基于微衛星DNA標記分析福建獼猴與河南獼猴的遺傳多樣性

周建華 ，李志雄 ，楊燕燕 ，謝金東 ，俞春英 ，林 瑋 ，劉德強 ，王訓立

（1.福建中醫藥大學實驗動物中心，福建 福州 350122；2.福建省計劃生育科學技術研究所，福建 福州 350011）

基于微衛星DNA標記分析福建獼猴與河南獼猴的遺傳多樣性

周建華1，李志雄2，楊燕燕1，謝金東1，俞春英1，林 瑋1，劉德強1，王訓立1

（1.福建中醫藥大學實驗動物中心，福建 福州 350122；2.福建省計劃生育科學技術研究所，福建 福州 350011）

目的 應用微衛星DNA標記分析福建獼猴與河南獼猴的遺傳多樣性。 方法 采用14個微衛星DNA標記技術對福建獼猴與河南獼猴遺傳多樣性進行分析，經基因組DNA提取、PCR擴增、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等，用POPGENE 1.32等軟件統計分析。 結果 14個微衛星位點均存在高度的遺傳多態性，共檢測到了等位基因166個，其觀察等位基因數（Na）在 5～15個，平均為10.071 5個；有效等位基因數（Ne）為3.604 6～11.878 8；雜合度（H）為 0.735 7～0.932 5；香隆信息指數（I）為 1.395 7～2.557 8；多態信息含量（PIC）為 0.675 0～0.909 5。以14個微衛星標記為測度，福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴。 結論 本研究有效地分析了福建獼猴與河南獼猴兩群體的遺傳多態性，為今后建立兩種群遺傳質量監測方法提供理論依據。

微衛星標記；獼猴；遺傳多樣性

獼猴作為一種重要的實驗動物，已廣泛應用于生命科學及相關領域的科學研究，當今，利用珍貴的獼猴自然資源和人工養殖獼猴的規模正在不斷擴大。我國有豐富的獼猴資源，共有6個獼猴亞種，福建獼猴是其中亞種之一［1］。為了保護獼猴遺傳多樣性，保護地方特有獼猴的基因資源，有必要對不同地域的猴群進行遺傳背景調查，研究比較各地獼猴的遺傳多樣性現狀。微衛星DNA（microsatellite DNA），也稱為簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR），在生物基因組中一般以1～6個堿基為其核心序列、首尾相連組成串聯核苷酸重復序列。由于核心序列重復數目的不同，產生了DNA多態性，是一種理想的分子標記，已廣泛應用于遺傳圖譜的構建，親緣關系、遺傳多樣性分析，品種及菌株鑒別等［2-5］。 本研究從福建獼猴（福建亞種）（Macacamulatta littoralis）的原主產地―福建武夷山區野捕來的野生猴群中和從河南新野某養殖場引進的河南獼猴中各隨機抽取28只，利用14個微衛星DNA標記對該兩猴群進行遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 福建獼猴（福建亞種）和河南獼猴來源于福建省計劃生育科學技術研究所，各28只，普通級，雌雄各半，年齡8～14歲，體質量5～11 Kg，飼養于普通級動物實驗室；特許獵捕證（閩）：（獵）字 2008-1 號，準運證：（豫）動運字［2009］第 3、4、7號，實驗動物生產許可證：SCXK（閩）2010-0002號，實驗動物使用許可證：SPXK（閩）2010-0005號。

1.2 實驗試劑和儀器 Wizard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒（美國 Promega 公司），Gotaq?Green Master Mix試劑盒 （美國 Promega公司），pBR322 DNA／Msp I標記物（TIANGEN 公司，中國）。凝膠成像系統（美國BioRad公司），電泳儀、垂直電泳槽（北京六一儀器廠）和ABIVeriti梯度PCR儀（美國 ABI公司）。

1.3 基因組DNA提取 空腹自上肢靜脈抽取全血2 mL，EDTA抗凝。采用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取方法提取基因組DNA，詳細操作步驟見說明書。

1.4 引物設計及PCR擴增 自GenBank網站及相關文獻［6-11］查取具有多態性高的50個微衛星DNA標記，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

PCR擴增：反應體系25μL。反應程序為：95℃預變性 3 min；94℃變性 30 s，40℃～61℃復性30 s，72℃延伸 60 s，30個循環，72℃最終延伸 7min。擴增產物4℃保存。

1.5 電泳及結果記錄 50個微衛星DNA位點中在兩猴群中共有14個位點都呈特異性擴增，每個微衛星位點都有5個及以上等位基因，表現出不同程度的多態性。14個位點擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳測定是否在長度范圍之內；后經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染和凝膠成像系統照相保存。

