甘草懸浮細胞肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）基因的克隆及表達分析

鄒廣平 李雅麗 馮夢薇 楊修 許智偉

（內蒙古科技大學生命科學與技術學院，包頭 014010）

甘草懸浮細胞肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）基因的克隆及表達分析

鄒廣平 李雅麗 馮夢薇 楊修 許智偉

（內蒙古科技大學生命科學與技術學院，包頭 014010）

根據已報道的刺甘草C4H基因序列（GenBank ID：D87520.1），采用RT-PCR技術克隆得到烏拉爾甘草懸浮細胞的C4H基因編碼區序列，并對其進行生物信息學分析。另外，采用q-PCR方法對C4H基因受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）誘導后的表達模式進行分析。所克隆的C4H基因編碼區開放閱讀框（Opening reading frame，ORF）長為1 515 bp，編碼504 個氨基酸。q-PCR實驗證明C4H基因受MeJA的誘導，在懸浮體系添加MeJA后12 h達到最高表達水平。

肉桂酸-4-羥化酶；甘草細胞；茉莉酸甲酯；表達分析

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.），別名國老、甜草、甜根子，豆科甘草屬多年生草本植物，是一種補益的中草藥，藥理作用顯著，我國傳統中藥配方制劑的80%都把它作為主要成分。甘草黃酮因其良好的抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗HIV病毒等特性成為甘草中一類主要成分。植物體內黃酮類化合物的生物合成均源于苯丙烷代謝途徑，多種含苯丙烷骨架的次生代謝產物都是由這一途徑直接或者間接生成［1］。肉桂酸 -4-羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）是苯丙烷代謝途徑的第2 個酶，催化反式肉桂酸生成β香豆酸，是黃酮類化合物合成的關鍵酶之一，它是植物P450單加氧酶中首個被鑒定、被克隆、被確認功能的酶，在植物各組織中均具有很高的活性［2-4］。C4H在轉錄水平上的豐度和蛋白質水平上的活性能有效影響植物中芳香族化合物和黃酮類化合物的生物合成［5］。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是植物次生代謝途徑中最主要的信號分子，它常常作為第二信使參與植物次生代謝物尤其是黃酮類化合物的合成調控［6］。本實驗根據已報道的刺甘草C4H基因序列設計引物，用RTPCR從甘草懸浮細胞中克隆C4H基因的編碼區并進行序列分析，同時通過實時熒光定量PCR技術檢測了懸浮體系中添加MeJA后各時間段甘草細胞中C4H 的表達水平，為深入研究C4H基因在甘草黃酮類化合物生物合成途徑上的分子調控機制提供依據，對進一步構建轉基因高產甘草黃酮的基因工程細胞株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘草品種為烏拉爾甘草，種子購自內蒙古自治區鄂爾多斯市達拉特旗。愈傷組織由幼嫩的甘草無菌苗下胚軸和子葉誘導而來，在固體MS培養基附加0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA與0.5 mg/L 6-BA上 培養和繼代。懸浮培養系統的建立：取6 g分散性強、生長狀態良好的固體細胞置于250 mL三角瓶中，120 r/min震蕩培養，懸浮培養基為100 mL液體MS培養基+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，光照強度 36 μmol/m2·s，光照時間 16 h/d，培養溫度 25℃［7］。

總 RNA 抽提試劑盒、M-MLV 逆轉錄酶、DNA限制性內切酶、T4-DNA 連接酶、膠回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒和 pUM-T 載體均購自大連寶生物技術有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草懸浮細胞總RNA的提取及cDNA的合成 將懸浮培養的甘草細胞抽濾后迅速轉移至研缽中研磨，同時向研缽不間斷地添加液氮，研磨成細細的粉末即可?？俁NA提取步驟嚴格按照TaKaRa Total RNA 提取試劑說明書進行操作。以提取的甘草懸浮細胞總RNA為模板，利用 Prime ScriptTMReverse Transcriptase Kit合成cDNA第一鏈。

1.2.2 引物設計 根據GenBank中刺甘草C4H基因序列（序列號：D87520.1），利用Primer Premier 5.0軟件設計了3對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司生產的。

表1 三對PCR引物信息

1.2.3 甘草懸浮細胞C4H基因克隆 用cDNA 作為模版，對C4H基因的3對不同的引物分別進行PCR擴增，確定甘草C4H基因的最適引物。對PCR產物中1 800 bp左右處的條帶進行膠回收。通過膠回收（OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒）對PCR產物進行純化，純化產物與寶生物購買的克隆載體（pMD18-T載體）連接，重組質粒pMD18-T-C4H轉化大腸桿菌感受態細胞。菌落PCR篩選陽性克隆，提取重組質粒，進行質粒DNA檢測與雙酶切驗證。把提取的質粒和保存的菌液寄到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

