外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關性研究

艾思迪，丁 茹，賀治青，吳宗貴，梁 春

·臨床醫學論著·

外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關性研究

艾思迪，丁 茹，賀治青，吳宗貴，梁 春

目的觀察冠心病病人外周血中淋巴細胞維生素D受體(VDR)表達的變化情況，并探討其在冠心病病人診治中的潛在價值。方法采用流式細胞術檢測50例冠心病病人及30名健康對照志愿者外周血淋巴細胞VDR的表達水平(平均熒光強度VDR-MFI)，同時收集相關資料并檢測血脂、空腹血糖、糖化血紅蛋白、維生素D等指標。結果冠心病病人淋巴細胞的log10VDR-MFIs顯著低于健康對照人群(P=0.028)，且與糖化血紅蛋白呈負相關(r= -0.347，P=0.002)；多因素分析提示log10VDR-MFIs與冠心病獨立相關(OR=0.051，P=0.019)。結論與健康人群相比，冠心病病人淋巴細胞表面VDR表達顯著降低，且與糖化血紅蛋白水平呈負相關，外周血淋巴細胞表面VDR表達降低可能是冠心病的潛在危險因素。

冠心病；外周血；淋巴細胞；維生素D受體

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎，其發病機制尚未闡明，免疫應答在動脈粥樣硬化的發展中起著重要作用[1]。近年研究發現維生素D對免疫系統有干預作用，通過作用于T淋巴細胞相關的免疫反應。維生素D生物活性形式1，25-二羥基維生素D3通過與特異性受體維生素D受體(VDR)結合而調節相關的基因表達，調節階梯免疫系統功能，目前已知VDR廣泛表達于T淋巴細胞、巨噬細胞、胸腺內未成熟的淋巴細胞及成熟的CD8淋巴細胞，但其功能和臨床意義尚不清楚[2]。本研究旨在觀察冠心病病人與健康對照人群外周血中淋巴細胞VDR表達的差異，初步探討外周血淋巴細胞VDR表達在冠心病診治中的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年4月—12月本院心內科首次住院病人80例，均行冠狀動脈造影檢查。根據冠狀動脈造影是否正常分組，冠心病組左主干、左前降支、左旋支、右冠狀動脈或其主要分支狹窄≥50%，共50例。健康對照組，冠狀動脈造影正常或心肌橋，共30例。排除標準：心肌病、慢性心房纖顫、合并Ⅲ/Ⅳ級心功能不全(紐約心臟病學會分級)、過去6個月內經歷過再血管化治療；慢性腎功能不全[估算腎小球濾過率lt;90 mL/(min·1.73 m2)]、慢性肝病、腸道功能性和炎癥性疾病、與維生素D相關的代謝性疾病、嚴重感染、腫瘤、嗜酒以及3個月內正在服用含維生素D制劑的藥物。

1.2 一般資料采集、生化指標檢查及SYNTAX評分 采集所有病人高血壓病、糖尿病、吸煙等一般資料；于次日清晨空腹采集外周靜脈血，檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血糖、超敏C反應蛋白(hs-CRP)及25羥維生素D[25(OH)D]等；SYNTAX由兩名高年資冠狀動脈介入主任醫生明確冠狀動脈病變情況后，再由兩名介入醫師按SYNTAX評分要求將結果逐項輸入SYNTAX評分器(2.1版本)，計算SYNTAX分值。SYNTAX評分lt;22分為低SYNTAX評分組，SYNTAX評分≥22分位高SYNTAX評分組[3]。

1.3 淋巴細胞表面VDR檢測方法 取100 μL用肝素抗凝的全血，加入5 μL FcR阻斷抗體，孵育10 min，按照說明書后加入小鼠抗人CD45抗體(FITC； Beckton Dickinson)及小鼠抗人 VDR 抗體(Abcam)，冰上孵育10 min。用生理鹽水洗滌游離抗體后加入大鼠抗小鼠二抗(APC；Abcam)，孵育10 min，再經過紅細胞裂解、洗滌、重懸后通過流式細胞檢測淋巴細胞表面VDR平均熒光強度(VDR-MFIs)。以CD45和SS分別為坐標軸圈取淋巴細胞群[4]，檢測APC陽性信號的平均熒光強度。由于VDR-MFI原始數值分布偏態，故采用log10對原始數值進行轉化再進行后續統計分析。

