RNAi技術的最新研究進展

王偉偉 劉妮 陸沁 凌曉霏 陳航，2

（1. 中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，昆明 650224）

RNAi技術的最新研究進展

王偉偉1劉妮1陸沁1凌曉霏1陳航1，2

（1. 中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，昆明 650224）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物中由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發同源mRNA降解，使靶基因沉默的現象。目前，RNAi技術作為基因調控的有效工具，具有高度特異性、高效、可傳播等特點，被廣泛用于病蟲害防治、腫瘤及癌癥治療等領域。尤其在醫學上的應用，相對于傳統的疫苗預防和藥物治療而言，RNAi技術在靶點用藥、減少副作用、抑制致病基因表達等方面具有不可比擬的優越性，在癌癥等疾病治療的新方法中發揮越來越重要的作用。主要介紹RNAi的作用機理、導入方法及其在植物改良、生物防治、昆蟲抗藥性、疾病的預防與治療中的最新應用進展，并對其應用前景進行綜合分析與評價，以期為相關領域的研究者提供參考。

RNAi；dsRNA；shRNA；轉基因法；作用機理

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在真核生物中，由雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）誘發同源mRNA降解，使靶基因表達沉默的現象［1］。1998年，Fire等［2］用 dsRNA沉默秀麗隱桿線蟲中相應的mRNA，闡述了基因沉默現象的本質，并將其特異性基因轉錄后沉默的這一現象稱為 RNA干 擾。2000年，Wianny和 Svoboda等［3-4］先后發現在小鼠的胚胎細胞和卵母細胞中dsRNA能引發RNAi效應。2002年，Brummelkamp等［5］在小鼠體內構建表達載體pSUPER，使用該載體能持續抑制目的基因表達，為RNAi技術在基因治療方面奠定基礎。RNAi為人們了解生命提供了新視角，并為醫學發展提供了新工具，2006年Craig Mello 和Andrew Fire由于在RNAi機制研究中所作出的貢獻，獲得諾貝爾生理及醫學獎。本文針對RNAi的作用機理、導入方法及其在植物改良、生物防治、昆蟲抗藥性、疾病的預防與治療中的最新應用進展做較為詳盡的綜述，旨為相關領域的研究者提供參考。

1 RNAi的作用機理及特點

1.1 RNAi的作用機理

RNAi的作用過程分為起始、效應、擴增3個階段（圖1）。（1）起始階段：加入的dsRNA被Dicer酶切割為21-23 nt大小的siRNA片段；（2）效應階段：siRNA雙鏈在細胞質中結合一個核酶復合物形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。解旋酶將siRNA雙鏈解旋為單鏈，單鏈中的引導鏈（Guide strand）與靶mRNA通過堿基互補配對而結合，在ATP供能的情況下，RISC中核酸內切酶slicer切割靶mRNA，將mRNA切割降解，阻止其翻譯，引起靶基因轉錄后水平的沉默［6］；（3）擴增階段：siRNA與mRNA結合，并作為引物，在RNA聚合酶（RdRp）作用下再次形成dsRNA，然后重復起始階段和效應階段，從而進一步放大RNAi的作用，最終將靶mRNA完全降解。

圖1 RNAi的作用機理［7］

1.2 RNAi技術的特點

1.2.1 高效性 細胞內的RNAi途徑存在級聯放大效應，極少量的dsRNA經起始階段—效應階段—擴增階段的循環就能產生強烈的RNAi效應，以維持高效的干擾作用。

1.2.2 特異性 RNAi只特異地降解同源mRNA，而其他mRNA表達則不受影響，從而準確沉默目的基因。

1.2.3 位置效應 Holen 等［8］根據 TF（Tissue factor）不同位置的dsRNA對基因沉默效率的影響，結果表明dsRNA對mRNA的結合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。

