NDPK的廣泛存在。

NDPK作為一個激酶，具有催化底物磷酸化的作用。NDPK通過一個兵乓機制首先將核苷三磷酸（Nucleoside triphosphate，NTP）上γ位的高能磷酸集團轉移到其自身，再將高能磷酸集團轉移到不同的核苷二磷酸（Nucleoside diphosphate，NDP）上，形成一個新的NTP，實現核苷二磷酸轉化成為核苷三磷酸的過程，從而維持細胞體內核苷酸代謝的平衡。

NDPK還可以進行自身磷酸化，以達到變構蛋白結構，激活其酶活性的目的。大部分研究者認為，NDPK可能存在兩個磷酸化位點：組氨酸磷酸化位點和絲氨酸磷酸化位點［3-5］。但也有研究者針對組氨酸殘基和絲氨酸殘基的自身磷酸化進行研究，發現組氨酸殘基是NDPK唯一的自身磷酸化位點，實驗中出現的絲氨酸/蘇氨酸位點發生磷酸化是純化該酶時化學處理所造成的實驗誤判［6］。

正因為NDPK的磷酸化及自身磷酸化作用，使得它與生物體的能量代謝、生物合成代謝息息相關。它為生物體提供能量代謝所需的ATP；半乳糖降解、乳糖合成、糖原合成所需的UTP；甘油磷脂合成、蛋白質糖基化所需的CTP；DNA合成、細胞信號轉導、蛋白質延伸、細胞需氧呼吸中能量轉換所需的GTP；為生物體核苷酸合成所需的NTPs。筆者對植物NDPK進行系統進化分析及功能進行綜述，為今后植物核苷二磷酸激酶研究提供參考。

1 NDPK的系統進化分析

本文整理了已發表的不同植物的31個NDPK蛋白質序列、功能等內容（表1），用MEGA 6.06對這31個NDPK蛋白進行遺傳分析，用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構建了分子系統進化樹（圖1）。結果表明，來自不同物種的31個NDPK蛋白被分成4類。進化樹上的聚類結果結合表1中的功能，可以看到功能相近的NDPK親緣關系較近，進化保守，聚為一簇。

2 NDPK I功能

植物NDPK I是4種NDPK中含量最多［56］、活性最強的一個種類［57］。NDPK I作為一個激酶，催化的底物存在多樣性，既可以催化嘌呤也可以催化嘧啶，但其對底物存在偏好，會優先利用底物ATP［58］。但是有研究發現在其他的三磷酸中，它同樣對底物存在偏好。馬鈴薯StNDPK1［7］、菠菜 SoNDPK1［17］、 杜 氏 鹽 藻 DtNDPK1［59］均 優 先利用UTP進行反應。馬鈴薯StNDPK1還表現出對NTP/NDP比率的高度敏感，比率較小時，馬鈴薯StNDPK1酶活性受到抑制，當比率在2-3之間時，該酶活性最高［7］。

植物 NDPK I主要定位于細胞溶膠［7，20，59］，在植物生長發育、非生物脅迫、感病應激、激素響應、DNA復制、淀粉纖維素合等方面起到重要作用。

2.1 參與生長發育

在細胞分裂、分化快速的細胞中，NDPK I提供植物細胞壁前體合成所需UTP，參與胚芽鞘、花、葉、幼苗、根尖、頂芽、果實等組織的生長。

NDPK I對胚芽鞘的生長具有正向調節作用。過表達OsNDPK1的擬南芥表現出下胚軸長度增長、細胞數目增多［21］；轉入了反義OsNDPK1的水稻，胚芽鞘細胞的伸長受到抑制，植株表現出了生長缺陷，植株明顯矮小［22］。

這種功能同樣在分化活躍、分裂旺盛的組織中起到作用。擬南芥AtNDPK1在花序、葉片和根中表達量最高［19］；煙草NtNDPK1在頂芽中表達量最高［11］；大白菜BcNDPK1在幼苗、子葉和雌蕊中大量表達［18］；葡萄VvNDPK1在果實發育早期大量表達［9］；黑麥草LpNDPK1在種子萌發、穎果的發育時大量表達［12］；過表達馬鈴薯StNDPK1的植株表現出根變長的性狀［8］；免疫印跡分析和免疫沉淀分析結果表明馬鈴薯StNDPK1大量存在于分生區和原形成層組織，如：根尖、葉片、塊莖、雌蕊、愈傷組織［7］。此外還發現在馬鈴薯的愈傷組織中StNDPK1的表達不受細胞的年齡影響，而是與細胞的生長能力相關［7］。

