一株野大豆內生真菌YD02菌株的鑒定及抗逆性研究

周振宇 胡金麗 蘇昕 劉冬雪 卜寧 馬蓮菊

（沈陽師范大學生命科學學院 沈陽 110034）

一株野大豆內生真菌YD02菌株的鑒定及抗逆性研究

周振宇 胡金麗 蘇昕 劉冬雪 卜寧 馬蓮菊

（沈陽師范大學生命科學學院 沈陽 110034）

從野大豆組織中分離篩選出1株內生真菌菌株YD02，通過形態學觀察和分子生物學方法對該菌株進行鑒定；用單因素實驗和正交試驗確定菌株的最佳發酵條件；采用菌絲干重法和對峙培養法分別測定菌株的抗重金屬鎘脅迫的能力以及對植物病原菌的影響。結果表明：YD02菌落黑色或墨綠色，菌絲分支且產孢；為鏈格孢屬（Alternaria Nees）菌株；其最佳發酵條件是以PDB培養基為基礎，蔗糖 4%，氯化銨 0.6%，磷酸氫二鉀 0.4%，硫酸鎂0.05%，pH5或pH9，培養溫度28℃，裝液量為60%，120 r/min發酵60 h；當鎘濃度為140 mg/L時，YD02正常生長幾乎停止。YD02菌株對瓜果腐霉病和蘋果霉心病的病原菌具明顯拮抗作用，抑菌率分別達到64.15%和71.68%。

野大豆；內生真菌；鑒定；抗逆性

植物內生菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在生長在健康的植物組織或細胞內，并對宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物群［1-2］。內生真菌廣泛存在于植物根、莖、葉、花和果實等部位［3-4］。一些植物內生菌在植物體內進行代謝會產生促進植物生長的物質，諸如生長素、赤霉素等［5］。許多資料表明植物與內生菌的共生作用會增強植株的抗逆性［6-7］。大豆作為重要的糧食作物，與人類的生產生活息息相關。有研究表明，栽培大豆在進化的過程中失去一些野大豆具有的優良屬性，其中最明顯的表現是失去了抗旱、抗鹽、抗重金屬等特性［8-10］。栽培大豆在進化過程中不僅基因發生變異，同時野大豆原本具有的內生菌在栽培大豆中也逐漸失去［11］。本研究以分離得到的野大豆內生真菌YD02為研究對象，探究其抗重金屬鎘脅迫和抗植物病原菌的能力，旨為其資源開發和潛在應用價值的挖掘提供一定的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2016年9月于遼寧省沈陽市蒲河濕地采集完野大豆整植株，將其裝入滅菌的自封紙袋中，取樣后于24 h內進行組織分離。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，121℃滅菌30 min；馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%，121℃滅菌30 min；含鎘培養基：在PDB中分別加入CdCl2，使培養基中Cd2+濃度分別為 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 g/L；含鹽培養基：在PDB中分別加入NaCl，使培養基中含鈉離子濃度分別為3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%。

1.1.3 試劑 真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、ITS序列擴增引物與其余藥品及試劑均購自生工生物（上海）股份有限公司。

1.1.4 供試菌株見表1。

1.2 方法

1.2.1 野大豆內生真菌的分離純化 將供試野大豆植株根莖葉先用自來水沖洗掉表面的泥土，再用無菌水進一步沖洗，用75%乙醇浸泡1 min，無菌蒸餾水沖洗3-4次，0.1%升汞浸泡30-40 s，無菌水沖洗3-4次。用無菌刀片將根、莖和葉健康組織切成5-10 mm大小組織塊，分別貼放于PDA平板上，同時將最后一遍沖洗的無菌水涂布平板作為對照，于28℃培養數天。觀察對照平板有無雜菌污染，若無污染，則可將放有組織塊培養平板上長出的菌落進行傳代培養，直至平板內菌落形態一致，4℃斜面保存備用。

