可抑制致病菌的益生菌篩選及抑菌物質的初步確定

王利杰 余曉斌 方銀兵 顧秋亞

（1. 江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 寧波中瑞生物科技有限公司，寧波 315821）

可抑制致病菌的益生菌篩選及抑菌物質的初步確定

王利杰1余曉斌1方銀兵2顧秋亞1

（1. 江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 寧波中瑞生物科技有限公司，寧波 315821）

為了得到可抑制致病菌的益生菌并初步確定其抑菌物質。從土壤、飼料添加劑和肥料添加劑3種樣品中初篩能產生抑菌圈的菌株。用牛津杯法，對初篩得到的菌株和實驗室保存的菌株進行復篩。對復篩的未知菌株進行形態學、16S rRNA基因序列和生理生化特征鑒定。對復篩菌株的發酵上清液進行酸堿作用驗證、高溫處理、蛋白酶處理、鹽析處理和透析處理，再進行抑菌活力測定。結果顯示復篩中有8株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌都有較強抑制作用的菌株。8株菌中有4株已知菌，4株未知菌。已知菌株分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。4株未知菌中3株被鑒定為地衣芽孢桿菌，1株被鑒定為乳酸片球菌。地衣芽孢桿菌能產生多種耐高溫的抑菌物質，其中包含能透過8-14 kD透析袋的小分子和不能透過8-14 kD透析袋的大分子，初步判定為多肽類物質。5株產酸菌株產生的抑菌物質主要是酸性物質。

益生菌；牛津杯法；16S rRNA；抑菌物質

抗生素為人類作出了巨大的貢獻，但由于抗生素濫用，也讓人們越來越意識到抗生素的危害性。從瑞典1986年在養殖行業首次禁抗，到2006年歐盟全面禁止使用促生長抗生素，再到2015年我國要求停止生產用于食品動物的部分抗生素制劑。這些都表明無抗養殖已經成為今后的發展趨勢，開發新型無抗飼料添加劑，對于國家及企業，都有迫切的需求［1］。

益生菌是指能夠以一定數量存活并定殖于宿主腸道內，通過調節腸道菌群平衡，對宿主健康發揮有益作用的活性有益微生物的總稱［2］。其主要通過與動物消化道內各種微生相互作用，來改善微生物和酶的平衡，從而改善動物腸道菌群結構、抑制有害菌和提高免疫力［3］。研究表明，某些乳酸菌能產生細菌素［4-8］，芽孢桿菌能產生抗菌肽或者是抗菌蛋白［9，10］等。目前國內外針對可抑制致病菌的益生菌的篩選，也主要集中在乳酸菌和芽孢桿菌上。例如，有關研究篩選到可抑制致病菌的干酪乳桿菌［6］、植物乳桿菌［8］等乳酸菌，以及可抑制致病菌的淀粉液化芽孢桿菌［11］、側孢短芽孢桿菌［12］等芽孢桿菌。

基于畜禽生態平衡理論推出的新型無抗微生物飼料添加劑，是近年來開發主要方向。目前已有益生菌作為飼料添加劑的相關研究［13-14］。但益生菌飼料添加劑的作用機理尚未研究透徹，優良菌種缺乏，可用于微生態制劑的菌種較少，同時相關產品較為單一，復合菌劑的開發成為重點［15］。因此，篩選優良益生菌，探索其中機理，完善配套應用技術等方面急需深入研究［16］。本實驗主要通過從土壤、飼料添加劑和肥料添加劑樣品中分離到有抑菌效果的菌株。通過牛津杯法和實驗室保存的大量菌株，同時進行抑菌活力的測定，從而篩選到多種能夠明顯抑制致病菌的菌株，再通過試驗初步確定抑菌物質的類型，為進一步開發研制無抗飼料添加劑等微生物制劑提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和待測菌種 樣品為土壤、肥料添加劑和飼料添加劑。菌種為本實驗室分離保存的4株產酸菌株，分別為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以及23株未知菌株。實驗室保存的菌株源自市售酸奶發酵劑、益生菌藥品和保健品，以及市售可食用發酵制劑。