1.2.4 序列分析 用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接并對其完整開放閱讀框進行氨基酸翻譯，得到氨基酸序列，與GenBank中其他植物的C4H蛋白進行Blast同源性對比，利用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹。對甘草C4H蛋白進行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測C4H蛋白的分子量。利用 ProtScale工 具（http://web.expasy.org/protscale/）對甘草C4H蛋白進行親水/疏水性分析。通過PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進行分析，C4H蛋白中各個氨基酸殘基對應的二級結構進行預測。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交 SWISS-MODEL在線分析軟件，預測蛋白質的三級結構。

1.2.5 甘草細胞C4H基因在不同MeJA誘導處理時間的表達分析 以甘草懸浮細胞系為研究對象，將生長狀態良好的種子細胞接種于新鮮培養基培養48 h后，添加100 μmol/mL的MeJA進行誘導，以加入無水乙醇（配置MeJA的溶劑）為對照組，分別在添加后1、3、6、9和12 h取樣，提取RNA，并反轉錄成cDNA，對C4H基因進行熒光定量PCR，以Actin作為內參基因，參照2×SYBR Prime Script TM RT-PCR Kit（TaKara）熒光定量試劑盒說明書進行熒光定量試驗。采用2（-△△Ct）法對數據進行分析。

2 結果

2.1 甘草細胞總RNA的提取

紫外可見分光光度計測得RNA 的OD260/280在1.8-2.2之間，濃度在1 000 ng/μL 左右。電泳結果（圖1）顯示，28S及18S rRNA兩條主帶清晰可見，且不含有 DNA 及蛋白質雜帶。RNA質量良好，可用于反轉錄得到 cDNA。

圖1 甘草細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 甘草懸浮細胞C4H基因克隆

對3對不同的引物分別進行PCR反應，得到第二對引物為甘草C4H基因的最適引物，進行50 μL體外擴增（圖2）。對PCR產物中1 800 bp左右處的條帶進行膠回收，將回收的片段與pMD18-T載體進行連接，轉化大腸桿菌，37℃過夜倒置培養至出現單菌落。挑取單菌落6 個，按體系進行菌落PCR檢驗，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖3中可見3號菌落中目的基因已被插入，挑取該菌落培養。

圖2 甘草細胞C4H基因克隆

圖3 菌落PCR篩選陽性克隆

2.3 C4H的生物信息學分析

用DNAMAN軟件把測序結果進行拼接，其中cDNA序列包含1個1 515 bp的ORF，共編碼504個氨基酸。在GenBank中下載其他植物C4H基因編碼的氨基酸序列與甘草離體細胞的序列進行同源性對比，利用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹。

根據圖4所示分枝的長短，計算出烏拉爾甘草與其他物種親緣關系由近及遠依次為：蒙古黃芪、狹葉羽扇豆、橄欖、麻風樹、喜樹、川椒、馬鈴薯、相思木、蔓花生、菜豆、綠豆、玫瑰、大豆、苜蓿及紅車軸草。其中，烏拉爾甘草與豆科植物蒙古黃芪親緣關系較近，相比之下，與豆科紅車軸草（即三葉草）親緣關系較遠。

圖4 系統發育進化樹

把甘草C4H蛋白進行分析（http://web.expasy.org/protparam/），推測C4H蛋白的分子量為 57.8 kD，等電點為9.14。通過PORTER（http://distill.ucd.ie/porter/）進行分析，對C4H蛋白中各個氨基酸殘基對應的二級結構進行預測。結果表明，該蛋白中α-螺旋為49.71%、β-折疊為17.15%、無規卷曲為33.14%，所以C4H蛋白二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主。將C4H基因編碼的氨基酸序列提交SWISS-MODEL在線分析軟件，進行蛋白質的三級結構預測，結果見圖5。

圖5 C4H蛋白的三級結構預測

2.4 相對熒光定量PCR表達分析

使用SYBR Green化學染料，運用相對定量的方法進行熒光定量PCR實驗。數據采用2（-△△Ct）法進行分析，即先根據“△Ct=Ct目-Ct對”計算，再根據“△△Ct=△Ct實-△Ct對”進行計算，最后依據“相對表達=2（-△△Ct）”計算出相對表達數值。再以處理時間為橫坐標，相對表達量為縱坐標做圖。