1.2.2 YD02菌株的鑒定 形態學鑒定：菌絲形態觀察采用直接壓片法，于光鏡下觀察菌絲及孢子形態，菌落形態觀察采用平板培養法，觀察菌落正反面的形態、顏色等特征。分子生物學鑒定：用真菌基因組快速提取試劑盒提取YD02菌株的基因組DNA。以菌株YD02 基因組DNA為模板，18S-ITS1：5'-TCCG-TAGGTGAACCTGCGG-3'和18S-ITS4：5'-TCCTCCG-CTTATTGATATGC-3'為引物進行 PCR擴增。采用50 μL PCR 反應體系，反應條件為：95℃預變性 3 min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，共35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行同源性序列分析與比對。根據測序結果構建系統發育樹。

表1 供試菌株

1.2.3 YD02菌株生長特性測定

1.2.3.1 菌株生長曲線的測定 挑取備用菌絲至50 mL PDB培養基中，120 r/min 振蕩培養24 h，制備菌懸液。接種菌懸液到新的50 mL PDB培養基中（每瓶 1 mL），分別在 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 h取樣品，每組做3個平行，以不加菌作對照。28℃，120 r/min振蕩培養。將濾紙提前1 d于37℃烘干至恒重，稱重，將菌絲進行抽濾并用無菌水進行沖洗后37℃烘干至恒重，計算菌絲干重。

1.2.3.2 初始pH對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液分別轉接到pH 為1、3、5、7、9、11、13的50 mL PDB培養基中，28℃，120 r/min振蕩培養60 h，測量菌菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.3.3 鹽濃度對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液接種到含鹽（NaCl）濃度分別為0、3、5、7、9、11、13、15的50 mL PDB培養基中，28℃，120 r/min振蕩培養60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.3.4 裝液量對YD02菌株生長的影響 將YD02菌液轉接至含有50、75、100、150 mL PDB培養基的250 mL的三角瓶中，28℃，120 r/min振蕩培養60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。1.2.3.5 不同碳、氮源對YD02菌株生長的影響 以PDB培養基為基礎，分別加入2%的葡萄糖，乳糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，接種YD02菌液，28℃，120 r/min培養60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加額外碳源作對照，篩選最佳碳源；用相同方法在培養基中加入0.3%的牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀作為供試氮源，以不加氮源為對照，篩選最佳氮源。

1.2.3.6 正交試驗 以馬鈴薯液體培養基為基礎，添加碳源、氮源、NaCl、K2HPO4、MgSO4進行四因素五水平正交試驗，正交表見表2。

表2 四因素五水平正交試驗

1.2.4 Cd2+對YD02菌株生長的影響 用氯化鎘調PDB培養基重金屬含量，設置鎘濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 和 200 g/L共7個實驗組，接種制備好的的YD02菌液，28℃，120 r/min振蕩培60 h，測量菌絲干重，每組做3個平行，以不加菌作為對照。

1.2.5 YD02菌株抑菌活性的測定 采用對峙培養法測定YD02菌株對10種植物病原菌的抑菌活性。分別將直徑6 mm的病原菌菌塊放于平板中央，然后等距離點接菌株，放置培養箱中25℃培養至菌體長滿平板，觀察有無抑菌圈及抑菌圈大小，計算抑菌率。

抑菌率（%）=r2-（d-r1）/r2×100%

2 結果

2.1 野大豆內生真菌株的分離鑒定

經組織分離法自野大豆分離篩選得到1株植物內生真菌YD02。經形態學觀察，該菌株在固體培養菌落呈黑色或墨綠色，中央菌絲呈墨綠色或黑色，周圍菌絲呈白色，均呈絨狀，菌落正反面顏色不一，生長迅速。菌絲分支且產孢，隔和縱隔的壁磚狀分隔，暗褐色，常數個成鏈（圖1）。