1.1.2 主要儀器 TC-5000 PCR儀：英國TECHEN；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠，Kylin-Bell VORTEX-5：江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司，牛津杯規格：內徑（6.0±0.1）mm、外徑（8.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。培養皿規格：內徑（90.0±0.1）mm，高（16.5±0.1）mm（上海儀翀科技發展有限公司）。

1.1.3 指示菌 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）都為本實驗室保存。

1.1.4 主要培養基 LB培養基、營養肉湯培養基（NB）、MRS固體培養基和MRS液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的初篩 采用涂布平板法［17］：精確稱取10 g樣品，放入90 mL含有玻璃珠的0.85%的生理鹽水中，37℃、180 r/min震蕩30 min，80℃水浴10 min。然后將樣品進行10倍系列的梯度稀釋，分別吸取稀釋倍數為10-4、10-5、10-6、10-7的樣品100 μL，涂布于LB平板上，37℃培養24 h。挑取能產生抑菌圈的菌落，分離純化，編號保存。不經水浴加熱，同樣采取涂布平板法將樣品涂布于含1%CaCO3的MRS平板上，挑取有溶鈣圈的菌株，分離純化，編號保存［18］。

1.2.2 牛津杯法復篩［19］檢測平板的制備：用接種環挑取在LB平板上生長24 h的指示菌，接到含有生理鹽水的無菌試管中，用旋渦震蕩器震蕩均勻，進行不同倍數的梯度稀釋，再震蕩均勻，測定OD600值后備用。分別吸取800 μL、OD600為1.6的3種指示菌菌懸液于無菌平板中，然后將滅菌的LB培養基冷卻至50-60℃，精確量取20 mL，迅速倒入加過指示菌懸液的平板中，輕輕搖勻，冷卻備用。

發酵上清液的制備：LB培養基初篩得到的菌株在LB平板上37℃培養24 h，接種在肉湯培養基中，37℃、180 r/min搖床培養24 h，再以4%的接種量轉接在肉湯培養基中，37℃、180 r/min搖床培養24 h。取樣，在4℃，8 000 r/min，離心5 min，取上清，用孔徑為0.22 μm的水系針頭濾器過濾到無菌離心管中備用。以同樣的方法和條件將產酸菌株在MRS固、液體培養基上培養后制備發酵上清液。

抑菌活力的測定：對初篩的菌株進行復篩：分別吸取初篩得到的菌株和實驗室保存的菌株的發酵上清液200 μL，加入對應編號的3種檢測平板的牛津杯中，37℃培養24 h，每個試驗做3個平行，拍照并測量抑菌圈直徑，直徑取3個平行的平均值。

1.2.3 菌株的形態觀察及16S rRNA序列分析 對復篩得到的菌落形態特征進行觀察，革蘭氏染色，芽孢染色并鏡檢。分別對各個未知菌株的基因組進行提取、PCR擴增、產物回收和送樣測序。測序序列結果在NCBI數據庫中用Blast軟件搜索近似序列，將所測得的序列和從GenBank中獲得的相關種屬的16S rRNA基因序列。運用Mega6.0軟件構建系統發育樹，用鄰接法（Neighbor-joining）進行發育樹分析。

1.2.4 生理生化特征鑒定 對復篩得到的未知菌株的生理生化特征進行鑒定［20-21］，主要進行了V-P測定、淀粉水解、明膠液化、厭氧生長、硝酸鹽還原、過氧化氫酶反應，糖利用情況等試驗。

1.2.5 抑菌物質的初步確定 為了確定復篩菌株發酵上清液中抑菌物質的性質，進行了如下4種不同的試驗。

酸堿作用的驗證：測量發酵上清液的pH，并用3 mol/L的NaOH或3 mol/L的HCl調節pH變化較大的發酵上清液，調至與發酵前一致（發酵前NB培養基pH為7.2，MRS液體培養基pH為6.4），分別吸取調過pH的發酵上清液和不調pH的發酵上清液，進行抑菌活力測定。