1.2.4 ATP依賴性 RNAi是一個ATP依賴的過程，在沒有ATP時發現RNAi現象降低或消失，可能是由于在Dicer和RISC的酶切反應過程中必須要ATP提供能量［9］。

1.2.5 可傳播性 可以跨越細胞界限，在不同細胞甚至生物體間長距離傳遞和維持，使RNAi擴散到整個機體并可傳遞給子代［10］。

2 RNAi的方法

RNAi有注射、喂食、浸泡、病毒感染、轉基因等方法（表1），較常用注射法、喂食法和浸泡法。在RNA干擾研究的初期，注射最初主要應用于線蟲［2］；隨著在果蠅中運用的開展［11］，其逐漸成成為有效引入dsRNA的方法之一。目前已在煙草天蛾（Manduca sexta）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）等研究對象中建立了注射dsRNA誘導RNAi的體系，此方法通過將dsRNA或siRNA注射到昆蟲或其他研究對象的特定部位，迅速到達靶位點，以實現其作用的快速性與高效性。但當研究對象個體過小時，注射難度增大且成活率降低的問題仍無法解決。由于操作帶來的局限性，使其很難用于大規模分析。喂食法最早應用于秀麗隱桿線蟲，用含有dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲后，其表現為部分功能缺失或產生突變體的表型［12］，喂食法由此成為RNAi中有效引入dsRNA的另一手段。目前主要應用的喂食法有3種：第1種是細菌喂食法，在細菌中表達dsRNA，通過喂食細菌來實現；第2種是直接喂食法，在體外合成dsRNA，并將dsRNA混入食物或溶液中直接喂食。這種喂食法在馬鈴薯甲蟲中得到了成功應用［13］，但在果蠅實驗中發現該方法并不能使果蠅引起RNAi［14］；第3種手段是通過表達dsRNA的轉基因植物，將昆蟲基因作為靶標，提高植物的抗蟲性［15］。研究發現，利用此方法可使馬鈴薯中的葉綠體產生大量的馬鈴薯甲蟲β-actin基因的dsRNA，從而代替化學殺蟲劑，使取食馬鈴薯葉片的馬鈴薯甲蟲在幼蟲時期死亡［16］。喂食誘導RNAi因其操作簡單方便，對研究對象危害性小等特點，可大量用于高通量的基因實驗。但喂食法均存在作用較慢、效率較低的缺點。近年來，在RNAi實驗中，將材料直接浸泡在dsRNA溶液中，因其操作簡便，周期短而得到廣泛應用，也稱其為細胞外RNA干擾［17］。2000年，Clemens等［18］第一次利用果蠅胚胎的S2細胞進行了浸泡實驗并取得成功，目前浸泡法在雙翅目的黑腹果蠅和鱗翅目的家蠶中成功率比較高。

表1 dsRNA不同轉運方式優缺點比較［17，19］

3 RNAi技術的應用

3.1 RNAi技術在農業領域的應用

3.1.1 植物改良中的應用 通過RNAi技術對植物抗逆相關基因挖掘及功能的研究，對于培育具有較強抗逆性的植物新品系至關重要。高夢燭等［20］通過構建RNAi膜蛋白（Putative membrane related protein，PMRP）載體，將PMRP-RNAi載體導入轉基因擬南芥；用于分析PMRP對擬南芥抗寒性的影響，結果表明PMRP表達量降低可增強擬南芥的抗寒性，為增強作物抗逆性提供理論依據。NAC蛋白在植物適應環境和抵御逆境脅迫中起重要作用，2017年，Wang等［21］對剛毛檉柳Tamarix hispid的NAC型轉錄因子ThNAC13在鹽和滲透脅迫的反應進行了功能分析，通過RNAi技術沉默ThNAC13發現剛毛檉柳對鹽和滲透脅迫的耐受性降低。結果表明，ThNAC13是遺傳育種中增強鹽和滲透脅迫耐受性的重要基因。利用RNAi篩選與抗逆性相關的基因，從而改良植物使其具有抗寒、抗鹽脅迫等抗性，將有利于植株在逆境中生存。

3.1.2 生物防治中的應用 害蟲對農業生產造成巨大的損失，是制約農業生產持續穩定發展的重要因素之一，生物防治作為高效且無污染的方法逐漸成為最理想的防治手段。在生物防治領域，RNAi技術有廣泛的應用前景，其對害蟲控制策略在于選擇合適的靶基因。近幾年來，隨著RNAi技術的發展，對未知基因功能的研究越來越多，在害蟲防治中也發現了一些合適的靶基因。2015年，Xu等［22］在對稻飛虱長短翅的研究中發現，以褐飛虱Nilaparvata lugens為模型，褐飛虱兩個同源性極高的胰島素受體InR1和InR2在長、短翅分化中起著決定性作用。當利用RNAi技術沉默InR2使其含量降低時，長翼變形，這對開發新型褐飛虱治理技術具有重要價值，也可為其他害蟲的防治提供新的策略。海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）在昆蟲發育中起著關鍵作用，2016年，Tang等［23］對赤擬谷盜Tribolium castaneum中與幾丁質相關的5種海藻糖酶基因的功能研究發現，在用RNAi技術沉默這5種基因時，觀察到有異常表型出現，赤擬谷盜的死亡率在17%-42%之間，結果表明通過沉默海藻糖酶基因來調節基因表達從而使其蛻皮畸形和產生高的死亡率。2017年，Yang等［24］利用RNAi技術將褐飛虱Nilaparvata lugens體內的海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1和TPS2敲除，褐飛虱出現異常表型，有30%的昆蟲死亡。通過數字基因表達譜（DGE）分析顯示，TPS基因的沉默可導致蛻皮畸形，并參與甲殼素代謝基因的調控，他們認為TPS基因在未來是潛在的害蟲控制目標。

