血管緊張素Ⅱ對原代培養大鼠心肌成纖維細胞增殖及轉分化的影響

崔 琳，王幼平，謝世陽，李 彬，王新陸，于 瑞，郝軒軒，高 原，王小曉，朱明軍

·基礎醫學論著/研究·

血管緊張素Ⅱ對原代培養大鼠心肌成纖維細胞增殖及轉分化的影響

崔 琳1，王幼平1，謝世陽1，李 彬1，王新陸2，于 瑞2，郝軒軒2，高 原1，王小曉1，朱明軍1

目的探討血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)對原代培養的新生大鼠心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖及轉分化的影響，摸索合適的AngⅡ濃度。方法應用胰蛋白酶消化出生1 d～3 d 乳鼠心臟，差速貼壁法分離培養心肌成纖維細胞，免疫熒光法鑒定心肌成纖維細胞波形蛋白(vimentin)表達；用不同濃度的AngⅡ作用于心肌成纖維細胞，MTT法檢測AngⅡ對心肌成纖維細胞增殖影響；免疫熒光技術檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)熒光含量；Westernblot技術檢測α-SMA蛋白表達量變化。結果不同濃度 AngⅡ作用于心肌成纖維細胞，10-6、10-7mol/L AngⅡ能促進成纖維細胞增殖增加；10-5、10-6、10-7mol/L AngⅡ能促進α-SMA熒光強度增加；10-6mol/L AngⅡ可引起α-SMA蛋白表達量增加，且差異具有統計學意義。結論AngⅡ可引起心肌成纖維細胞增殖；同時可誘導α-SMA表達量增加。

血管緊張素Ⅱ；新生大鼠；心肌成纖維細胞；波形蛋白；α-平滑肌肌動蛋白；原代培養

慢性心功能不全是各種心臟疾病導致心功能不全的一種綜合征，是心血管疾病死亡的主要原因之一。導致其發生發展的基本機制是心室重構(ventricular remodeling，VR)[1-3]。心肌細胞肥大、心肌間質纖維化是心室重構的主要特征，其也是決定慢性心力衰竭(CHF)的發病率、死亡率非常重要的病理因素。因此，如何逆轉心室重構成為國內外共同的研究熱點。

心肌成纖維細胞(CFs)是心臟中數量最多且主要合成、分泌心臟細胞外基質(ECM)的細胞類型[4-5]。膠原過度增生、沉積導致心肌纖維化可能是心室重構的主要病理基礎。在心室重構過程中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)在其中起著極為重要的作用，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為RAAS最為重要的效應分子，具有眾多的生物學活性，與心室重構密切相關，可引起CFs的增生和心臟間質纖維化[6-10]。

本實驗通過體外原代提純培養新生大鼠(1 d～3 d)的CFs，通過AngⅡ處理CFs，在細胞水平研究AngⅡ對CFs增殖及其向肌成纖維細胞(Myofibro blast，MF)發生轉化的影響，這可能為進一步探討中藥及其有效組分對CFs增殖分化抑制作用的可能機制提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生后1 d～3 d SD大鼠，雌雄不限，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002，動物合格證號：41003100001587。

1.2 儀器 RCO-3000TVBB型二氧化碳培養箱(美國REVCD公司)、Milli-Q Synthesis超純水儀(美國Milipore公司)、Spetra Max M3酶標儀(美國Molecular Devices公司)、倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)、-70℃冰箱(美國Thermo公司)、BCM-1300 生物潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