圖1 YD02菌落形態、孢子和菌絲

2.2 菌株的分子生物學鑒定

YD02菌株的 18S rDNA 序列經 BLAST 比對，可鑒定菌株為鏈格孢屬（Alternaria Nees），基因同源相似度達99%.基于 18S r DNA利用MEGA 6.0 構建YD02菌株的系統進化樹（圖 2），由圖可知菌株YD02與菌株KU728276.1_Fungal_sp._strain_LBF13同源性最高。

2.3 YD02菌株生長曲線

菌株在生長第48 h進入對數期，在120 h為對數期的最高點。120 h至168 h為菌株生長的平臺期，168 h之后進入衰亡期（圖3）。

圖2 YD02菌株系統進化樹

圖3 YD02菌株的生長曲線

2.4 YD02菌株生長條件優化

2.4.1 pH對菌株生長的影響 初始pH值在1-11之間時，菌株均能生長，其中當培養基初始pH為5和9時，菌絲干重達到最大值，說明菌株在偏酸和偏堿的環境下均能達到最佳生長點（圖4）。

圖4 初始pH對YD02菌株生長的影響

2.4.2 鹽（NaCl）濃度對YD02菌株生長情況的影響 當培養基的初始鹽濃度在0-15%之間時，菌株均能生長，初始鹽濃度為5%時，菌株的生長狀況最為良好（圖5）。

圖5 鹽脅迫對YD02菌株生長的影響

2.4.3 裝液量對菌株生長的影響 菌株在裝液量為50、75、100、150 mL的 PDB培養基的250 mL三角瓶中均能生長，其中當裝液量為150（60%）時，菌株生長狀況最好（圖6）。

圖6 裝液量對YD02菌株生長的影響

2.4.4 不同碳氮源對菌株生長的影響 對比5種碳源對菌株生長的影響可見，加入碳源后菌株的生長狀況與未加碳源相比差異極顯著。以蔗糖為碳源培養菌株相比于對照組生長狀況提高最為顯著（圖7）。

圖7 不同碳源對YD02菌株生長的影響

同樣，培養基中加入氮源與未加氮源相比，菌株的生長狀況有顯著差異。其中加入氯化銨后與對照組相比菌絲干重的提高最為顯著（圖8）。

圖8 不同氮源對YD02菌株生長的影響

由 R 值大小得各因素作用的主次順序為：碳源（蔗糖）＞鹽（氯化鈉）＞氮源（氯化銨）＞緩沖物質（磷酸氫二鉀）＞無機鹽（硫酸鎂）。由上述發酵培養基正交試驗結果中的各列 K 值可知：碳源蔗糖的最適濃度為 A4，氮源氯化銨的最適濃度為 B4，氯化鈉的最佳濃度為 C1，磷酸氫二鉀的最適濃度為D4，硫酸鎂的最適濃度為E2。可確定菌株 YD02的發酵培養基的最好水平組合為 A4 B4 C1 D4 E2，即：蔗糖 4%（40 g/L），氯化銨 0.6%、（6 g/L），氯化鈉 0，磷酸氫二鉀 0.4%（4 g/L），硫酸鎂0.05%（0.5 g/L）。

2.5 重金屬鎘影響下的菌株生長情況測定

菌體耐重金屬鎘的性能較好，在鎘濃度為60 mg/L時，菌體的耐性最好，生長狀況最為良好，在140 mg/L時依舊可以生長（圖9）。

圖9 鎘脅迫對YD02菌株生長的影響

2.6 YD02菌株對植物病原真菌的抑菌拮抗作用

YD02菌株對10株供試病原菌進行抑菌測試，結果（圖10）表明YD02菌株對瓜果腐霉和蘋果霉心病菌具有顯著的抑菌效果，經測定，對瓜果腐霉和蘋果霉心病菌的抑菌半徑分別為0.833 cm和1.433 cm，計算抑菌率分別為64.15%和71.68%，抑菌效果顯著，可對部分植物病原菌針對性的防治中具有較大的應用潛力。

