產(chǎn)β-葡萄糖苷酶細(xì)菌的篩選及轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的研究

馮薇 胡小妍 馬明娜 郭萌 路福平 李玉

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶細(xì)菌的篩選及轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的研究

馮薇 胡小妍 馬明娜 郭萌 路福平 李玉

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

白藜蘆醇具有抗癌、抗氧化等八大功效，在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。為獲得分泌β-葡萄糖苷酶的細(xì)菌菌株，并實(shí)現(xiàn)其對(duì)虎杖苷的有效轉(zhuǎn)化。通過梔子苷平板初篩、虎杖苷搖瓶復(fù)篩，篩選得到一株能夠分泌β-葡萄糖苷酶，轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的菌株，并利用16S rDNA序列對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行鑒定，鑒定為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis），命名為CGMCC 13129，該菌株在37℃，接種量為7%，底物虎杖苷濃度為0.1%，pH為7，轉(zhuǎn)化8 h的條件下，對(duì)底物虎杖苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上，利用HPLC、HPLC-MS、1H-NMR等手段檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為白藜蘆醇，經(jīng)甲醇萃取一次，純度高達(dá)99.3%。

白藜蘆醇；沙福芽孢桿菌；β-葡萄糖苷酶；虎杖苷

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚物質(zhì)，化學(xué)名稱為芪三酚，分子式為C14H12O3，無色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)256-258℃，較難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，光、熱穩(wěn)定性差。廣泛存在于蓼科、葡萄科等70多種植物中。它具有良好的治療阿爾茨海默病、清除易形成聚集體的病理性蛋白、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗抑郁及神經(jīng)保護(hù)、抑制腫瘤惡性增殖［1-5］等功效。因其可應(yīng)用于保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)而受到人們的關(guān)注。

白藜蘆醇的生產(chǎn)方式主要包括植物提取法、化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。張景亞等［6］優(yōu)化超聲提取花生衣中白藜蘆醇的工藝，使其平均提取率達(dá)0.3%。Guiso 等［7］利用3，5-二乙酰氧基苯乙烯與對(duì)乙酰氧基碘苯發(fā)生Heck 反應(yīng)，水解得到白藜蘆醇，總產(chǎn)率達(dá)70%。Solladie 等［8］應(yīng)用Perkin 反應(yīng)以對(duì)異丙氧基苯乙酸和3，5-二異丙氧基苯甲醛為原料，獲得單一順式構(gòu)型白藜蘆醇，經(jīng)異構(gòu)化、脫除保護(hù)基得反式白藜蘆醇，總收率達(dá)55.2%。碳負(fù)離子與羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)［9］，所得的烴基消除后可以形成雙鍵，合成路線步驟較繁瑣，但是該方法利于構(gòu)型選擇。生物轉(zhuǎn)化法中，田天麗等［10］用根霉與中藥虎杖共發(fā)酵的方法獲得產(chǎn)物白藜蘆醇；白藜蘆醇酶法提取條件溫和，提高原料利用率和產(chǎn)物得率，但成本較高。一般采用多種酶復(fù)合，應(yīng)用較多的是糖苷酶和纖維素酶。黃志芳等［11］用纖維素酶將虎杖中的虎杖苷酶解成白藜蘆醇，使白藜蘆醇得率比醇提法提高近5倍。

植物中游離的白藜蘆醇極少，約為0.01%，多結(jié)合葡萄糖以苷（虎杖苷）的形式存在；因此從植物中提取白藜蘆醇的收率不高。白藜蘆醇的光熱不穩(wěn)定性，又限制了化學(xué)合成法在白藜蘆醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。真菌轉(zhuǎn)化虎杖苷的時(shí)間較長，且不便于產(chǎn)物的分離純化。利用酶法水解，效率稍有提高，但成本也非常高。β-葡萄糖苷酶能夠水解結(jié)合于末端非還原性的 β-D- 葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出 β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基［12］，虎杖苷可被β-葡萄糖苷酶水解為白藜蘆醇。利用能夠分泌β-葡萄糖苷酶的菌株轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇有效可行，且開發(fā)一種轉(zhuǎn)化時(shí)間短，反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高的生產(chǎn)白藜蘆醇的方法尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 采自湖北省隨州市常年種植虎杖的土壤。