2 結 果

2.1 流式細胞檢測淋巴細胞VDR結果 流式細胞儀檢測淋巴細胞VDR的結果圖。圖1a：應用CD45和SS建立直方圖，根據CD45和SS指標特征，選擇淋巴細胞群進行分析。圖1b是對圖1a所選取的淋巴細胞檢測VDR受體，VDR+門內的細胞為VDR陽性細胞，如圖1b所示，所有的淋巴細胞均為VDR陽性細胞。

圖1流式細胞檢測淋巴細胞VDR結果圖

2.2 兩組臨床資料比較 冠心病組患糖尿病比例大于對照組(P=0.001)，糖化血紅蛋白水平(Plt;0.001)及空腹血糖(P=0.004)也顯著高于對照組。兩組年齡、性別比例、吸煙比例及血脂水平無統計學意義。詳見表1。冠心病組log10VDR-MFIs顯著低于對照組(3.09±0.37 vs 3.26±0.30 P=0.028)，兩組25(OH)D水平無統計學意義。冠心病病人中高SYNTAX評分亞組的高血壓及糖尿病病人比例顯著高于低SYNTAX評分組(Plt;0.05)，空腹血糖、LDL-C及HbA1c水平均高于低SYNTAX評分組，兩組log10VDR-MFIs及25(OH)D水平無。詳見表2、圖2。

表1 兩組病人臨床資料比較

表2 冠心病各亞組病人臨床資料

圖2對照組與冠心病組log10VDR-MFIs及25(OH) D水平比較

2.3 相關性分析 各個臨床參數與log10VDR-MFIs的相關性，可見log10VDR-MFIs和HbA1c成顯著負相關(r=-0.347，P=0.002，見圖3)。除了HbA1c之外，其他的臨床參數如年齡、血脂、hs-CRP、25(OH)D、SYNTAX評分與log10VDR-MFIs無相關性。詳見表3。

表3 淋巴細胞log10VDR-MFIs與臨床指標之間的相關性分析

圖3 Log10VDR-MFIs與HbA1c之間相關性分析

2.4 單因素及多因素Logistic回歸分析 以有無冠心病為因變量，其他為自變量，進行Logistic回歸分析，單因素分析提示糖尿病、高水平HbA1c及log10VDR-MFIs降低是冠心病的危險因素，多因素分析則提示log10VDR-MFIs降低是冠心病的獨立危險因素(OR=0.051，P=0.019)。以SYNTAX積分高低為因變量，其他為自變量，進行Logistic回歸分析，單因素分析提示高血壓、糖尿病、空腹血糖升高、LDL-C升高及糖化血紅蛋白升高為高SYNTAX評分的危險因素，多因素分析則提示高血壓是高SYNTAX積分的獨立危險因素。詳見表4、表5。

表4 單因素及多因素logistic回歸分析發現與冠心病發病相關的危險因素

表5 單因素及多因素logistic回歸分析發現與高SYNTAX積分相關的危險因素

3 討 論

冠心病是一種多危險因素激發的涉及慢性炎癥、免疫功能紊亂的代謝性疾病，近年來大量研究提示淋巴細胞參與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成和發展[5]。維生素D對免疫系統具有調節作用，其相應受體被報道廣泛存在于外周淋巴細胞、巨噬細胞及胸腺組織中[6- 7]。維生素D能夠抑制淋巴細胞釋放炎性細胞因子，如TNF、IL-1、IFN-γ及IL-2，并增加釋放抗炎細胞因子，如IL-4及IL-10，同時維生素D能夠抑制B淋巴細胞IgE的表達[8]。與全身低密度脂蛋白受體(LDLR)基因單敲除小鼠相比，全身VDR及LDLR雙敲除小鼠的主動脈處釋放更多的黏附分子及促炎因子，而且巨噬細胞有更多的膽固醇流入，導致主動脈斑塊形成加速[9]。沉默VDR后，T細胞的腎素-血管緊張素系統(RAS)激活并誘導T細胞凋亡，激活VDR不僅能夠抑制T細胞的RAS并促進DNA修復[10]。因此，維生素D/VDR具有調節免疫系統的功能，并影響冠狀動脈粥樣硬化的病程進展。