2.2 參與非生物脅迫

NDPK I的表達還與非生物脅迫響應相關，在外界脅迫下，NDPK I起到調節作用，但其具體響應機制尚未清晰。在干旱脅迫下，甘蔗幼苗中SoNDPK1從18 h起表達量急劇上升，并于30 h達到峰值，這表明甘蔗通過NDPK I的表達做出對干旱脅迫的應答［14］，同樣表達上調也在煙草［11］和水稻葉［24，31］中發現。在低溫脅迫下，水稻葉片OsNDPK1表達上調、根部OsNDPK4的磷酸化水平提高［25］。在高溫脅迫下，水稻穎果中OsNDPK1表達上調［26］。在熱擊脅迫下，甘蔗細胞培養物中SoNDPK1強烈表達［60］。在高鹽脅迫下，豌豆的根部［10］、大麥的葉子［13］、水稻的根部［27］NDPK I表達量上調，然而煙草幼苗中NtNDPK1在轉錄水平和翻譯水平上均發生下調［11］。近期也有研究表明，在高鹽脅迫下，擬

南芥AtNDPK1的表達與病原體所誘導的促分裂蛋白激酶激酶（MAPKK）呈負相關［20］。這一實驗結果表明AtNDPK1通過MAPK信號途徑來進行對脅迫的調節。當受到機械損傷，番茄幼苗、莖、葉組織中SlNDPK1 表達均發生上調［15］。

表1 植物核苷二磷酸激酶的分類

圖1 NDPK蛋白的系統進化樹

2.3 參與感病應激

當外界病菌侵染時，NDPK I參與植株對抗病原體防御機制。油菜根部感染根癌農桿菌24小時，NDPK I含量增加了1.6倍［61］，這一趨勢同樣發生在油菜感染黑斑菌時［62］。水稻感染白葉枯病菌或伯克霍爾德式菌后，OsNDPK1表達量顯著上調［28］。過表達OsNDPK1的擬南芥植株相對于野生型，抗病基因PR1、NPR1表達量上調，表現出對灰葡萄孢真菌、丁香假單胞桿菌、番茄致病變種細菌的抗性增強。同時，BR信號轉錄調控因子Saur-AC1、轉錄因子BZR1、BES1表達量上升。這表明OsNDPK1通過正調控BR信號轉導來增強植物抗病防御機制［21］。對細菌性條斑病菌JH01誘導的水稻抗病基因進行研究，發現OsNDPK4參與細菌性條斑病菌JH01誘導的水稻防衛反應［29］。

2.4 參與激素響應

多種植物的NDPK I可能參與激素調控機制或在激素信號途徑中起到作用。經脫落酸處理后，煙草NtNDPK1表達量在1 h后到達頂峰，并維持了幾小時［11］。水稻OsNDPK1受到水楊酸、茉莉酸、脫落酸、草甘膦的強烈誘導［13，28，30］。過表達 OsNDPK1 植株促進水楊酸積累基因PAD4和EDS1表達量上調，表現較高的水楊酸含量［21］。水稻OsNDPK4受茉莉酸誘導［28］。

2.5 參與DNA的復制

玉米NDPK I可以結合特殊結構的DNA，從而參與DNA的復制。DNA通常以雙螺旋的結構存在，但在生物中DNA也以一些特殊的結構存在，如鳥苷酸-四聯體結構（G-quadruplex DNA，G4 DNA）。G4 DNA是富含鳥苷酸（G）序列的四鏈形態的DNA二級結構，它在胞體內與其結合蛋白互相作用起到維持端粒穩定，參與DNA復制起始調控等作用。在植物中發現了第一個G4結合蛋白：ZmNDPK1。盡管在之前的研究中發現人類NM23-H2（NDPK同系物）也可以結合富含鳥嘌呤的序列［63］，但是ZmNDPK1對于富含鳥嘌呤的序列結合較弱，具體的NDPK I與G4結合的機制尚未清晰。實驗僅表明ZmNDPK1除了含有一個酶活性位點，還含有一個G4結合位點，二者相互獨立［16］。