1.3 試劑 AngⅡ(SIGMA公司)、DMEM培養基(美國GIBC0公司)、胎牛血清(以色列BI公司)、兔單克隆Vimentin抗體(美國abcam 公司)、MTT(Amresco公司)、Alexa flior 594 羊抗兔IgG(武漢三鷹生物)、α-SMA一抗、水溶性封片劑(武漢博士德公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.4 新生大鼠心肌成纖維細胞的分離培養 參考文獻并進行改進[11]，取新生1 d～3 d的SD大鼠，無菌下開胸取心尖部，用預冷的PBS液洗滌3遍，仔細去除血管、心房及結締組織，將心臟剪成約1 mm3大小的組織塊；用心肌細胞消化液(Trypsin 0.16 g，NaCl 1.6 g，NaHCO30.070 6 g，無水葡萄糖0.198 2 g，KCl 0.059 6 g，HEPES 0.4 g，定容至200 mL，0.22 μL濾器過濾除菌)在37℃恒溫磁力攪拌器中分次消化心肌組織7～8次，每次5 min。第一次消化后自然沉淀并棄上清，以后自然沉淀后取上清，直至組織塊變為白色透明；每次分離的上清液加等量含10%胎牛血清DMEM培養液輕輕吹打制成細胞懸液，1 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液制成細胞懸液，200目篩網過濾除去未充分消化的組織塊。將細胞轉入培養瓶放入37℃，含5%CO2的培養箱，差速貼壁培養1.5 h，培養瓶中貼壁細胞即為心肌成纖維細胞。加4 mL含 10%胎牛血清的EMDM培養液入培養瓶繼續培養，生長近融合時按1∶2傳代，實驗采用2～4代細胞。

1.5 心肌成纖維細胞波形蛋白抗體鑒定 取對數生長的細胞，0.25%胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種到預先放置蓋玻片的24孔培養板中，置37℃，5%CO2孵箱中培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞生長密度適當取出蓋玻片，PBS漂洗兩次，用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗2次；0.5% Triton-100滴加爬片20 min；PBS漂洗2次；用10%山羊血清封閉20 min，不洗滌片；滴加波形蛋白一抗(1∶500)4 ℃過夜；PBS漂洗2次；滴加熒光標記的FITC，37℃ 20 min；PBS漂洗2次；DAPI染核5 min；PBS漂洗2次；水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察，計算成纖維細胞純度。

1.6 AngⅡ對心肌成纖維細胞增殖的影響 心肌成纖維細胞以2×104/mL的密度接種于96孔板，待生長貼壁后更換無血清培養基同步化24 h，將細胞分成5組： 空白對照組及10-4mmol/L、10-5mmol/L、10-6mmol/L、10-7mol/L AngⅡ組。加入不同濃度AngⅡ分別刺激24 h和48 h，之后每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液，繼續培養4 h，每孔加入100 μL DMSO，充分震蕩混勻10 min，測定490 nm吸光度值。每組設6個復孔。

1.7 免疫熒光法檢測AngⅡ對心肌成纖維細胞α-SMA蛋白表達的影響 心肌成纖維細胞以1×105/mL的密度接種于24孔板，待生長貼壁后以10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L AngⅡ處理細胞，作用24 h后用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗2次；0.5% Triton-100滴加爬片20 min；PBS漂洗2次；用10%山羊血清封閉20 min，不洗滌片；滴加α-SMA一抗(1∶500)4℃過夜；PBS漂洗2次；滴加熒光標記的FITC，20℃～37℃ 20 min；PBS漂洗2次；水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察α-SMA陽性表達量并拍照。

1.8 Westernblot檢測AngⅡ對α-SMA蛋白含量的影響 將CFs以4×105細胞種6孔板，10-6mol/L AngⅡ加入24 h 后收集細胞，細胞裂解液裂解細胞后，收集裂解液于4℃ 12 000 r/min離心15 min ，收集上清液凍存。10% 十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulphate，SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至聚偏氟乙烯 (polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，小鼠a-SMA單克隆抗體4℃過夜，TBST洗脫。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗37℃孵育1 h，TBST洗脫。ECL 發光試劑盒顯色、顯影，于暗室內曝光。以GADPH作為內部對照，采用Image ProPlus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的積分吸光度。

