蛋白激發子PeaT1與井岡霉素混合使用誘導煙草對TMV抗性的研究

彭智超 仝贊華 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

蛋白激發子PeaT1與井岡霉素混合使用誘導煙草對TMV抗性的研究

彭智超 仝贊華 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

煙草病毒可侵染危害煙草、番茄、辣椒和土豆等多種作物導致病毒病發生，是生產上難以防治的病害。為了探索蛋白激發子PeaT1與井岡霉素混合使用對煙草病毒病防治的最佳混配比例，本研究選用3-7片真葉的本生煙（Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu），分別噴施清水、井岡霉素、蛋白激發子PeaT1及蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合制劑，采用摩擦接種的方式接種TMV-GFP病毒，在紫外光下觀察病毒的侵染情況。結果表明，噴施了井岡霉素和蛋白激發子復合制劑的本生煙對TMV的抗性較單劑具有增效作用，其中蛋白激發子PeaT1-井岡霉素按3：4混配的性價比最高，共毒系數達到157.64，相對防效為73.39%。這說明井岡霉素和蛋白激發子PeaT1都能使煙草產生對TMV的系統獲得抗性，而其復合制劑更有著疊加效應。

蛋白激發子；井岡霉素；誘導抗性；TMV-GFP

煙草病毒能侵染危害煙草、番茄、辣椒和土豆等多種作物。20世紀50年代以來，病毒病先后在世界各國農作物上發生，煙草花葉病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）具有種類多、分布廣的特點，給農業生產造成了巨大損失，成為主要病害之一［1］。PeaT1是從極細鏈格孢菌中分離的一種能誘導植物廣譜抗性的蛋白激發子［2］，能誘導植物提高自身的免疫抗性，對多種植物病毒病有較好的控制作用［3］。因此，利用蛋白激發子作為植物免疫誘導劑，通過激發植物自身的免疫防御系統以控制農作物病毒病，具有安全、高效和防效持久的優點，是當前農業生產上控制植物病毒病的有效措施之一。井岡霉素是由吸水鏈霉菌井崗變種產生的抗生素，對控制水稻紋枯病有特效，已推廣使用多年，表現出良好的抗病增產效果，但其對防治病毒病是否有效還未見報道。張穗等［4］曾報道，井岡霉素能夠誘導水稻抗病性。為了明確井岡霉素對病毒病的作用效果，以及其與蛋白激發子PeaT1聯合使用對水稻病毒病等的防治效果，本研究以模式植物煙草為例，驗證井岡霉素以及蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合劑對煙草花葉病毒病（TMV）的防控效果，以期為新型復合生物藥劑同時防治多種農作物病害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 本生煙（Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu）播種于防蟲溫室的苗盤中，溫度25-30℃，光照14 h 條件下土培（滅菌土∶草炭土∶蛭石= 1∶1∶1）生長，待長至3-4 葉齡時移栽到直徑為13 cm 的花盆中，每盆1-2株。4-5葉期時用于配方篩選試驗，5-7葉期用于抗藥性試驗。

1.1.2 TMV-GFP［5］TMV-GFP 病毒是將綠色熒光蛋白（GFP）插入TMV病毒的外殼蛋白（CP）與開放閱讀框（ORF）之間所構成的重組病毒，重組病毒的侵染和移動不受影響［6］。TMV-GFP病毒在UV燈的照射下會發出綠色熒光以便觀察［7］，在可見光的照射下沒有明顯枯斑反應。攜帶TMV-GFP的農桿菌由清華大學劉玉樂教授饋贈。

1.1.3 供試藥劑 井岡霉素（60%，浙江龍游東方農藥有限公司生產）、蛋白激發子PeaT1可濕性粉劑（3%，河南普綠通生物科技有限公司生產）、蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合制劑（自行配制）。

1.2 方法

1.2.1 TMV-GFP的制備與接種 在LB培養基（含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平）中發酵培養攜帶TMV-GFP的農桿菌GV3101，28℃、200 r/min、36 h；將發酵液離心，加少量ddH2O重懸，獲得TMV-GFP懸浮液。將少量的金剛砂撒在待接種葉片上，取10 μL TMV-GFP懸液點滴在葉片上［8］，用棉棒在葉片上輕輕摩擦接種。接種后的葉片用水輕輕沖洗，置于25℃黑暗培養12 h后放回溫室培養。3-5 d后觀察葉片在UV燈照射下可見大面積熒光時，將葉片在液氮中研磨成粉。按1∶3體積比加ddH2O，4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液冰浴備用。為保證病毒活性，農桿菌侵染的葉片暫時不用的情況下應于-80℃冰箱保存，病毒上清液應在使用前配制。

