利用糖基轉移酶UGT73B6在大腸桿菌中生物催化酚苷類天然產物

何慶林 白艷芬 周威 殷華 陳寧 莊以彬 劉濤

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

利用糖基轉移酶UGT73B6在大腸桿菌中生物催化酚苷類天然產物

何慶林1，2白艷芬2周威2殷華2陳寧1莊以彬2劉濤2

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

植物紅景天來源的糖基轉移酶UGT73B6，具有底物寬泛性，能糖基化多種天然化合物。旨在實現在大腸桿菌中生物催化合成酚苷類化合物。利用糖基轉移酶UGT73B6的催化活性，在大腸桿菌BL21（DE3）中飼喂7種不同酚類化合物，通過生物轉化的方法，首次實現利用糖基轉移酶UGT73B6催化8種糖苷化合物的合成，進一步探索了糖基轉移酶UGT73B6的底物寬泛性。在此基礎上，提供了一種通過微生物轉化實現生物合成酚苷類化合物的方法，具有較大的應用價值。

糖基轉移酶UGT73B6；生物轉化；酚苷類化合物；大腸桿菌

天然產物的糖基化在生物體中發揮著重要作用［1-4］，不僅使代謝產物變得豐富多樣，而且可改變化合物的理化性質，如增加溶解度、增強穩定性、促進在活細胞中的儲存和積累以及調節其化學性質和生物活性。酚類化合物廣泛存在于自然界中，從簡單的酚酸到復雜的黃酮類和花青素等［5］。據報道，酚類化合物具有抗衰老、抗氧化、抗惡性細胞增殖等功能［6］。酚類化合物的糖基化在植物和微生物中有著重要的意義，如改變花的顏色，增加苷元的可溶性和降低外源物質的毒性等［7-8］。此外，酚類化合物糖基化可提高其生物活性，如柚皮苷、熊果苷和水楊苷等［7，9］。有研究發現，將水飛薊素A進行糖基化得到水飛薊素A-7-O-β-吡喃葡萄糖苷后，其生物利用率顯著提高［10］。糖基化修飾可以使外源化合物的理化性質與生物活性發生明顯變化，利用生物技術改變天然產物的糖基化類型從而獲得更多的天然產物及其衍生物成為該領域的研究熱點［11-17］。

Ma等［18］利用RACE技術從紅景天植株中分離得到糖基轉移酶UGT73B6，并證明該酶可以將酪醇轉化為紅景天苷。UGT73B6是首個報道的參與紅景天苷合成的糖基轉移酶。本實驗室利用UGT73B6實現了紅景天苷和天麻素在大腸桿菌中異源合成，并且產物中同時合成了酪醇、對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛葡萄糖基化副產物［19］。因此，UGT73B6對小分子酚類化合物具有一定的底物寬泛性。

本研究為進一步探索糖基轉移酶UGT73B6潛在底物，利用大腸桿菌全細胞生物轉化的方法，在UGT73B6重組菌中飼喂7種不同種類的酚類化合物，以期實現其相應的糖苷化合物的合成，旨為酚苷類化合物的生物合成提供案例參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）由本實驗室保存。質粒pET28a購于Novagen公司。質粒pGEX-4T-1-ugt73b6由上海捷瑞公司合成。

1.1.2 試劑 Phusion超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs公司；限制性內切酶Nde I、Bam HI 購自Fermentas公司；T4連接酶購自TaKaRa Biotechnology 公司；3，5-二羥基甲苯、4-甲氧基苯酚、間甲基苯酚、對羥基苯丙酸、白藜蘆醇、愈創木酚、香豆酸標準品購自百靈威公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養基 LB培養基：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；M9培養基：磷酸氫二鈉12.8 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，氯化鈉0.5 g/L，氯化銨1 g/L，葡萄糖2 g/L，硫酸鎂0.24 g/L，氯化鈣11.1 g/L。