2.6 參與淀粉與纖維素的合成

馬鈴薯NDPK I調節淀粉與纖維素的合成途徑中碳元素的分布，從而參與淀粉和纖維素的合成。馬鈴薯StNDPK1正向調節纖維素的含量。在正義StNDPK1轉基因植株中纖維素合成中間物尿苷二磷酸葡糖（Uridine diphosphate glucose，UDPG）和纖維素含量均增加［8］。StNDPK1反向調控淀粉的含量。淀粉合成關鍵酶ADP-蔗糖焦磷酸化酶在反義StNDPK1轉基因植株中含量高；在正義StNDPK1轉基因植株中含量少，同時伴隨著酶的氧化程度高，表現出酶活降低［8］。因此，在反義轉基因植株中積累了更多的淀粉。

3 NDPK II功能

植物NDPK II主要定位于葉綠體中［64-65］，在植物光合作用、清除活性氧和生長素調節機制這幾個方面起到重要作用。

3.1 參與光合作用

NDPK II作為一個光調控蛋白激酶，通過與光敏色素相互作用，參與植物的光合作用。在20世紀90年代第一次發現NDPK活性與植物對紅光［66］、藍光［67］響應存在聯系。隨后的實驗發現AtNDPK2基因與光敏色素A、光敏色素B互作，以響應植物對紅光和遠紅光反應的應答［33，68］。紅光刺激黃化的豌豆PsNDPK2磷酸化水平上升［39］。燕麥的Ser598Ala突變體植株對光更敏感，研究者發現這是由于Ser598的磷酸化抑制了光信號傳導途徑中NDPK II與光敏色素A的互作［69］。據此推斷NDPK II可能是植物光合作用的必要因素。在紅光下，黃化燕麥中活化的光敏色素A與NDPK II相互作用，刺激它的激酶活性，使自身磷酸化以及磷酸化作用增強［70］，另一個實驗表明黃化燕麥胚芽鞘中NDPK II活性增加了約42%［57］。這表明NDPK II是一個光調控蛋白激酶。擬南芥ndpk2突變體表現出對紅光和遠紅光響應的部分缺失，子葉不能張開及綠化缺陷，這表明AtNDPK2是擬南芥光敏色素介導的光信號轉導途徑的正向調節因子［33-35］。

在黑暗中，豌豆幼苗PsNDPK2磷酸化受抑制，不再結合磷酸基團進行磷酸化［40］。將大白菜幼苗從黑暗環境轉移到光照環境中，BcNDPK2表達急劇增加［18］。擬南芥AtNDPK2還與植物特有的Rho小G蛋白的ROP蛋白家族相互作用，可以激活鳥苷三磷酸酶（GTPase），有研究者認為AtNDPK2可能是光敏色素介導的信號與G蛋白介導信號中缺失的一環［36］。

3.2 參與清除活性氧

光合作用是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和H2O2的一個重要來源，而定位在葉綠體上的NDPK II參與MAPK級聯反應，從而在清除活性氧中起到重要作用。NDPK II與氧化脅迫呈正相關。經H2O2處理，水稻根部OsNDPK2表達上調［42］。轉入 AtNDPK2 的苜蓿植株［71］、甘薯植株［72］、白楊植株［73］對氧化脅迫的耐受性增加。轉入AtNDPK2的水稻植株，清除超氧化物和過氧化氫等活性氧自由基的基因OsAPX1，OsAPX2和OsSodB表達量增加［35］，同時表現出對20% PEG的滲透壓力、100 mmol/L NaCl的鹽分脅迫、紫外線照射和臭氧處理有很高的耐受性［74］。轉入AtAPX1的煙草BY-2細胞系，NtNDPK2與AtAPX1相互作用，調節ROS含量［32］。