1.2.2 復合制劑配方的篩選 將蛋白激發子PeaT1和井岡霉素按質量比為（3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5）稱取后均勻混合，備用。參照殺菌劑農藥室內生物測定實驗準則（農業部行業標準 NY/T1156.14-2008）和創制生物農藥活性評價SOP（殺菌劑卷），采用噴霧法處理煙草。試驗煙草幼苗分別用不同的混配藥劑，采用1 000 mL手動噴霧器對煙草全株進行均勻噴霧處理，以清水為對照，與蛋白激發子PeaT1或井岡霉素的單劑處理分別進行對比。每處理設3個重復，在施藥后5 d接種煙草花葉病毒、接種后10 d調查不同處理對煙草花葉病毒的防治效果。使用孫文沛的共毒系數法［9］計算共毒系數：

理論混用毒力指數（TTI）=A的毒力指數A在混用中的含量（%）+B的毒力指數B在混用中的含量（%）

共毒系數大于120為增效作用；若小于80為拮抗作用；若大于80小于120，表明為相加作用。

1.2.3 復合制劑誘導煙草系統抗性試驗 試驗設3個實驗組：清水CK、井岡霉素、蛋白激發子PeaT1、蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合制劑（3∶4配方）。將5-7片葉的煙草苗用紙袋套住上三片葉，用各處理的1 000倍稀釋液噴施植株。48 h后在套袋葉片上摩擦接種TMV-GFP病毒。在接種TMV-GFP病毒后，從72 h開始每隔24 h調查一次，每次每處理調查15片葉，連續調查4次。將調查得到的病斑數據用 SPSS Statistics 19進行方差齊性檢驗、單因素方差分析、LSD、Duncan多重比較，計算相對防效。

2 結果

2.1 蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合制劑配方篩選

單劑生物活性測定結果表明，蛋白激發子PeaT1對煙草花葉病毒病的防效達到47.0%-57.0%，井岡霉素單劑對煙草花葉病毒病的防效達到27.0%-32.0%。蛋白激發子PeaT1·井岡霉素5個配比的生物活性測定結果見表1。

毒力指數和共毒系數分析結果（表2）表明，蛋白激發子PeaT1和井岡霉素質量比為（3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、3∶5）時均表現為控制煙草花葉病毒病具有增效作用，其中蛋白激發子PeaT1和井岡霉素質量比為3∶4時增效作用的性價比為最好。

2.2 不同藥劑誘導本生煙的局部抗性比較

從表3中可以看出，在接病毒后72 h、96 h、120 h的計數結果，蛋白激發子PeaT1-井岡霉素、井岡霉素、蛋白激發子PeaT1與清水對照差異性極顯著，井岡霉素和蛋白激發子PeaT1單劑間沒有顯著性差異；在144 h時4者之間差異性極顯著（圖1）。蛋白激發子PeaT1-井岡霉素復合制劑（3∶4）相對防效最佳，達到了73.39%。

表1 蛋白激發子PeaT1與井岡霉素不同質量配比制劑對煙草花葉病毒病作用的測定

表2 蛋白激發子PeaT1與井岡霉素不同質量配比制劑對煙草花葉病毒病的毒力指數和共毒系數分析

表3 不同藥劑誘導本生煙幼苗抗TMV病毒的效果測定

3 討論

圖1 各處理對本生煙抗TMV-GFP病毒能力

煙草病毒病是嚴重影響我國農作物生產的主要病毒病害之一，造成的經濟損失巨大。目前生產上防治煙草病毒病主要通過土壤消毒、隔離毒源等方法進行控制，沒有直接作用于作物本身的有效藥物。趙秀云［10］等研究發現一種青霉蛋白激發子EPTP可以誘導煙草產生系統獲得性抗性，能夠引起煙草葉片抗性基因轉錄水平上調，并誘導水楊酸茉莉酸途徑相關抗性基因的表達。廖建松等［11］研究表明蛋白激發子PeaT1與氨基寡糖素的復合制劑對煙草花葉病防效達到了88.73%。李宏光等［12］研究表明7%井岡霉素·極細鏈格孢蛋白激發子PeaT1可濕性粉劑對煙草病毒病的防治效果在60%以上。蛋白激發子PeaT1主要是通過提高植物自身的免疫系統從而增強煙草對于煙草花葉病毒病的抗性［13］。井岡霉素是一類開發較早的抗生素，它能夠進入煙草植株體內對感染植物的菌類進行抑制而達到殺菌效果［14］。井岡霉素作為抗生素類內吸性殺菌劑，在抗病毒病上一直鮮有報道，而蛋白激發子PeaT1在誘導植物自身抗病能力上一直是本實驗室研究的方向。蛋白激發子PeaT1誘導煙草對病毒病的抗性，井岡霉素也可進入煙草體內殺菌，本研究基于二者對煙草病害的防治機理不同，通過將二者結合，篩選出了蛋白激發子PeaT1與井岡霉素3∶4的最佳復配比例。