圖10 YD02菌株抑菌作用

3 討論

野大豆具有栽培大豆所不具備的眾多優良屬性，與其特有的內生菌密切相關，這也是當下的一個重要的研究方向［12-14］。目前使大豆增產主要通過施肥的方式，但與此同時帶來的土壤板結酸化的問題也日益凸顯，而在抗病蟲害方面也大多通過使用農藥的方式，給環境帶來較大的危害。因此，探尋能促進大豆生長，對不良環境有抵御能力的內生菌成為當前研究的目標。

本實驗從野大豆中分離獲得的內生真菌YD02表現出了比較優良的耐鹽能力，盛敏等［15］已經成功的對玉米接種了AM真菌，接種后的玉米表現出了比不接種AM真菌的玉米具有更好的抗鹽能力；陳亞平等［16］成功的篩選出了耐鹽真菌，并在水稻上檢驗了其協助植株抗鹽脅迫的能力。本實驗對YD02的最適pH進行了測定，其結果表明該菌株在pH5、9時生長量均大于中性pH7的點，這表明該菌株具有較好的耐酸耐堿能力，蒙程等［17］將AM真菌接種到紫花苜蓿中，其結果表明接種后紫花苜蓿具有了一定的耐酸能力。YD02菌株具有較好的耐酸堿能力，這對于日后探究YD02菌株協助栽培大豆抗酸堿環境有著一定的指導意義，這使得YD02菌株可以作為生物降解菌的菌株之一。

本實驗對YD02菌株的抑菌效果進行了評價，其結果表明該菌株對于瓜果腐霉和蘋果腐霉有著明顯的抑菌效果，但是對于大豆病原菌的抑菌效果并未進行評價，日后可針對于倪佳俊、張維瑞等［19-20］的實驗方案對YD02菌株對于大豆病原菌的抑菌能力進行評價，以便日后研究。

4 結論

野大豆內生菌YD02，經經 r DNA-ITS 序列分析鑒定為鏈格孢屬（Alternaria Nees），其在120 h可以到達最大生長點，在偏酸和偏堿的環境下均可以達到最大生長量，其最佳發酵條件是以PDB培養基為基礎，蔗糖 4%，氯化銨 0.6%，磷酸氫二鉀 0.4%，硫酸鎂0.05%，pH5或pH9，培養溫度28℃，裝液量為60%，120 r/min發酵60 h，菌株具有優良的耐鹽能力和抗重金屬鎘的能力，對瓜果腐霉、蘋果霉心病具有抑菌能力，抑菌率為64.15%和71.68%。

［1］鄧墨淵, 王伯初, 楊再昌, 等. 分子生物學技術在植物內生菌分類鑒定中的應用［J］. 氨基酸和生物資源, 2006, 28（3）：9-14.

［2］賈栗, 陳疏影, 翟永功, 等. 近年國內外植物內生菌產生活性物質的研究進展［J］. 中草藥, 2007, 38（11）：1750-1754.

［3］ 劉麗莉, 呂國忠, 孫曉東. 林木內生真菌研究進展［J］. 菌物研究 , 2006, 4（2）：54-59.

［4］Zheng YK, Qiao XG, Miao CP, et al. Diversity, distribution and biotechnological potential of endophytic fungi［J］. Annals of Microbiology, 2016, 66（2）：529-542.

［5］張集慧, 王春蘭, 等. 蘭科藥用植物的5種內生菌產生的植物激素［J］. 中國醫學科學院學報, 1999, 21（6）：460-465.

［6］姚領愛, 胡之璧, 王莉莉, 等. 植物內生菌與宿主關系研究進展［J］. 生態壞境學報, 2010, 19（7）：1750-1754.

［7］徐亞軍. 植物內生菌資源多樣性研究進展［J］. 廣東農業科學,2011, 38（24）：149-152.

［8］高小寬, 劉國杰, 白麗榮. 聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫對野生大豆與栽培大豆萌發的影響［J］. 大豆科學, 2012, 31（6）：1027-1029.

［9］紀展波, 等. 野生大豆、半野生大豆和栽培大豆對苗期干旱脅迫的生理反應［J］. 大豆科學, 2012, 31（4）：598-604.