研究者構建過氧化物酶SWPA2的啟動子與AtNDPK2基因的表達載體轉入甘薯中，發現該轉基因植株對甲基紫精的耐受性增強，經甲基紫精（Methyl viologen，MV）處理，該轉基因植株的3個抗氧化酶（過氧化氫酶、抗壞血酸鹽酶、過氧化氫酶）活性均增加，表現出對低溫、干旱脅迫耐受性增強［77］。這表明AtNDPK2可以有效地調節源自于環境壓力所引起的過氧化物。同樣的表達載體也轉入到馬鈴薯中，轉基因植株也出現同樣的表型［76］。

通過酵母雙雜交實驗，發現AtNDPK2參與各種脅迫因子激活的信號途徑，與SOS2蛋白激酶相互作用［38，76］、誘導與壓力信號轉導途徑相關的兩個絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）：AtMPK3和 AtMPK6的磷酸化［38］。有研究表明，它還與過氧化氫酶CAT2、CAT3相互作用［77］，在豌豆［41］和擬南芥［37］中也發現 NDPK 可以直接與CAT亞型互作。過表達AtNDPK2的擬南芥植株，過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶的表達均增加［78］，表現出ROS、H2O2含量降低［38］。這表明NDPK II通過調節細胞的氧化還原條件在ROS、H2O2介導的MAPK級聯反應中起到作用［38］。

3.3 參與生長素傳導

NDPK II還可能參與了生長素傳導途徑。擬南芥ndpk2突變表現出下胚軸的變短［33］，對生長素極性運輸抑制劑的更高敏感度，對生長素的運輸增強，其中NDPK II充當激素轉運體的角色［34］。敲除AtNDPK2的植株表現出根及幼苗生長緩慢［38］。

4 NDPK III功能

植物NDPK III主要定位于線粒體的膜間隙［47］、內膜［47］和葉綠體類囊體膜［79］中，主要參與能量代謝和其他核苷酸代謝酶間的互作、細胞的程序性死亡這幾個方面起到重要作用。此外，在油菜中，它作為激酶還可以使自交不親和關鍵因子SRK的激酶域磷酸化［81］。

4.1 參與能量代謝

位于線粒體內膜的NDPK III通過與腺嘌呤核苷酸轉運體相互作用，參與細胞的能量代謝。Northern印跡分析表明：在豌豆的不同發育階段，PsNDPK3表達量不同，與老葉相比在嫩葉中NDPK III表達量更高［46］，在生殖器官（花及豆莢）中表達比其在營養組織（根、葉）中高［47］。擬南芥快速分裂的花序和根部等對線粒體需求較大的組織中，AtNDPK3的表達量更高，擬南芥花發育后期的絨氈層、胚珠及花瓣中，AtNDPK4的轉錄水平增加［19］。在大白菜中，也發現此種現象［18］。這種結果可能是與線粒體呼吸活動的下降相關［19］。

免疫共沉淀實驗發現豌豆線粒體膜上的PsNDPK3與線粒體內膜上腺嘌呤核苷酸轉運體相互識別［48］，以此來介導細胞質基質中ATP的合成和胞漿中ADP的交換。用呼吸代謝的產物蔗糖或葡萄糖處理擬南芥葉片后，AtNDPK3的表達上調，AtNDPK4轉錄水平略微受到的抑制［54］。有研究者提出AtNDPK4可能對AtNDPK3起到一個補充作用［19］。蔗糖誘導擬南芥基因AtWRKY4和AtWRKY34，在wrky4突變體中，葡萄糖誘導的AtNDPK3下調了了38%，而在wrky34突變體中，蔗糖處理后，AtNDPK3 上調了 31%［54］。

4.2 參與細胞程序性死亡

位于線粒體膜間隙的NDPK III通過與腺苷酸激酶（AK）相互作用，來參與細胞的程序性死亡［81］。熱擊處理煙草BY-2（Bright Yellow-2）細胞系，在細胞程序性死亡早期，煙草NtNDPK3活性受抑制，導致腺苷酸平衡的失調［45］。同樣在豌豆中，也存在這一調節機制［49］。通過親和層析純化分離出維持豌豆細胞中腺苷酸的動態平衡的腺苷酸激酶，發現其與線粒體膜間隙中的PsNDPK3相互作用［50］；重組酶的體外實驗表明腺苷酸激酶刺激NDPK的活性，NDPK抑制腺苷酸激酶的活性［51］。同時cAMP以及Ca2+對二者均起到抑制作用［52］。