本研究將蛋白激發子PeaT1與井岡霉素科學配伍，充分利用兩種成分的相互增效作用，提高作物對煙草病毒病的抗性，減輕煙草病毒病的發生程度，有效地控制病毒病的發生，為蛋白激發子PeaT1的應用提供了一個新的復配方案。

4 結論

本研究通過篩選蛋白激發子PeaT1與井岡霉素不同配比的復配制劑，發現在蛋白激發子PeaT1與井岡霉素的比例為3∶4時增效性價比最高，共毒系數達到157.64。將此復配制劑噴施于煙草葉片上，與蛋白激發子PeaT1、井岡霉素和清水進行比較，結果表明復配制劑與其他處理相比差異極顯著，相對防效在72 h達到73.39%。

［1］彭曙光. 我國煙草病毒病的發生及綜合防治研究進展［J］. 江西農業學報, 2011, 23（1）：115-117.

［2］劉權, 李廣悅, 曾紅梅, 等. 微生物蛋白激發子PeaT1的獲得及誘導水稻抗旱性的初步研究［J］. 中國農業科技導報, 2009,11（3）：51-55.

［3］陳梅, 邱德文, 劉崢, 等. 植物激活蛋白對煙草花葉病毒RNA復制及外殼蛋白合成的抑制作用［J］. 中國生物防治學報,2006, 22（1）：63-66.

［4］張穗, 郭永霞, 唐文華, 等. 井岡霉素A對水稻紋枯病菌的毒力和作用機理研究［J］. 農藥學學報, 2001, 3（4）：31-37.

［5］張薇, 楊秀芬, 邱德文, 等. 激活蛋白PeaT1誘導煙草對TMV的系統抗性［J］. 植物病理學報, 2010, 40（3）：290-299.

［6］Shivprasad S, Pogue GP, Lewandowski DJ, et al. Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors［J］. Virology, 1999, 255（2）：312-323.

［7］Liu Y, Schiff M, Marathe R, et al. Tobacco Rar1, EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus［J］. Plant Journal, 2002, 30（4）：415-429.

［8］Wang B, Yang X, Zeng H, et al. The purification and characterization of a novel hypersensitive-like response-inducing elicitor from Verticillium dahliae that induces resistance responses in tobacco［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93（1）：191-201.

［9］朱衛剛, 胡偉群, 陳定花, 等. 丙環唑和苯醚甲環唑復配對水稻紋枯病的聯合毒力［J］. 農藥, 2008, 47（5）：365-366.

［10］趙秀云, 祁高富, 李娜, 等. 一種青霉蛋白激發子EPTP及其在提高植物抗病性中的應用：中國, CN106146630A［P］.2016-11-23.

［11］李宏光, 易圖永, 肖艷松, 等. 7%井岡霉素·極細鏈格孢激活蛋白可濕性粉劑對煙草病毒病的防效研究［J］. 現代農業科技, 2014（24）：126-126.

［12］廖建松, 周路, 張承琴. 2種生物農藥對煙草病毒病防治效果對比試驗［J］. 現代農業科技, 2015（23）：133, 139.

［13］鄭建華, 楊秀芬, 等. 激活蛋白PeaT1在煙草細胞膜上的結合位點及其特性［J］. 植物病理學報, 2010, 40（4）：364-372.

［14］劉海民. 井岡霉素防治水稻紋枯病作用機理研究［D］. 福州：福建農林大學, 2008.

Research On the Induced Resistance of Protein Elicitor PeaT1 with Jinggangmycin in Tobacco Against TMV

PENG Zhi-chao TONG Zan-hua QIU De-wen
（Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Tobacco virus infects tobacco，tomatoes，peppers，potatoes，and other crops，causing a variety of crop diseases that are difficult to control during production. To explore the optimal mixed proportion of protein elicitor PeaT1 and Jinggangmycin to defense tobacco virus disease，this study chosen Nicotiana benthamiana cv. Huangmiaoyu having 3 to 7 leaves，respectively by spraying water，Jinggangmycin，and combination of PeaT1 and PeaT1-Jinggangmycin. Virus TMV-GFP was inoculated by the way of friction，and viral infection situation was observed under UV light. The results showed that the combination of Jinggangmycin mixed with PeaT1 had better synergism than using single one；PeaT1：Jinggangmycin at 3：4 mixed ratio had the most cost-efficient，and cotoxicity coefficient reached 157.64，the relative control effect reached 73.39%. Therefore，we thought that Jinggangmycin and PeaT1 both generated tobacco resistance against TMV，and their combination had synergetic effect.

protein elicitor；Jinggangmycin；induced resistance；TMV-GFP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0454

2017-06-02

北京市科技計劃項目（D151100003915003）

彭智超，男，碩士研究生，研究方向：誘導植物抗性的新型蛋白生物農藥；E-mail：14105789@qq.com

邱德文，男，博士，研究員，研究方向：蛋白質生物農藥；E-mail：qiudewen@caas.cn

（責任編輯 朱琳峰）