圖6 MeJA誘導后甘草細胞C4H基因的表達分析

由圖6可以看出，在1-12 h期間，C4H基因在添加MJ誘導后的相對表達量都大于對照組，并且在9 h表達量最高，說明甘草黃酮生物合成的關鍵基因酶C4H的表達明顯響應信號分子MeJA的誘導。

3 討論

肉桂酸4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷代謝途徑上的關鍵酶，能夠催化反式肉桂酸的苯環C4位羥基化生成 β-香豆酸，經4-香豆酰輔酶A連接酶轉變為香豆酰輔酶A，為木質素、類黃酮等下游次級代謝途徑提供前體物質［8］。逆境脅迫下，植物可通過調節一系列合成相關酶基因的轉錄水平從而影響其黃酮類和芳香族類的合成與積累［9］，其 中 就包 括C4H。Cheniany 等［10］研究發現，茶樹兒茶素含量與PAL和C4H 基因的表達水平正相關。有研究發現在模式植物擬南芥ref3突變體中 AtC4H 蛋白的失活會造成植株木質素和類黃酮的含量降低［11］；Liang等［12］在黑莓中發現，黃酮積累量與C4H表達量在果實發育的不同時期表現了同步增加或減少的變化趨勢。黃酮類化合物是中藥甘草的重要有效成分之一［13-14］，解析其生物合成途徑及分子調控機理是構建高產的基因工程細胞株的分子基礎。

本研究從甘草懸浮細胞中克隆到一個 C4H 基因的全長cDNA并對其進行生物信息學分析，序列比對分析發現其包含完整的細胞色素P450保守結構域，并與多種植物的C4H氨基酸序列具有較高的同源性，說明此C4H屬于C4H基因家族?？寺〕龈什菁毎鸆4H 基因的cDNA序列，對其進行系統的生物信息學分析和比較全面的功能預測，有助于進一步研究甘草黃酮合成的分子調控機制和作用機理。另外植物次生代謝產物的合成受環境因子所誘導，如信號分子ABA、SA、MeJA等。其中，MeJA是植物次生代謝途徑中最主要的次生代謝信號分子，可以顯著誘導次生代謝物的合成，如外源的MeJA對于重要的藥用次生代謝產物如紫杉醇、長春堿、東蓑若堿、尼古丁、青蒿素等均有顯著的誘導合成作用［15-18］。本研究以甘草懸浮細胞為研究對象，在接種于新鮮培養基48 h后加入信號分子MeJA誘導，用熒光定量PCR技術檢測誘導不同時間后C4H基因的表達情況，結果表明添加MeJA后明顯提高了C4H基因的表達，且在誘導后9 h表達量最高，MeJA誘導后不同時間段的差異性表達有利于進一步了解 C4H在甘草細胞懸浮培養過程中調控黃酮合成作用。

4 結論

從烏拉爾甘草懸浮細胞中克隆到C4H基因編碼區序列，并對其進行生物信息學分析。另外，采用q-PCR方法對C4H基因受MeJA誘導后的表達模式進行分析，結果表明C4H基因的表達受MeJA的誘導。

［1］Li XH, Park NI, Xu H, et al. Differential expression of flavonoid biosynthesis genes and accumulation of phenolic compounds in common buckwheat（Fagopyrum esculentum）［J］. J Agric Food Chem, 2010, 58（23）：12176-12181.

［2］Fahrendorf T, Dixon RA. Stress responses in alfalfa（Medicago sativa L.）XVIII：Molecular cloning and expression of the elicitorinducible cinnamic acid 4-hydroxylase cytochrome 450［J］. Arch Biochem Biophys, 1993, 305（2）：509-515.

［3］Li W, Yang LX, Jiang LZ, et al. Molecular cloning and functional characterization of a cinnamate 4-hydroxylase-encoding genefrom Camptotheca acuminata［J］. ACTA Physiologiae Plantarum, 2016,38（11）：255-263.

［4］Liu XY, Yu HN, Gao S, et al. The isolation and functional characterization of three liverwort genes encoding cinnamate 4-hydroxylase［J］. Plant Physiol Biochem, 117 ：42-50.

［5］李莉, 趙越, 馬君蘭. 苯丙氨酸代謝途徑關鍵酶：PAL、C4H、4CL 研究新進展［J］. 生物信息學, 2007, 5（4）：187-189.