4.3 具有核酶活性

豌豆NDPK III可以作為核酶，裂解DNA。豌豆PsNDPK3可以裂解多種特殊結構的DNA，如超螺旋質粒DNA、高度結構化的RNA：tRNA、線粒體基因atp9 mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR），這表明NDPK III具有核酶活性，但是對核酸的結構有一定要求。ndpk3突變體（H117D，S69A）中PsNDPK3的核酶活性仍然存在，這表明NDPK III的核酶活性和激酶活性相互獨立，互不干擾［53］。

5 NDPK IV功能

植物NDPK IV基因僅從擬南芥和水稻的基因組中發現。二者序列相似度達67%。均含有一個內質網保守信號HDEL序列，故預測其定位于內質網。關于其具體功能，尚未有研究。

6 結語

NDPK除了作為激酶起到磷酸化及自身磷酸化作用維持植物體內核苷酸平衡外，NDPK I主要參與植物生長發育、非生物脅迫、病菌應激、激素響應；NDPK II主要參與光合作用、清除活性氧；NDPK III主要參與能量代謝、細胞程序性死亡。對植物NDPK的研究已有多年，在大多數植物中均發現了NDPK的存在。盡管如此，目前的研究仍然集中在前3種NDPK，NDPK IV的研究目前仍停留在對其序列的生物信息學分析，對NDPK IV深入研究，可能發現NDPK的新功能。

NDPK除了起到以上的作用外，還有一些特殊的功能。例如，在玉米中發現可以結合DNA的G4結構NDPK I；在馬鈴薯中發現參與淀粉和纖維素合成的NDPK I；在擬南芥中發現參與生長素傳導的NDPK II；在豌豆中發現具有核酶活性的NDPK III。此外，雖然有實驗證明豌豆NDPK III的核酶活性位點與其激酶活性位點相互獨立，但其核酶活性位點尚未確定。NDPK在其他植物中是否也存在這些特殊的作用機制，需要進一步的研究。

值得注意的是，4種NDPK中NDPK I在抵抗環境脅迫中起到重要作用、NDPK II通過參與MAPK級聯反應抵抗氧化脅迫，起到清除活性氧的功能。針對NDPK這類功能進行深入研究，有助于提高植物對抗環境脅迫，培育植物抗逆新品種。

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Research Advances of NDPKs in Plants

ZHU Xin-ni1WANG Shan-shan1ZHOU Jia-qin2ZHU Shi-hua2
（1. School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211 ；2. College of Science and Technology，Ningbo University，Ningbo 315211）

Nucleoside diphosphate kinases（NDPKs）are a class of highly conserved proteins with a size between 70 to 100 kD. They exist as hexamers in most organisms while as tetramers only in few prokaryotes. NDPKs are mainly responsible for keeping the in vivo cellular balance between nucleoside diphosphates and nucleoside triphosphates. Four types of NDPKs，i.e.，NDPK Ⅰ，NDPK Ⅱ，NDPK Ⅲ and NDPK Ⅳ，are found in plants，however，till now researches have been mainly focused on the first three. NDPKIs are found to be involved in plant growth and development，and response to abiotic stress，pathogens and hormones. NDPK Ⅱ s take part in photosynthesis and removal of reactive oxygen species. NDPKIIIs are involved in energy metabolism and programmed cell death. NDPKIVs are only found in Arabidopsis and rice genomes and predicted to be located in endoplasmic reticulum with unknown function. Besides，NDPKs also display special functions in certain plants，such as DNA replication，starch and cellulose synthesis，auxin signaling and ribozyme activities；however，whether these functions are species-specific needs further study. This article summarizes the phylogenetic analysis and the most recent research progress on biological functions of NDPKs. Finally，the article discusses the prospect of NDPKs research，thus it will facilitate the in-depth and comprehensive study of their function in plants in the future.

nucleoside diphosphate kinase；NDPK；phylogeny analysis；function

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0261

2017-04-01

國家自然科學基金項目（31371595）

朱馨妮，女，碩士研究生，研究方向：水稻根系發育；E-mail：xinnizhu@163.com

朱世華，博士，教授，研究方向：水稻分子生物學；E-mail：zhushihua@nbu.edu.cn

（責任編輯 狄艷紅）