1.1.2 主要試劑和儀器 甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（98%）、梔子苷（50%）、虎杖苷（50%）均購自南京狄爾格醫(yī)藥公司。PTC-200型PCR基因擴(kuò)增儀（MJ Research Inc.）、高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、色譜柱（Agilent Zorbax SB-C18）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士buchi）。

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基：純度為50%的梔子苷3 g/L，精氨酸 2 g/L，tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L；種子培養(yǎng)基：精氨酸2 g/L，tryptone 10 g/L，yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，tryptone 10 g/L，NaCl 5 g/L，純度為50%的虎杖苷1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌種采集與分離純化 用生理鹽水沖洗虎杖根，浸泡搖勻后，梯度稀釋，分別涂布于含有卡那霉素、氨芐青霉素、0.3%的梔子苷的固體培養(yǎng)基上和含有0.3%的梔子苷的LB固體培養(yǎng)基上，梔子苷與β-葡萄糖苷酶反應(yīng)發(fā)生明顯的藍(lán)色變化［13］，觀察菌落生長情況，編號(hào)記錄。

1.2.2 底物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物的提取與精制 挑取單菌落，接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，37℃。220 r/min，搖瓶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。將完成轉(zhuǎn)化的發(fā)酵液離心后，棄去上清，向沉淀中加入甲醇，再次離心后取上清，棄去沉淀，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇蒸出，得到產(chǎn)物白藜蘆醇。

1.2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測與含量分析 利用HPLCMS檢測的方法為：流動(dòng)相為乙腈∶水∶甲酸=40∶59.94∶0.06；色譜柱：GRACE Vydac 218TPC18；檢測波長：306 nm；柱溫：35℃。利用1H-NMR（400 MHz）檢測參照 Christian S 等［14］的方法，氘代丙酮（C3D6O）溶解產(chǎn)物干燥粉末樣品。利用HPLC檢測的方法為：流動(dòng)相為乙腈∶水∶磷酸=40∶59.82∶0.18；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18；檢測波長：306 nm；柱溫：35℃。配制1 mg/mL白藜蘆醇溶液，利用高效液相測定白藜蘆醇在進(jìn)樣量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL時(shí)的峰面積，得到白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1白藜蘆醇濃度與峰面積關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖 1 白藜蘆醇濃度與峰面積的關(guān)系（Y=0.380 5+6.665 5X，R=0.996 28）

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選與鑒定

利用1.2.1中所述的方法，篩選得到一株能夠分泌β-葡萄糖苷酶的菌株CGMCC 13129，因β-葡萄糖苷酶可水解固體培養(yǎng)基中的梔子苷，生成生產(chǎn)藍(lán)色絡(luò)合物京尼平，在菌落周圍出現(xiàn)了明顯的藍(lán)色，如圖2所示，證明該菌株能夠分泌β-葡萄糖苷酶。菌株經(jīng)革蘭氏染色呈陽性、短桿狀、有芽孢，芽孢中生、不膨脹，屬于典型的芽孢桿菌屬形態(tài)特征，其個(gè)體形態(tài)如圖3所示。

圖 2 菌株在初篩平板上的菌落形態(tài)

圖3 菌株的個(gè)體形態(tài)（100×10）

通過PCR獲得16S rDNA序列，經(jīng)測序，分析其大小為1 373 bp，利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明該菌與芽孢桿菌屬的多個(gè)沙福芽孢桿菌具有99%以上的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示。綜合菌株的16S rDNA序列分析，確認(rèn)該菌株為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis），保藏編號(hào)為CGMCC 13129。

