血管內(nèi)皮細(xì)胞m iR-126、m iR-155與高血壓病血瘀證的相關(guān)性研究

尹蓮花，許藝惠，鄭 彥，黃守清

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

血管內(nèi)皮細(xì)胞m iR-126、m iR-155與高血壓病血瘀證的相關(guān)性研究

尹蓮花，許藝惠，鄭 彥，黃守清

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

目的 探討血管內(nèi)皮細(xì)胞中m iR-126、m iR-155的表達(dá)與高血壓病血瘀證的相關(guān)性及其可能的病理作用機(jī)制。 方法 募集60例高血壓病血瘀證患者（血瘀證組）、60例高血壓病非血瘀證患者（非血瘀證組）、60例健康人群（健康組）作為研究對(duì)象，采集3組空腹靜脈血，比較3組血液中miR-126、miR-155的表達(dá)和VCAM-1、TM的含量。 結(jié)果 與健康組比較，非血瘀證組和血瘀證組m iR-126、m iR-155的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），VCAM-1、TM含量明顯升高（P＜0.01）；與非血瘀證組比較，血瘀證組m iR-126、m iR-155表達(dá)和 VCAM-1、TM含量明顯升高（P＜0.05）。 結(jié)論 m iR-126、m iR-155可能參與高血壓病非血瘀證向血瘀證發(fā)展的過程，其作用機(jī)制可能為通過上調(diào)VCAM-1的表達(dá)介導(dǎo)ECs的炎癥反應(yīng)；TM可作為高血壓病血瘀證的微觀辨證指標(biāo)。

高血壓病；血瘀證；miR-126；miR-155；血管細(xì)胞粘附分子－1；血栓調(diào)節(jié)蛋白

眾多學(xué)者認(rèn)為，血瘀證在高血壓的發(fā)生、發(fā)展和演變過程中扮演重要角色，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是血瘀證發(fā)病的病理基礎(chǔ)，微小RNA（microRNAs，miRNAs）參與血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)［1］。 研究發(fā)現(xiàn)，血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion protein，VCAM-1）在高血壓及血瘀證中呈高表達(dá)［2］，而 miR-126、miR-155 可直接或間接調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）中 VCAM-1 的表達(dá)［3-4］。血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）被認(rèn)為是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的有效指標(biāo)［5］。本研究擬通過病例對(duì)照分析，從內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的角度，分析miR-126、miR-155的表達(dá)與高血壓病血瘀證的相關(guān)性，探討其可能的作用機(jī)制，即這種相關(guān)性是否與miR-126、miR-155調(diào)控VCAM-1的表達(dá)、進(jìn)而介導(dǎo)ECs的炎癥反應(yīng)有關(guān)，并進(jìn)一步明確TM是否可以作為高血壓病形成血瘀證的微觀辨證指標(biāo)。

1 臨床資料

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 高血壓病的診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)高血壓防治指南 2010》［6］。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照2011年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)修訂的《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診斷標(biāo)準(zhǔn)》［7］中血瘀證制定。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 符合上述診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～65歲；③ 簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 繼發(fā)性高血壓患者；② 合并冠心病、腦卒中等心腦血管疾病，肝腎疾病或造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；③ 檢測(cè)前2周內(nèi)服用過阿司匹林、華法林、皮質(zhì)醇激素、兒茶酚胺、噻氯匹定、波立維、肝素或活血化瘀類的中藥，以及其他可能影響凝血或纖溶的藥物；④ 精神病患者；⑤ 妊娠期或哺乳期婦女；⑥ 合并單純急性疾病（如急性闌尾炎等）或外傷患者；⑦ 惡性腫瘤患者。

1.5 一般資料 選擇2014年1月—2014年12月于我院體檢中心體檢的高血壓患者120例，根據(jù)中醫(yī)辨證分為血瘀證組和非血瘀組各60例。血瘀證組中男32例，女28例，平均年齡（41.81±7.37）歲，平均收縮壓（165.23±14.68）mmHg，平均舒張壓（102.36±7.96）mmHg；非血瘀證組中男 31例，女29例，平均年齡（42.15±8.21）歲，平均收縮壓（164.89±12.53） mmHg，平均舒張壓（104.82±8.26） mmHg。 2組在血壓上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。另選同一時(shí)段于中心體檢的健康人群60例為健康組，男30例，女30例，平均年齡（40.86±7.35）歲，平均收縮壓（120.53±10.63） mmHg，平均舒張壓（78.95±9.86）mmHg。3組在性別、年齡上比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。

2 方 法

2.1 主要試劑和儀器 mirVanaTMmiRNA I solation K it（美國(guó) Ambion 公司）；miScript Reverse Transcription Kit（德國(guó) Qiagen 公司）；miScript SYBR Green PCR Kit（德國(guó) Qiagen公司）；VCAM-1檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D公司）；TM檢測(cè)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；miRNA引物（廣州市銳博生物科技有限公司）；Biophotometer plus紫外分光光度計(jì)（德國(guó) Eppendorf公司）；Real-Time PCR 儀（美國(guó)ABI公司）；Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）。

2.2 miR-126、miR-155的檢測(cè)