1.1.4 實驗底物 本研究選擇了7種小分子的酚類化合物作為UGT73B6的潛在底物進行全細胞轉化實驗。所用底物及其結構見表1。

表1 本研究所選用底物及其結構

1.2 方法

1.2.1 質粒pET28a-ugt73b6及重組菌BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6的構建 ugt73b6（GenBank accession number：AY547304）來自庫頁紅景天（Rhodiola sachalinensis），由上海捷瑞公司合成，為了在大腸桿菌中使用進行了密碼子優化，用ugt73b6syn來表示。合成的ugt73b6syn基因片段被克隆到pGEX-4T-1載體，由捷瑞公司構建成pGEX-4T-1-ugt73b6。以限制性內切酶Nde I和BamH I對pET28a質粒和pGEX-4T-1-ugt73b6分別進行酶切；通過凝膠電泳回收載體及基因片段；以載體與基因片段摩爾數比為1∶3進行連接，獲得質粒pET28a-ugt73b6。質粒pET28augt73b6轉化至BL21（DE3），獲得重組菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6。質粒pET28a轉入到BL21（DE3）中，獲得菌株BL21（DE3）/ pET28a。

1.2.2 SDS-PAGE檢測蛋白表達 分別挑取BL21（DE3）/pET28a與 BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6菌株單克隆于3 mL液體LB中，37℃培養12 h；按體積比1∶100轉接至50 mL液體LB培養基，37℃培養至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG于16℃進行蛋白誘導24 h，收集發酵液2 mL，12 000 r/min離心10 min；加入200 μL的5 ×loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，上樣量 5 μL。

1.2.3 全細胞轉化 挑取重組菌BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6與BL21（DE3）/pET28a單克隆，分別接種至3 mL液體LB中，37℃培養12 h；按體積比1∶100轉接至50 mL液體LB培養基，37℃培養至OD600為0.6-0.8，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG于16℃進行蛋白誘導，蛋白誘導時間為24 h；4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入50 mL M9Y發酵培養基（含0.025% Yeast Extract）進行重懸；培養基中添加終濃度為2 mmol/L的催化底物，于30℃繼續培養，48 h后取樣進行產物檢測。

1.2.4 發酵產物HPLC和LC-MS 分析檢測 取發酵液1 mL，12 000 r/min離心10 min，收集上清。HPLC檢測系統是島津液相色譜儀；檢測條件為：HPLC流動相A = 水（含0.1%甲酸），B = 甲醇；流速 = 1 mL/min，溶液配比為二元濃度梯度，洗脫條件：0-5 min 5% B，6-45 min 5% B到100% B；進樣量20 μL；液相色譜柱為Agela Innoval C18柱（4.6× 250 mm）；UV檢測波長254 nm。

LC-MS檢測：配有紫外檢測器的安捷倫1260系統和配有ESI離子源探針的bruker microQ-TOF Ⅱ質譜儀，檢測條件包括：Agela Innoval C18柱（4.6 ×250mm）；UV檢測波長254 nm；流動相A =水（含0.1%甲酸），B =甲醇；流速 = 1mL/min，溶液配比為二元濃度梯度，洗脫條件：0-5 min 5% B，6-45 min 5%B到100% B；進樣量20 μL；ESI正離子源，分子量掃描范圍50-800。

1.2.5 糖苷化合物的分離制備 按照1.2.3所述方法進行發酵液的制備，發酵總量為1 L。發酵結束后，將發酵液4 000 r/min離心15 min，取上清。將預處理好的大孔樹脂SP-825（樹脂用量為發酵液體積的50%）裝入層析柱，加入發酵液離心后的上清，流速可控制在2 mL/min，使樹脂充分吸附發酵產物，待發酵液流盡后，用兩倍柱體積的水洗脫殘留在樹脂柱中的雜質，之后用80%乙醇洗脫兩個柱體積，收集洗脫液，分離得到的溶液用旋轉蒸發儀減壓濃縮。最后，用1-2 mL甲醇將分離得到的各組分從旋蒸瓶中轉移出來。HPLC分離條件為：島津高效液相色譜半制備儀，測定條件包括：檢測器SPD-20A，檢測波長254 nm；流動相A = 水（含0.1%體積甲酸）B = 甲醇；流速 = 4 mL/min；洗脫條件：65%A和35%B；進樣量100 μL。

1.2.6 糖苷化合物的NMR檢測 樣品經干燥后溶于500 μL為氘代甲醇轉入直徑2.5 mm核磁管中，用Bruker Avance III 400 MHz核磁共振儀測定1H NMR。

2 結果

2.1 載體pET28a-ugt73b6的驗證

重組載體pET28a-ugt73b6用Nde I和BamH I酶切驗證，得到大小為1.5 kb和5.3 kb兩條帶（圖1），與理論大小一致，并送金唯智測序公司進行了DNA測序驗證。