2.2 利用沙福芽孢桿菌轉(zhuǎn)化虎杖苷生產(chǎn)白藜蘆醇

利用1.2.2中所述方法，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接菌前培養(yǎng)基澄清，如圖5所示。接菌后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，隨著菌體大量生產(chǎn)繁殖，培養(yǎng)基變得渾濁；搖瓶培養(yǎng)8 h后，有明顯的團(tuán)狀沉淀出現(xiàn)，上清液中菌體濃度明顯降低，如圖6所示，產(chǎn)物難溶于水在液體培養(yǎng)基中結(jié)晶析出，搖瓶底部出現(xiàn)大量白色沉淀。

圖 4 菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖 5 接種B.safensis菌前的培養(yǎng)液

圖 6 接種B.safensis菌后轉(zhuǎn)化8 h的培養(yǎng)液

2.3 底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化結(jié)果的影響分析

利用1.2.2中所述方法對(duì)虎杖苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別對(duì)底物濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，由圖7可知，當(dāng)?shù)孜锘⒄溶諠舛葹?.1%時(shí)轉(zhuǎn)化率較高，為90%左右；當(dāng)?shù)孜锘⒄溶諠舛葹?.2%時(shí)，轉(zhuǎn)化率趨近于0%。隨著底物虎杖苷濃度增加，轉(zhuǎn)化率迅速降低，底物濃度過高影響菌體生長繁殖，而導(dǎo)致底物幾乎不被轉(zhuǎn)化。由圖8可知，當(dāng)轉(zhuǎn)化時(shí)間為8 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率較高，短于或長于8 h，轉(zhuǎn)化率均降低；6 h時(shí)因未完全轉(zhuǎn)化導(dǎo)致測得的轉(zhuǎn)化率較低，而轉(zhuǎn)化時(shí)間過長，產(chǎn)物白藜蘆醇被降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降，朱屹東［15］也分析了類似的問題，利用沙福芽孢桿菌轉(zhuǎn)化虎杖苷8 h，轉(zhuǎn)化率就能達(dá)到90%，可大大縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間，顯著降低白藜蘆醇的工業(yè)化生產(chǎn)成本。

圖 7 底物濃度與轉(zhuǎn)化率的關(guān)系

圖 8 轉(zhuǎn)化時(shí)間與轉(zhuǎn)化率的關(guān)系

2.4 產(chǎn)物的分析與檢測

2.4.1 利用HPLC檢測產(chǎn)物 利用1.2.3中方法檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，對(duì)比圖9和圖10可知轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相同，產(chǎn)物經(jīng)甲醇萃取一次，純度可高達(dá)99.3%。

2.4.2 利用HPLC-MS檢測產(chǎn)物的純度 利用1.2.3中方法對(duì)產(chǎn)物純度進(jìn)行檢測，白藜蘆醇分子量為：228.25，分析圖11及圖12可知轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品分子量相同，確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為白藜蘆醇，且純度較高。

圖9 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖10 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物HPLC圖

圖 11 白藜蘆醇標(biāo)品HPLC-MS圖

2.4.31H-NMR檢測產(chǎn)物的結(jié)構(gòu) 利用1.2.3中1H-NMR檢測方法對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，分析圖13，1H-NMR（400 MHz，C3D6O）：δ 7.02（d，J = 16 Hz，1H），6.88（d，J = 16 Hz，1H），可知產(chǎn)物為反式白藜蘆醇。