高溫處理：將發酵上清液經115℃、30 min高溫處理和不經高溫處理，分別進行抑菌活力測定。

蛋白酶處理：將一定濃度的蛋白酶k和胃蛋白酶溶液分別加入發酵上清液，使酶的終濃度為2 mg/mL。調節加入蛋白酶k的上清液至pH為7，加入胃蛋白酶的上清液pH為3，37℃溫育4 h，再調回原來的pH，進行抑菌活力的測定。

鹽析處理：取10 mL發酵上清液，向其中加入硫酸銨至飽和度為65%，進行鹽析。用pH為7的磷酸鹽緩沖液將沉淀定容至10 mL，用3.5 kD的透析袋除鹽后和磷酸鹽緩沖液分別進行抑菌活力的測定。

透析處理：將10 mL發酵上清液經8-14 kD的透析袋透析處理，將透析袋內液和外液分別濃縮至1 mL，并用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL，分別進行抑菌活力的測定。

2 結果

2.1 菌種的初篩

根據不同的樣品，采用涂布平板法進行篩選，得到35株能產抑菌圈的菌株。其中6株來自土壤，8株來自肥料添加劑，21株來自飼料添加劑。經溶鈣圈試驗，其中5株是產酸菌株。

2.2 牛津杯法復篩

將初篩得到的35株菌株和實驗室保存的27株菌株，用牛津杯法進行抑菌活力的測定，部分抑菌效果見圖1。結果顯示，其中8株菌株的發酵上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌都有明顯的抑制作用。將8株抑菌效果明顯的菌株分別命名為，YB1、YB2、YB3、L-B、L-C、L-R、L-P和BH。其中BH篩選自土壤，YB1篩選自飼料添加劑，YB2和YB3篩選自肥料添加劑。L-B、L-C、L-R和L-P為本實驗室保存的菌株，分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。L-B源自市售酸奶，L-C、L-R和L-P源自市售可食用發酵制劑。通過溶鈣圈觀察，L-B、L-C、L-R、L-P和BH為產酸菌株。

圖1 抑菌效果圖

2.3 菌株的形態及16S rRNA序列分析

YB1、YB2和YB3在LB培養基上培養24h，BH在MRS培養基上培養24 h，分別進行形態學觀察（圖2）。YB1、YB2和YB3形態特征相似，菌落都為圓形，表面光亮，邊緣有微列齒，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色并鏡檢顯示，菌體桿狀，有芽孢且芽孢中生或側生；BH菌落圓形，表面濕潤，中間有乳白色隆起，革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色并鏡檢顯示，菌體球狀、大多數為多個聚集在一起，無芽孢。由此確定YB1、YB2和YB3為芽孢桿菌，BH為球菌。

圖 2 菌落和菌體形態特征圖

將菌株YB1、YB2、YB3和BH的16S rRNA序列分別在GenBank中進行Blast序列比對，然后進行系統發育樹的構建。用Neighbor-joining進行發育樹分析，結果見圖3。由圖3可知，YB1、YB2、YB3和地衣芽孢桿（Bacillus licheniformis）聚在一個分支上，且同源性≥99%，和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性為97%。BH與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚在一個分支上，且同源性為100%。綜合形態學以及16S rRNA序列的分析，確定YB1、YB2和YB3為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌，BH為乳酸片球菌。

2.4 生理生化特征鑒定

圖3 基于16S rRNA序列的菌株系統發育樹

根據形態學特征以及16S rRNA的結果，進行有針對性的生理生化測定。4株菌的部分生理生化特征鑒定結果見表1。由表1可知，YB1、YB2和YB3的V-P測定，淀粉水解等生理生化特性一致。由生理生化特征可知YB1、YB2和YB3在厭氧情況下能夠生長，通過《常見細菌系統鑒定手冊》可知地衣芽孢桿菌能夠在厭氧條件下生長，而枯草芽孢桿菌不能在厭氧條件下生長，所以可以確定YB1、YB2和YB3同為地衣芽孢桿菌。BH的生理生化特征和形態學特征以及16S rRNA結果一致，確定為乳酸片球菌。將YB1、YB2、YB3和BH序列提交至NCBI，分別獲得登錄號，MF326578、MF326579、MF326580和 MF326581。