［10］李娜娜, 孔維國, 張煜, 等. 野生大豆耐鹽性研究進展［J］.西北植物學報, 2012, 32（5）：1067-1072.

［11］董英山. 中國野生大豆研究進展［J］. 吉林農業大學學報,2008, 30（4）：394-400.

［12］Ratnaweera PB, de Silva ED, Williams DE, et al. Antimicrobial activities of endophytic fungi obtained from the arid zone invasive plant Opuntia dillenii and the isolation of equisetin,from endophytic Fusarium sp［J］. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2015, 15（1）：220.

［13］孔鈺鳳, 朱先燦, 張建峰, 等. 野生大豆與栽培大豆抗旱性對接種叢枝菌根真菌的響應［J］. 土壤與作物, 2017（1）.

［14］劉海龍, 李春杰, 許艷麗. 生防細菌的抑菌譜和對大豆根腐病的防治［J］. 大豆科技, 2008（1）：10-13.

［15］盛敏, 唐明, 張峰峰, 等. 鹽脅迫下接種AM真菌對玉米耐鹽性的影響［J］. 西北植物學報, 2011, 31（2）：332-337.

［16］陳亞平. 耐鹽堿植物內生真菌的分離鑒定及促進作物耐鹽菌株的篩選［D］. 杭州：浙江大學, 2014.

［17］蒙程, 陸妮, 柴琦. 不同pH下接種AM真菌和根瘤菌對紫花苜蓿生長的影響［J］. 草業科學, 2017, 34（2）：352-360.

［18］阮迪申, 曾加會, 等. 重金屬脅迫下內生菌對宿主植物的解毒機制［J］. 微生物學通報, 2016, 43（12）：2700-2706.

［19］ 倪佳俊, 周婷, 等. 飛蓬草內生真菌的分離及抑菌活性研究［J］. 杭州師范大學學報（自然科學版）, 2017, 16（1）：57-63.

［20］張維瑞, 郭秀春, 李欽, 等. 杜仲葉和果實中內生真菌的分離及抑菌活性［J］. 中草藥, 2016, 47（16）：2921-2926.

Identification and Resistance of an Endophytic Fungus YD02 Strain in Wild Glycine soja

ZHOU Zhen-yu HU Jin-li SU Xin LIU Dong-xue BU Ning MA Lian-ju
（College of Life Science，Shenyang Normal University，Shenyang 110034）

The endophytic fungus YD02 was isolated from a wild Glycine soja and identified using morphological feature and molecular biology methods. The single factor experiment and the orthogonal test were applied for determining the optimal fermentation conditions of the strain. Further，dry weight method was used to determine the resistance of the strain on heavy metal Cd stress，and the confrontation culture method was to value its effect on the pathogenic bacteria of plant. The results showed that YD02 colony was black or dark green，hyphae branched and spores produced，and it belonged to Alternaria Nees. The optimal fermentation condition was 4% sucrose，0.6% ammonium chloride，0.4% potassium hydrogen phosphate，0.05% magnesium sulfate，pH 5 or pH 9，culture temperature 28℃ with 60% fluid amount，120 r/min and 60 h fermentation on the base of PDB culture medium. When cadmium concentration reached 140 mg/L，YD02’s growth stopped. YD02 strain presented obvious antagonistic effects on the Pythium aphanidermatum and apple moldy core pathogens，and the bacteriostatic rate was 64.15% and 71.68%，respectively.

wild Glycine soja；endophytic fungus；identification；stress resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0403

2017-05-17

國家自然科學基金項目（31270369；31600314），沈陽市科學技術計劃項目（F16-205-1-50）

周振宇，男，碩士研究生，研究方向：資源微生物與應用；E-mail：461539637@qq.com

馬蓮菊，女，研究生導師，副教授，研究方向：資源微生物與應用；E-mail：744289467@qq.com

（責任編輯 朱琳峰）