［6］張梅, 林棋. 茉莉酸甲酯對錦繡杜鵑黃酮的累積及相關酶活性的影響［J］. 甘肅農業大學學報, 2015, 50（4）：65-169.

［7］李雅麗, 孟婷婷, 王毛毛, 等. 甘草細胞在攪拌式生物反應器中的放大培養［J］. 植物生理學報, 2015, 51（3）：302-306.

［8］張東雪, 王艷, 井妍, 等. 大豆GmC4H基因的克隆及同源基因的生物信息學分析［J］. 基因組學與應用生物學, 2016, 35（10）：2768-2774.

［9］陳鴻翰, 袁夢求, 李雙江, 等. 苦蕎肉桂酸羥化酶基因（FtC4H）的克隆及其 UV-B脅迫下的組織表達［J］. 農業生物技術學報,2013, 21（2）：137-147.

［10］Cheniany M, Ganjeali Ali. Developmental role of phenylalanineammonia-lyase（PAL）and cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes during adventitious rooting of Juglans regia L.Microshoots［J］. Acta Biol Hung, 2016, 67（4）：379-392.

［11］Sykes RW, Gjersing EL, Foutz K, et al. Down-regulation of p-coumaroyl quinate/shikimate 3'-hydroxylase（C3'H）and cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes in the lignin biosynthetic pathway of Eucalyptus urophylla × E. grandis leads to improved sugar release［J］. Biotechnology for Biofuels, 2015, 8：128-138.

［12］Liang L, Han X, Zhang Z, et al. Cloning and expression analysis of cinnamate 4-hydroxylase（C4H）reductase gene from Aquilaria sinensis［J］. China Journal of Chinese Materia Medica, 2014, 39（10）：1767-1771.

［13］ Li YL, Meng TT, Zhang XL. Study on enzymatic browning in suspension cultures of licorice cells［J］. Biotechnol. &Biotechnol, Equipment, 2016, 30（2）：277-283.

［14］Li YL, Yang Y, et al. Production of Glycyrrhizin in cell suspension of Glycyrrhiza inflata Batalin cultured in bioreactor［J］.Biotechnol. & Biotechnol. eq, 2012, 26（5）：3231-3235.

［15］馮盼盼, 陳鵬, 洪文杰, 等. 擬南芥MYB轉錄因子家族研究進展［J］. 生命科學研究, 2016, 20（6）：555-560.

［16］楊艷. 茉莉酸甲酯處理雷公藤懸浮細胞的基因差異表達分析［D］. 楊凌：西北農林科技大學, 2011.

［17］劉雅靜. 蒙古黃芪懸浮細胞系的建立及茉莉酸甲酯對其黃酮含量的調控［D］. 呼和浩特：內蒙古大學, 2011.

［18］蔡靜, 馬赟, 陳建偉, 等. 茉莉酸甲酯對明黨參植株和懸浮細胞中呋喃香豆素積累的影響［J］. 中國藥學雜志, 2017, 42（1）：76-82.

Cloning and Expression Analysis of Cinnamate 4-hydroxylase Gene from Glycyrrhiza uralensis Suspension Cultured Cells

ZOU Guang-ping LI Ya-li FENG Meng-wei YANG Xiu XU Zhi-wei
（School of Life Science and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010）

According to the reported C4H（cinnamate 4-hydroxylase）gene sequence（GenBank accession ID ：D87520.1）from Glycyrrhiza echinata，the coding sequence of C4H gene from Glycyrrhiza uralensis Fisch suspension cultured cells was obtained by RT-PCR cloning technology，and the bioinformatics analysis on it was carried out. In addition，the expression patterns of C4H gene induced by methyl jasmonate（MeJA）were analyzed by q-PCR. The length of the cloned C4H’s open reading frame（ORF）was 1 515 bp，encoding 504 amino acids. The q-PCR experiments showed that C4H gene was induced by MeJA and reached the highest expression level at 12 h after MeJA added into the cell suspension system.

cinnamate 4-hydroxylase；licorice cells；methyl jasmonate；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0466

2017-06-05

國家自然科學基金項目（31460064），內蒙古自然科學基金項目（2017MS（LH）0304），內蒙古高等學?！扒嗄昕萍加⒉庞媱潯保∟JYT-15-A08），內蒙古科技大學科研儀器專項（2015KYYQ03）

鄒廣平，女，碩士研究生，研究方向：藥用植物生物技術；E-mail：binghuanziyi@163.com

李雅麗，女，博士，研究方向：植物次生代謝調控；E-mail：btliyali@126.com

（責任編輯 朱琳峰）