圖1 載體pET28a-ugt73b6構建

2.2 SDS-PAGE檢測ugt73b6蛋白表達

BL21（DE3）/ pET28a與 BL21（DE3）/pET28augt73b6菌株按照1.2.2的方法發酵并誘導蛋白，制備樣品，進行蛋白膠電泳，染色，脫色后SDSPAGE如圖2所示，UGT73B6蛋白條帶大小為 53.9 kD，說明目的蛋白成功表達。

2.3 發酵液中產物HPLC及LC-MS鑒定

按方法1.2.3進行全細胞轉化實驗，對菌株 BL21（DE3）/ pET28a和 菌 株 BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6進行發酵培養，取48 h的發酵液進行HPLC檢測，結果如圖2-9所示，其中菌株BL21（DE3）/ pET28a均無新化合物產生，菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6中7種底物都有新化合物的合成（四角星所對應的峰）。對新化合物進行LC-MS檢測，結果表明7種底物都發生葡萄糖基化，因此推斷糖基轉移酶UGT73B6對所選取的7種小分子的酚類化合物都有催化活性，生成了糖苷化合物。

圖2 BL21（DE3）/pET28a與BL21（DE3）/pET28augt73b6SDS-PAGE檢測圖

2.4 白藜蘆醇糖苷化合物的1H NMR鑒定

圖3 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加底物3，5-二羥基甲苯HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖4 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加底物4-甲氧基苯酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖5 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物間甲基苯酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖6 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物愈創木酚HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖7 菌株BL21（DE3）/ pET28a-ugt73b6添加底物香豆酸HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖8 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加對羥基苯丙酸HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

圖9 菌株BL21（DE3）/pET28a-ugt73b6添加白藜蘆醇HPLC（A）及LC-MS（B）檢測結果

為進一步確定圖9中a與b兩種白藜蘆醇糖苷化合物的結構，對這兩種化合物進行1H NMR鑒定。化合物a的1H NMR顯示，該化合物結構中含有一個對位取代的苯環［δH= 7.38（d，J = 8.6 Hz，2 H），6.77（d，J = 8.6 Hz，2 H）］，一個間位三取代的苯環［δH= 6.95（d，J = 2.1 Hz，1 H），6.77（d，J = 8.6 Hz，2 H）］，一個雙鍵［7.08（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.89（d，J= 16.3 Hz，1 H）］，這與苷元白藜蘆醇結構一致，另外化合物含有典型的葡糖糖苷分子信號［4.94（d，J= 7.5 Hz，1 H），3.94（dd，J = 12.0，2.2 Hz，1H），3.70（dd，J = 12.0，6.3 Hz，1H），3.56-3.33（m，4 H）］，結合橋頭碳上氫的耦合常數為7.5 H，可確定為β構型糖苷鍵，參照相關文獻［20-21］可以最終確定保留時間為25.5 min的化合物a為白藜蘆醇-4'-O-β-D-葡萄糖苷；另一保留時間為27.5 min的化合物b的1H NMR顯示，該化合物同樣具有白藜蘆醇苷元結構［δ = 7.45（d，J = 8.8 Hz，2 H），7.08（d，J =8.8 Hz，2 H），7.00（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.88（d，J = 16.3 Hz，1 H），6.47（d，J = 2.2 Hz，2 H），6.18（t，J = 2.1 Hz，1 H）］，高場區信號顯示化合物為葡萄糖苷產物，根據橋頭碳原子上氫的耦合常數為7.5 H，可確定為β構型糖苷鍵，結合文獻報道［20-21］化合物b鑒定為白藜蘆醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。

3 討論

本研究通過微生物轉化實驗，利用糖基轉移酶UGT73B6，飼喂7種不同的酚類化合物，首次實現利用糖基轉移酶UGT73B6獲得相應的8種糖苷化合物。

基于3，5-二羥基甲苯、4-甲氧基苯酚、間甲基苯酚、對羥基苯丙酸、愈創木酚和香豆酸結構特點，可根據HPLC及LC-MS檢測結果確定所對應糖苷化合物的結構。底物白藜蘆醇因具有多個羥基，為了確定具體的催化位置，對其進行放大發酵實驗，提取分離獲得催化產物，經NMR檢測，確定了糖基轉移酶可以分別催化白藜蘆醇3和4'位的羥基形成單糖苷化產物。這表明糖基轉移酶UGT73B6能夠催化白藜蘆醇合成不同結構類型的糖苷化合物，為其多羥基底物合成結構多樣的糖苷化合物提供了一種有效的方法。