2.2.1 總RNA提取及質(zhì)量鑒定 取空腹血漿400 μL，使用mirVanaTMmiRNA I solation K it提取血清總RNA，總RNA完整性由1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度，計(jì)算D260 nm／D280 nm和D260 nm／D230 nm，兩者分別表示RNA的濃度和純度。

2.2.2 RT-PCR檢測(cè) 使用miScript Reverse Transcription Kit將 1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，在 PCR反應(yīng)前，將cDNA用無(wú)RNase的水進(jìn)行1∶10稀釋。使用miScript SYBR Green PCR Kit在ABI 3700 Real-Time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）進(jìn)行PCR反應(yīng)。

miRNA引物為廠家提供的miScrit通用引物和miRNA特異性引物。miRNA特異性引物用Primer Express軟件v2.0版（Applied Biosystems）進(jìn)行設(shè)計(jì)。miRNA序列由miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，選用U6 snRNA（GenBankEntrez：M14486）作為內(nèi)參。miR-126 引物序列：5’-UCGU ACCGUGAGUAAUAAUGCG-3’（has-miR-126-3p MIMAT0000445，最佳退火溫度58.8 ℃ ，205 bp）。 miR-155 引 物 序 列 ：5’-UUAAUGCUAAUCGUGAU AGGGGU-3’ （has-miR-155-5p MIMAT0000646，最佳退火溫度58.3℃，181 bp）。

2.3 VCAM-1檢測(cè) 抽取受試者肘靜脈血5 mL，注入10 mL肝素抗凝，3500 r／m離心3 min，取上清液，-70℃冰箱凍存待測(cè)。使用雙抗夾心ELISA法和全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)血清VCAM-1的表達(dá)水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2.4 TM檢測(cè) 抽取受試者肘靜脈血1.8 mL置于0.2 mL 0.109 mmol／L枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝分離血漿。使用雙抗夾心ELISA法和全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度并對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)定TM的含量。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3組血漿中miR-126、miR-155的表達(dá)水平比較 見表1。

表1 3 組血漿中 m iR-126、m iR-155 表達(dá)比較（x±s）

3.2 3組血漿中VCAM-1、TM含量比較 見表2。

4 討 論

4.1 miR-126可以抑制血栓形成，并促進(jìn)血栓機(jī)化，同時(shí)增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞促血栓再通的作用［8］。miR-126還能抑制VCAM-1的表達(dá)，減少白細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，從而減輕血管炎癥［9］。本研究中血瘀組和非血瘀組的miR-126表達(dá)水平均低于健康組，其原因可能是miR-126的下降導(dǎo)致血管內(nèi)代謝發(fā)生紊亂，并進(jìn)一步激活血小板和內(nèi)皮細(xì)胞；血瘀證組miR-126的表達(dá)水平明顯高于非血瘀證組，這表明miR-126可能參與了非血瘀證向血瘀證發(fā)展的過程。

表2 3組血漿中 VCAM-1、TM 含量比較（x±s）

4.2 研究發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)miR-155可明顯抑制巨噬細(xì)胞對(duì)氧化性低密度脂蛋白的結(jié)合和攝取，從而抑制巨噬泡沫細(xì)胞的形成，提示miR-155可能參與了動(dòng)脈硬化的形成過程［10］。冠心病患者血漿中miR-155的表達(dá)水平明顯低于非冠心病患者，并且其表達(dá)隨著病情的加重而下降［11］。本研究中健康組miR-155的表達(dá)水平高于血瘀證組和非血瘀證組，這與既往研究結(jié)果一致；但血瘀證組miR-155的表達(dá)水平高于非血瘀證組，這與其他研究結(jié)果有異，一方面可能由于疾病的差異性導(dǎo)致結(jié)果差異，另一方面考慮高血壓病非血瘀證向血瘀證發(fā)展的過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷日益加重，炎癥因子的釋放逐漸增加，從而導(dǎo)致miR-155在血漿中的表達(dá)增加。

4.3 VCAM-1是miR-126直接或間接的靶基因，VCAM-1表達(dá)水平的升高與高血壓及血瘀證血管內(nèi)皮功能損傷的相關(guān)性已被眾多研究證實(shí)［12-15］。研究顯示，miR-126可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)參與血管炎癥反應(yīng)［3］。本研究中血瘀證組和非血瘀證組VCAM-1的表達(dá)水平均高于健康組，且血瘀證組明顯高于非血瘀證組，提示VCAM-1作為血瘀證血管內(nèi)皮功能異常的標(biāo)志，正是miR-126調(diào)控高血壓病血瘀證的機(jī)制靶點(diǎn)。

4.4 TM是高血壓病血瘀證的微觀辨證指標(biāo) TM存在于除腦血管外的所有ECs中，被認(rèn)為是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最佳指標(biāo)之一［12］。本研究中血瘀證組和非血瘀證組的血漿TM水平均高于健康組，且血瘀證組高于非血瘀證組，該結(jié)果與既往研究報(bào)道相符［16］，提示TM可作為高血壓形成血瘀證的微觀辨證指標(biāo)。

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R544.1

A

1000-338X（2017）05-0004-02

2017-03-08

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014J01344）

尹蓮花（1984—），女，從事健康管理及慢性病防治研究。

黃守清（1966—），男，副主任醫(yī)師。 E-mail：hsqtj@163.com