RNAi技術在病害防治中也有廣泛的應用。番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是危害番木瓜生產的致命性病原，并制約番木瓜產業的發展。2017年，黃靜等［25］為了培育出對海南地區PRSV種群具特異抗性的番木瓜新品種，根據RNAi原理構建抗PRSV表達載體pCAMBIA2300-35S-CPRNAi-OCS，將載體導入番木瓜的愈傷組織中，通過抗病毒試驗分析表明，轉基因株系474和非轉基因株系1280相比對PRSV有較好抗性，但要獲得廣譜抗PRSV的植株還有待于進一步田間試驗。白粉病是限制瓜葉菊生產和推廣的主要病害，王丹等［26］構建了Mlo基因的RNAi載體質粒Ptck303-Mlo-RNAi，構建了瓜葉菊‘大花’高頻再生體系。并導入到農桿菌中進行瓜葉菊的遺傳轉化，為培育抗白粉病的瓜葉菊新品系奠定基礎。

3.1.3 昆蟲抗藥性中的應用 隨著化學殺蟲劑大范圍、大劑量重復使用，一些害蟲對殺蟲劑產生很強抗性，深入探究昆蟲抗性機理，有助于抗性的有效治理，RNAi技術為害蟲抗藥性機理的研究提供了有效途徑。2014年，Hu等［27］經過研究發現，昆蟲體內細胞色素P450基因家族中CYP321E1在抗藥性中起的作用很大，對此，研究人員利用RNAi技術，將dsRNA通過注射輸送到小菜蛾Plutella xyllostella體內，從而降低CYP321E1基因的表達，經過24 h觀察發現小菜蛾幼蟲死亡率增加，這將為解決昆蟲對抗藥性的難題提供新的思路。2015年，Guo等［28］對小菜蛾Plutella xyllostella抗藥性的研究表明，利用RNAi技術沉默ABCG亞家族的ABC轉運蛋白基因，能使小菜蛾幼蟲對CryiAc毒素的敏感性降低，從而對小菜蛾抗藥性有一定的作用。

3.2 RNAi技術在醫學中的應用

3.2.1 疾病預防中的應用 肉類安全問題一直受到社會各界的廣泛關注，其中牲畜疾病是嚴重威脅肉類安全的主要因素，因此對動物疾病的預防備受關注。RNAi技術在疾病預防中發揮著重要的作用，如在口蹄疫（FMD）的預防和流感病毒（H1N1）的控制中都有相關研究。2014年，Li等［29］通過siRNA產生對PRRSV特異性表達的轉基因（TG）豬，經過TG豬與NTG對照發現，體內siRNA表達使豬血清HP-PRRSV含量顯著降低，并且增加了3 d的存活時間，RNAi技術為家畜抵抗病毒感染提供可能性。2016年，Linke等［30］針對禽流感病毒（AIV）的核蛋白（NP）和聚合酶酸性蛋白（PA），利用siRNA細菌載體遞送到禽黏膜上皮細胞，結果發現這種新型抗AIV載體能夠抑制AIV并將病毒滴度降低10 000倍。siRNA載體技術可作為一種新型的抗病毒方法，用于禽流感、人類流感的抗病毒技術和基于RNAi的載體的其他病毒。

3.2.2 疾病治療中的應用 在傳統的腫瘤和癌癥治療中，多應用化療法來有效的殺死腫瘤和癌癥細胞，但其作用于腫瘤和癌細胞的同時也對正常細胞產生影響，從而導致正常細胞死亡。利用RNAi技術對靶位點局部用藥，盡量減少用藥給機體帶來的副作用，是腫瘤和癌癥治療的重要發展方向。2016年，Wu等［31］利用 RNAi沉默 PIK3CA和PIK3CB基因來抑制人類結腸直腸癌（CRC）組織中的致瘤性，結果表明PIK3CA和PIK3CB可以作為結腸直腸癌的潛在治療藥物靶點，對CRC患者提供個性化治療方案并能夠緩解癌細胞在化療時的抗性。埃-巴病毒（EBV）引起的胃癌（EBVaGC）作為惡性腫瘤最常見的胃癌（GC）之一，通過傳統方法如手術、放射治療和化學治療等很難完全清除腫瘤細胞。2017年，Wang等［32］應用慢病毒介導的RNAi抑制EBV陽性胃癌GT38細胞系中的潛伏膜蛋白2A（LMP2A）基因表達發現，細胞的增殖被顯著抑制，凋亡率增加。因此，LMP2A將是EBVaGC治療的潛在靶標，可作為開發抑制腫瘤細胞生長或治療EBVaGC的新方法。