表1 生理生化特征

2.5 抑菌物質的初步確定

2.5.1 酸堿作用的驗證 對培養液發酵前后的pH進行測定，芽孢桿菌的發酵上清液pH和發酵前比較，基本不變，在7.2左右。5株產酸菌上清液發酵前pH為6.4，發酵后明顯降低，將產酸菌株的發酵上清液pH調至6.4，再做抑菌活力的測定，結果見表2。由表2可以看出，pH調回6.4的發酵上清液和不調pH的上清液相比，對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈直徑減少6.0-12.0 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑減少0.6-2.0 mm，抑菌效果明顯減弱。

2.5.2 高溫處理 為了研究發酵上清液中的抑菌物質經過高溫處理后是否仍然保持抑菌活性，對發酵上清液經過115℃的高溫處理30 min和不經高溫處理的發酵上清液作對比進行抑菌活力測定。結果（表3）顯示，發酵上清液高溫處理相對于不經高溫處理，3株芽孢桿菌對藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑減少了2.0-6.0 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑減少了0.5-1.0 mm。5株產酸菌株對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑菌圈直徑減少0.4-3.0 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑減少0.0-1.0 mm。

表2 產酸菌株調節pH前后的抑菌圈直徑（mm）

表3 加熱處理和不加熱處理的抑菌圈直徑（mm）

2.5.3 蛋白酶處理和鹽析處理 發酵上清液經蛋白酶k處理和胃蛋白酶處理前后，進行抑菌活力測定，抑菌圈直徑大小相近。由此表明發酵上清液中產生的抑菌物質對蛋白酶K處理和胃蛋白酶不敏感。將發酵上清液經鹽析處理，沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，再透析除鹽后做抑菌活力的測定，測定結果如表4。由表4可知，3株芽孢桿菌的鹽析沉淀溶解液的抑菌圈直徑大小相近。和對照相比，3株芽孢桿菌的鹽析沉淀溶解液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別增加了2.8-3.2 mm，13.0-14 mm，5.8-6.4 mm。5株產酸菌株鹽析沉淀溶解液產生的抑菌圈直徑和對照大小接近。

2.5.4 透析處理 為了確定抑菌物質的大致分子量，將各個菌株的發酵上清液，經透析處理，透析袋內保留液和外液分別濃縮并用磷酸鹽緩沖液定容后，進行抑菌活力的測定。測定結果見表5，由表5可知，3株芽孢桿菌抑菌圈直徑大小相近，相對于對照，透析內液、外液都有更大的抑菌圈直徑。且透析內外液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大；藤黃微球菌的抑菌圈直徑次之；大腸桿菌的抑菌圈直徑最小。而5株產酸菌株的透析內液產生的抑菌圈大小和對照相近，透析外液能產生更大的抑菌圈直徑，且對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，藤黃微球菌的抑菌圈直徑次之，大腸桿菌的抑菌圈直徑最小。

表4 鹽析處理的抑菌圈直徑

3 討論

有關研究表明，芽孢桿菌能夠抑制番茄葉霉病菌等植物有害菌［22］，適合做活菌制劑形式的添加劑［23］；某些產酸菌株對李斯特菌，志賀氏菌屬也有抑制作用［24］；多種乳酸菌都能產生細菌素［4-7］，細菌素是由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，能夠抑制多種致病菌。