3 討論

圖 12 產(chǎn)物HPLC-MS圖

圖13 產(chǎn)物1H-NMR圖

目前國內(nèi)利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)白藜蘆醇的研究已較多，但主要集中在利用黑曲霉［16］、根霉菌［17］、釀酒酵母工程菌［18-21］等真菌轉(zhuǎn)化，真菌轉(zhuǎn)化耗時(shí)較長，需5-8 d左右，且不利于產(chǎn)物白藜蘆醇的分離純化。而關(guān)于細(xì)菌轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的報(bào)道較少，國內(nèi)朱屹東［15］構(gòu)建了一株強(qiáng)化酪氨酸合成的白藜蘆醇生產(chǎn)菌株，以葡萄糖為底物，最終白藜蘆醇產(chǎn)量為71.6 mg/L，副產(chǎn)物主要有白藜蘆醇二聚體和氧化白藜蘆醇；本方法的產(chǎn)量是其方法的4倍且?guī)缀鯚o副產(chǎn)物。國外的研究中，Watts 等［22］以香豆酸作為底物，白藜蘆醇產(chǎn)量為100 mg/L；Katsuyarnal 等［23］以香豆酰輔酶A為底物，白藜蘆醇產(chǎn)量為171 mg/L Lim和Koffas 等［24］以對(duì)香豆酸為底物，白藜蘆醇產(chǎn)量達(dá)到2.3 g/L。利用沙福芽孢桿菌轉(zhuǎn)化底物虎杖苷生成白藜蘆醇，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90%以上，僅8 h即可完成一次轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程中，培養(yǎng)基由澄清變?yōu)闇啙幔詈笥肿兊幂^澄清。在顯微鏡下觀察菌體和產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌體被包含在產(chǎn)物內(nèi)部，分析該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是產(chǎn)物白藜蘆醇在轉(zhuǎn)化過程中，以菌為晶核，因難溶于水而結(jié)晶析出。這個(gè)現(xiàn)象為后期產(chǎn)物的分離純化提供了良好的先決條件，使得產(chǎn)物經(jīng)一步甲醇萃取過程，純度便可高達(dá)99.3%。

沙福芽孢桿菌分離自常年種植虎杖植物的土壤，而虎杖植物中虎杖苷的含量較低，自然條件下，菌株適應(yīng)低濃度虎杖苷的環(huán)境，對(duì)底物虎杖苷的耐受能力較弱，高濃度底物虎杖苷對(duì)菌體生長繁殖影響較大，當(dāng)?shù)孜锘⒄溶諠舛仍黾訒r(shí)，底物轉(zhuǎn)化率顯著下降，甚至無轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生成。綜合考慮研究中出現(xiàn)的問題，對(duì)比構(gòu)建高效的外源基因表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞固定化與敲除底物濃度限制因素的基因等3種方法的優(yōu)勢與劣勢，后續(xù)會(huì)考慮對(duì)沙福芽孢桿菌全基因組測序，改造其代謝途徑，提高其對(duì)底物的耐受性，進(jìn)一步提高底物的轉(zhuǎn)化率。

4 結(jié)論

在肉湯培養(yǎng)基中，底物濃度為0.1%，接種量為7%，37℃，220 r/min搖瓶轉(zhuǎn)化8 h，轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%以上。經(jīng)甲醇萃取一次，純度可高達(dá)99.3%；通過HPLC、HPLC-MS、1H-NMR檢測確定產(chǎn)物為反式白藜蘆醇。

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The Screening of β-Glycosidase-producing Strain and the Transforming of Resveratrol

FENG Wei HU Xiao-yan MA Ming-na GUO Meng LU Fu-ping LI Yu
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Resveratrol has a lot of benefits such as anti-cancer and anti-oxidation，and thus is widely applied in cosmetics，medicine and so on. This study aims to screen bacteria which can secrete β-glycosidase and study it’s ability of transforming polydatin. Through the geniposide plate screening and polydatin shake flask，a strain secreting β-glucosidase and transforming polydatin to resveratrol was acquired. It was identified as Bacillus safensis by 16S rDNA sequence analysis，named as CGMCC 13129. Under these conditions of 37℃，with 7 percent of inoculation，pH7，and conversing for 8 h，the conversion rate of polydatin was up to 90%. HPLC，HPLC-MS and1H-NMR were used to test and identify the product as resveratrol，and the purity of the product was up to 99.3% by one-time methanol extraction.

resveratrol；Bacillus safensis；β-glycosidase enzyme；polydatin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0439

2017-05-27

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)項(xiàng)目（2016YFD0400803）

馮薇，女，本科，研究方向：微生物與生化藥學(xué)；E-mail：fengwei@mail.tust.edu.cn

李玉，女，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn

（責(zé)任編輯 朱琳峰）