在2型糖尿病病人中，頸動脈粥樣硬化與血漿25(OH) D水平降低相關[11]；2型糖尿病合并糖尿病腎病、視網膜病變及神經病變等微血管并發癥病人25(OH) D水平顯著低于無微血管并發癥的2型糖尿病病人[12]。但本研究并未能發現冠心病病人外周血25(OH) D水平低于對照組。事實上，25(OH) D經過腎臟由1α羥化酶轉化形成的1，25(OH) D是維生素D的活性形式，但由于1，25(OH) D的血漿濃度過低，不易測量，而且易于失活，故臨床上常用25(OH) D濃度反應體內維生素D水平[13-15]。因此低血漿濃度1，25(OH) D才是冠心病的高危因素，但目前無相關臨床研究。最近的實驗研究發現成纖維生長因子23(FGF23)能夠抑制腎臟的1α羥化酶表達，進而影響血漿1，25(OH) D濃度[16]。因此，血漿FGF23濃度升高也有可能是冠心病的高危因素，但仍需進一步研究。

本研究提示淋巴細胞表面VDR表達量與糖化血紅蛋白呈負相關，提示高糖狀態可能降低淋巴細胞VDR表達。目前沒有在體或離體實驗研究高糖環境或晚期糖基化終產物(AGEs)對淋巴細胞的VDR表達影響的研究。腹腔注射鏈霉素誘導小鼠糖尿病模型發現糖尿病小鼠胰腺、肌肉及脂肪組織的VDR表達均顯著降低，但這項研究沒有討論組織的VDR表達與血糖及糖化血紅蛋白的相關性[17]，因此糖尿病環境與淋巴細胞VDR表達的相關性仍需要進一步研究[4]。

本研究表明冠心病病人淋巴細胞表明VDR表達顯著低于對照組，淋巴細胞表面VDR表達量與糖化血紅蛋白水平呈負相關，也是潛在的冠心病危險因素，但與冠狀動脈病變嚴重程度無相關性，其具體聯系機制及臨床意義有待進一步研究證實。

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2017-07-12)

(本文編輯 王雅潔)

Correlation of Vitamin D Receptor Expression on Lymphocytes with Coronary Artery Disease

Ai Sidi，Ding Ru，He Zhiqing，Wu Zonggui，Liang Chun

Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Liang Chun

ObjectiveTo uncover the differential expression of vitamin D receptor (VDR) on lymphocyte in patients with coronary artery disease (CAD) compared that in healthy controls and to discuss its potential significance in treatment of CAD patients.MethodsThe mean fluorescence intensities of VDR (VDR-MFIs) on peripheral lymphocytes were measured in 50 patients with CAD and 30 healthy controls without CAD.Clinical information of all subjects involved was collected and the levels of plasma lipids，fasting glucose，haemoglobin A1c (HbA1c)，and vitamin D were measured.ResultsThe log10VDR-MFIsof patients with CAD were significantly lower than those of healthy controls (P=0.028).The log10VDR-MFIswas negatively correlated with HbA1c(r=-0.347，P=0.002).Multivariate logistic regression analysis suggested log10VDR-MFIswere indepently associated with CAD (OR=0.051，P=0.019).ConclusionThe expression of VDR on peripheral lymphocytes in patients with CAD was significantly lower than that in healthy controls，which was negatively correlated with HbA1c.Lower VDR expression on peripheral blood lymphocytes might be a potential risk factor of CAD.

coronary artery disease； peripheral blood； lymphocyte； vitamin D receptor

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.001

1672-1349(2017)21-2657-04

國家自然科學基金資助項目(No.8151101216、91539118、 81473445、81400336和81503371)，上海市科委中醫引導性項目(No.15401931500)

上海長征醫院(上海 200003)

梁春，E-mail：chunliangliang@hotmail.com

信息：艾思迪，丁茹，賀治青，等.外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關性研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2657-2660.