表5 經透析處理的抑菌圈直徑（mm）

本研究篩選到8株可抑制致病菌的益生菌，其中BH篩選自土壤，YB1篩選自飼料添加劑，YB2和YB3篩選自肥料添加劑。實驗室保存的保加利亞乳桿菌源自市售酸奶，干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌源自于市售的可食用發酵制劑中。地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌都是農業部規定的安全微生物，可用于養殖動物［25］。經過大量抑菌活力測定得知這8株菌抑菌活力最強，有望應用于混菌發酵開發新型無抗飼料添加劑。

經抑菌物質的分析試驗可知，地衣芽孢桿菌發酵上清液中的抑菌物質非酸堿，而是產生了其它抑菌活性物質，這和已知研究地衣芽孢桿菌能產生多種抗菌活性物質［22，26-27］相吻合；經過高溫處理、蛋白酶處理和鹽析處理可知，抑菌物質具有耐高溫特性，對蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，鹽析產物抑菌效果較強，由此分析抑菌物質可能是一種抗菌肽，和報道某些芽孢桿菌能產生耐高溫抗菌肽［10］結果一致。經透析處理內外液都有較強的抑菌活性，可以判斷有多種抑菌物質，且有些是能透過8-14 kD的小分子物質，有些是不能透過8-14 kD的大分子物質。5株產酸菌株，發酵上清液的抑菌作用主要是由于產生酸性物質引起的，調節pH后仍有部分抑菌活性，表明產酸菌株發酵上清液中的抑菌物質除了酸外，還有其它抑菌物質，這和已知研究乳酸片球菌能產生乳酸片球菌素［28］的結果相似；經高溫處理，鹽析處理，透析處理和蛋白酶處理可知，產酸菌株產生的抑菌物質具有耐高溫性能，不產生或者產生很少量的抗菌蛋白或者多肽類物質。

4 結論

本實驗篩選到8株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌3種致病菌均有較強抑制作用的菌株。其中3株均為地衣芽孢桿菌，5株產酸菌株分別為保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸片球菌。其中3株地衣芽孢桿菌能產生多種耐高溫的抑菌物質，該抑菌物質對蛋白酶K和胃蛋白酶不敏感，可能是多肽類物質，其包含能透過8-14 kD透析袋的小分子肽和不能透過8-14 kD透析袋的大分子肽。5株產酸菌株產生的耐高溫抑菌物質主要是酸性物質。

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Screening of Probiotics for Inhibiting Pathogens and Preliminary Determination of Antimicrobial Substances

WANG Li-jie1YU Xiao-bin1FANG Yin-bing2GU Qiu-ya1
（1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2.Ningbo Zhongrui Biotechnology Co.，Ltd. Ningbo 315821）

In order to obtain probiotics that inhibit pathogens and to determine their antimicrobial substances，strains that can produce inhibitory zones were isolated from the soil，feed additives and fertilizer additives. Strains isolated and preserved in the laboratory were rescreened with the Oxford Cup method. Then the unknown strains were identified with morphological observation，16S rRNA -based phylogeny and physiological and biochemical reaction. The antimicrobial activity of fermentation supernatant was determined after treated by acid-base reaction，high temperature，protease decomposition，salting-out and dialysis. Results showed that 8 strains presented the strong inhibitory effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus，and 4 strains were known as Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus casei，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus plantarum. Three of the 4 unknown strains were identified as Bacillus licheniformis and one was identified as Pediococcus lactis. Bacillus licheniformis can produce a variety of antimicrobial substances with different molecular weights and high temperature resistance，which can or cannot pass through 8-14 kD dialysis bags，and the antimicrobial substances produced by Bacillus licheniformis are preliminarily determined as polypeptide，and antimicrobial substances from 5 acid-producing strains are mainly acidic.

probiotics；Oxford Cup method；16S rRNA；antimicrobial substances

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0411

2017-05-26

新型高效無抗生物飼料添加劑的研發及產業化（201501CX-D01037）

王利杰，男，碩士研究生，研究方向：功能微生物；E-mail：2454792926@qq.com

余曉斌，男，博士，博士生導師，研究方向：發酵法生產功能性食品/因子酶技術；E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn

（責任編輯 朱琳峰）