基因ugt73b6來源于植物紅景天，本研究中僅對其DNA序列進行了密碼子優化，為了使蛋白在大腸桿菌中更好的表達，接下來可以對誘導劑IPTG濃度和蛋白誘導溫度進行優化，以確定更合適的蛋白誘導條件，未來工作中還可以通過提高蛋白的可溶性等方面來提高蛋白的表達及活性［22］，從而進一步提高糖苷化合物的產量。另外，可以對ugt73b6基因進行易錯PCR篩選以及定點飽和突變，從而得到催化效率更高的突變體，以提高產物的產量；并且可以進一步探索糖基轉移酶ugt73b6的底物寬泛性，研究該酶對底物的催化規律。

生物轉化法修飾天然產物，不僅僅應用于酚類化合物，還可以應用于萜類、甾體類、生物堿以及黃酮類等多種結構類型的化合物，在增加天然化合物的結構多樣性方面具有極大的潛力［23］。我國天然產物資源豐富，在天然化合物領域擁有良好的研究基礎，目前已經分離鑒定了大量的不同結構類型的天然產物，可進一步將生物轉化技術引入到天然產物的研究中，包括資源開發、藥物設計和新的活性先導化合物的發現與篩選等各個環節，從而開發出擁有自主知識產權、并具有中國特色的創新藥物［24］。

糖基化可賦予多酚類化合物新的特性及生物學活性，是新藥篩選的一個重要手段，逐漸成為國內外天然藥物開發利用研究的熱點。本研究中得到的8種糖苷類化合物都具有重要的實用價值及研究價值，研究選取的7種酚類化合物底物，其中，白藜蘆醇是天然的抗氧化劑，能夠降低血液黏稠度、保持血液暢通等；間甲基苯酚主要用作農藥中間體，生產殺蟲劑；4-甲氧基苯酚可用作乙烯基型塑料單體的阻聚劑、紫外線抑制劑和化妝品的抗氧化劑等；愈創木酚和3，5-二羥基甲苯多用于香料、染料的合成；香豆酸和對羥基苯丙酸是重要的醫藥和材料中間體。糖基化也許能夠賦予它們新的生物活性，為進一步研究其藥用功能奠定基礎。

4 結論

本研究在大腸桿菌BL（DE3）中，利用糖基轉移酶UGT73B6，飼喂7種不同底物，成功獲得相對應的糖苷化合物。不僅展示了糖基轉移酶UGT73B6對酚類化合物的底物寬泛性，并且為天然化合物的分子結構修飾提供了一種新的途徑。

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Biocatalysis of Phenolic Glycosides Natural Products in Escherichia coli Strain Using UGT73B6

HE Qing-lin1，2BAI Yan-fen2ZHOU Wei2YIN Hua2CHEN Ning1ZHUANG Yi-bin2LIU Tao2
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Science；Tianjin 300308）

The glycosyltransferase UGT73B6 from Rhodiola sachalinensis with substrate flexibility can glycosylate many natural products catalyzed by UDP-glycosyltransferases（UGTs）. To achieve the biosynthesis of phenolic compounds in Escherichia coli，in this study，we utilized the catalytic activity of the glycosyltransferase UGT73B6 and fed 7 different phenolic compounds in Escherichia coli BL21（DE3）.By using biotransformation，we successfully achieved the biocatalysis of 8 glycoside compounds for the first time in Escherichia coli with UGT73B6，and further we explored the substrate flexibility of UGT73B6. On the basis of this study，we provided an effective and economical method to produce phenolic glycosides by microbial transformation，which has a great application value.

glycosyltransferase UGT73B6；biotransformation；phenolic glycosides；Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0363

2017-06-06

國家自然科學基金資助項目（31400026，21302214），中國科學院戰略生物資源服務網絡計劃項目（ZSTH-023）

何慶林，男，碩士研究生，研究方向：天然產物合成生物學；E-mail：15002262485@126.com

莊以彬，男，博士，研究方向：天然產物合成生物學；E-mail：zhuang_yb@tib.cas.cn劉濤，男，博士，研究員，研究方向：天然產物合成生物學；E-mail：liu_t@tib.cas.cn

（責任編輯 朱琳峰）