RNAi技術可抑制致病基因的表達，用于治療癌癥和其他疾病是一種極為有效的策略，但面對大多數疾病，如何將干擾載體高效率、安全的運送到靶位點還是一個挑戰。2015年，Weinstein等［33］在對一種侵襲性B細胞淋巴瘤（MCL）的研究中發現其細胞周期蛋白D1過表達，他們設計了涂有抗CD38單克隆抗體的脂質基納米粒子（LNP），該抗體被人為的使MCL細胞吸收并異種移植到小鼠的骨髓中，利用RNAi技術可使LNP誘導MCL細胞中的基因沉默，細胞周期蛋白D1的表達下降，并能延長帶病小鼠的存活時間，從而獲得一種新的RNAi遞送系統。2015年，Cohen等［34］在對多形性成膠質細胞瘤（GBM）的研究中，利用RNAi技術使透明質酸（HA）移植的脂質納米顆粒（LNP）直接到GBM位點。在小鼠實驗中可使mRNA水平降低80%以上，對于腫瘤的治療的遞藥系統提供新的思路。

4 結語

基因測序技術的發展為我們獲取大量的基因信息提供了技術保障，RNAi作為一種對基因表達具有特異性的抑制機制，為未知基因功能的研究提供了技術平臺，成為研究基因功能的最有利的工具。同時RNAi技術具有簡單、快速、重復性好等特性，可成為研究細胞信號傳導通路的新策略。此外，RNAi可抵抗病毒入侵、防止突變基因過量增殖等作用，可成為開展基因治療的新途徑。

目前，RNAi技術以快速、可靠、操作簡單的特點被廣泛應用在植物改良、生物防治、疾病預防和治療等領域，雖在實驗室條件下取得初步成果，但在實際應用中還存在一些問題。如siRNA不僅可與靶基因特異性結合，也可與非靶基因結合使其基因沉默，出現脫靶效應（Off-target effect）［35］。脫靶效應的產生嚴重影響RNAi應用，已成為RNAi技術從實驗到臨床轉化過程中面臨的一個重要問題。然而隨著高通量測序和轉錄組的發展，篩選出合適的靶基因并對特定的靶基因用藥將可有效解決脫靶問題。還有如何提高靶基因的沉默效率有待于研究，可將dsRNA進行特定的包裝和修飾，讓靶基因更好的吸收，從而提高靶基因的沉默效率。

隨著對分子生物學研究的不斷深入，RNAi技術作為一種新的基因阻斷技術，必將從實驗階段走向實際應用，在功能基因研究、基因表達調節機制、植物改良、病害蟲防治和醫學領域中的基因治療、耐藥物細胞模型的建立和篩選、新藥開發等方面將有廣泛的發展前景。

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Latest Research Progress on RNA Interference Technology

WANG Wei-wei1LIU Ni1LU Qin1LING Xiao-fei1CHEN Hang1，2
（1. Research Institute of Resources Insects，Chinese Academy of Forestry，Kunming 650224 ；2. Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects，State Forestry Administration，Kunming 650224）

RNA interference（RNAi）is a phenomenon in which the target gene is silenced by double-stranded RNA（dsRNA）inducing homologous mRNA degradation in the eukaryotic cells. At present，RNAi technology，as an effective tool for gene regulation，is widely used in pest control，cure of tumor and cancer duo to its high specificity，high efficiency，transmission and other characteristics.Especially in the medical application，compared with the traditional vaccine prevention and drug therapy，RNAi technology has unparalleled advantages of target medication，reducing side effects and inhibiting the expression of virulence genes，thus it plays an increasing significant role in the new treatment methods of cancer and other diseases. The mechanism，introducing methods of RNAi and its latest application in plant improvement，biological control，insect resistance，disease prevention and treatment are synthetically analyzed and evaluated in this paper，for providing the reference for researchers in related fields.

RNAi；dsRNA；shRNA；transgenic method；action mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0455

2017-06-02

國家林業局948 項目（2014-4-66），中央級公益性科研院基本科研業務費專項（CAFYBB2014ZD005）

王偉偉，男，碩士研究生，研究方向：資源昆蟲分子生態；E-mail：sk121www@163.com

陳航，男，博士，研究員，研究方向：資源昆蟲學；E-mail：stuchen6481@gmail.com

（責任編輯 朱琳峰）