1.6 統計學分析 用BioRad凝膠成像系統對8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖帶進行分析，確定其核苷酸條帶分子量大小，以大小不同的擴增片段為不同的等位基因按照從小到大的順序分別依次定名為 A、B、C、D、E……。用 POPGENE 1.32 軟件計算出各基因位點的等位基因頻率（gene frequency）、觀察等位基因數（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數（effective number of alleles，Ne）、雜合度（heterozygosity，H）、香隆信息指數（Shannon's information index，I）等指標，并根據Botstein等的公式利用Excel計算多態信息含量（polymorphism information content，PIC）。

2 結 果

2.1 PCR擴增結果檢測 對14個微衛星位點的PCR擴增產物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，本文以D21S1246位點的電泳圖譜為例說明，見圖1。

圖1 D21S1246位點PCR擴增產物進行的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 福建獼猴與河南獼猴14個微衛星位點的等位基因頻率分布信息 分析14個微衛星位點在福建獼猴和河南獼猴中的觀察等位基因數目及其頻率的分布信息，其能反映出個體間的遺傳概貌情況。14個微衛星位點在兩猴群中均存在高度的遺傳多態性，共檢測到了等位基因166個，觀察等位基因數（Na）有 5～15個，平均為10.0715個。其中，最多的位點是D1S207，福建猴和河南猴分別有15個和14個等位基因；最少的位點是D1S548，都有5個等位基因。見表1。

2.3 福建獼猴與河南獼猴14個微衛星位點的群體遺傳多樣性分析 有效等位基因數目（Ne）福建猴和河南猴分別為3.733 3～11.614 8和3.604 6～11.878 8，平均7.015 4和7.031 1個；雜合度（H）福建猴和河南猴分別為0.745 5～0.930 5和0.735 7～0.932 5，平均 0.855 9 和 0.857 7；香隆信息指數（I）福建猴和河南猴分別為 1.399 8～2.557 8和1.395 7～2.544 5之間，平均2.025 3和2.051 5；多態信息含量（PIC）福建猴和河南猴分別為 0.686 2～0.907 4和 0.675 0～0.909 5， 平均0.817 4和0.823 3。以上4個指標兩猴群都是D1S207位點最高，D1S548位點最低，并且福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴。見表2。

3 討 論

群體的遺傳多樣性通常使用多個基因位點遺傳多樣性參數的平均值來描述。有效等位基因（Ne），其值為純合度的倒數。等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數越接近所檢測到的等位基因的絕對數，它表明等位基因之間的相互影響情況。香隆信息指數（I）表示群體內多態性位點數多少和頻率分布情況，描述了群體內以標記為單位的平均離散程度，即多樣性；I值越大則群體的離散性越高，多樣性越豐富。雜合度（H）是群體內遺傳變異的量度，其值的高低反映了群體內個體的均勻度，若數值高，表明遺傳變異大，反之則群體內的遺傳變異就小。多態信息含量（PIC）用以描述微衛星位點的變異程度，當PIC＞0.5時，為高度多態位點。

從表1可以看出，14個微衛星位點中，除D1S548外各位點的等位基因數目和大小，群體間都有一定的差別，大都有各自的特有等位基因；所有位點的等位基因頻率，兩猴群也基本不同，體現出不同的遺傳差異。從表2可以看出，14個微衛星位點中，兩猴群的Ne數目從3.604 6～11.878 8不等，H和I都比較高，PIC值皆大于0.5，說明這14個微衛星位點具有較高的可信度，均屬于高度多態性位點，能較好地反映福建獼猴與河南獼猴兩猴群的遺傳多樣性。

從表2也可以看出，福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴，這種差別可能與地域來源及飼養管理方式有關。本實驗福建獼猴來源為野生獼猴，其生活習性存在著一定程度的近交繁殖［12］。河南獼猴引進于新野一家新建的養殖場，其獼猴來源不一，群體的基因流較雜，檢測到的遺傳多樣性相對較高。這與季芳等［13］對海南和廣西獼猴的遺傳多樣性研究的結果相類似，島嶼型猴群（海南）的遺傳變異低于大陸型猴群（廣西）。福建野生猴群由于自然地域的隔離，基因交流少；而人工養殖，如有嚴格的飼養繁殖制度和遺傳監控，適時引進種猴，隨機交配，避免近交繁殖，群體的基因交流范圍廣，遺傳多樣性就較豐富。

表1 福建獼猴和河南獼猴14個微衛星位點的等位基因頻率信息

表2 福建獼猴和河南獼猴兩群體14個微衛星位點的遺傳多態性

本研究利用14個微衛星位點，分析了福建獼猴與河南獼猴兩群體的遺傳多態性，為今后兩種群制定科學的繁殖措施，建立完善的遺傳譜系和遺傳質量監測方法及保護策略提供理論依據，對保護獼猴這一珍貴的實驗動物具有重要的現實意義。

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R－332

A

1000-338X（2017）05-0030-04

2017－07－03

福建省實驗動物研究重點項目（2014Y0080）。

周建華（1969—），男，高級實驗師，主要從事實驗動物學研究。

王訓立（1964—），男，研究員。 E-mail：wxl@fjtcm.edu.cn