2 結 果

2.1 成纖維細胞形態及波形蛋白免疫熒光鑒定 倒置顯微鏡下觀察，CFs呈梭形、多角形，細胞質透明，顏色淡，無自發性搏動。本研究中所獲細胞形態學特征均與此相符。如圖1-A，1-B；免疫熒光染色鑒定：用波形蛋白單克隆抗體作為一抗，染色后見與細胞長軸平行的絲狀物，見圖1-C，1-D，1-E，1-F；細胞純度gt;98%，證實該細胞可用于進一步的實驗。詳見圖1。

注：A為心肌成纖維細胞形態(光鏡 200×)；B為心肌成纖維細胞形態(光鏡 400×)；C為波形蛋白熒光染色(200倍)(一抗1∶500，熒光二抗1∶200)；D為DAPI染核(200×)；E為波形蛋白熒光染色(400×)；F為DAPI染核(400×)。

圖1原代培養的心肌成纖維細胞的細胞形態及免疫熒光鑒定

2.2 AngⅡ對心肌成纖維細胞增殖的影響 不同濃度AngⅡ作用24 h，AngⅡ10-7mol/L與正常組相比，差異無統計學意義(Pgt;0.05) ；10-6mol/L AngⅡ刺激組與正常組相比，OD值明顯增加，并且差異有統計學意義(Plt;0.05)。10-4mol/L、10-5mol/L AngⅡ組與正常組相比，OD值明顯降低(Plt;0.05)，提示較高濃度的AngⅡ可能具有抑制心肌成纖維細胞增殖的作用。見圖2。不同濃度AngⅡ作用48 h，AngⅡ10-5mol/L，AngⅡ10-6mol/L組與正常組OD值相比有所增加，但差異不具有統計學意義(Pgt;0.05)；AngⅡ10-7mol/L與正常組相比，OD值增高，差異具有統計學意義(Plt;0.05)；AngⅡ10-4mol/L與正常組相比OD值明顯降低，并且差異具有有統計學意義(Plt;0.05)。詳見圖3，表2。根據增殖實驗的結果，選擇AngⅡ10-5mol/L、AngⅡ10-6mol/L、AngⅡ10-7mol/L濃度繼續進行后續α-SMA蛋白表達的實驗。

注：*Plt;0．05 vs 24 h正常組，# Plt;0．05 vs 48 h正常組。

圖2不同濃度AngⅡ對心肌成纖維細胞作用24 h

注：*Plt;0．05 vs 24 h正常組，# Plt;0．05 vs 48 h正常組。

圖3 不同濃度AngⅡ對心肌成纖維細胞作用48 h

2.3 不同濃度的AngⅡ對α-SMA熒光強度的影響 如圖3所示，不同濃度AngⅡ作用24 h，正常組心肌成纖維細胞有少量α-SMA表達；AngⅡ10-5mol/L、AngⅡ10-6mol/L、AngⅡ10-7mol/L刺激組α-SMA明顯增加。結合心肌成纖維細胞增殖實驗的結果，選擇AngⅡ10-6mol/L組進行后續蛋白表達分析。

注：A為正常組，B為AngⅡ10-7mol/L，C為 AngⅡ10-6 mol/L，D為 AngⅡ10-5 mol/L。

2.4 Westernblot檢測AngⅡ對α-SMA蛋白表達量的影響 正常組心肌成纖維細胞有少量α-SMA表達；10-5mol/L AngⅡ作用24 h，α-SMA表達量明顯增加，且與正常組比較，差異具有統計學意義(Plt;0.05)。

注：與正常組比較，*Plt;0．05。

3 討 論

心肌受損是一個復雜的病理生理過程，包括心肌細胞的壞死、凋亡以及生化和代謝等諸多方面的改變，而心肌纖維化是大多數心肌受損的最終結局，是一個緩慢的動態過程。心肌間質纖維化是心肌組織結構中膠原纖維過量積聚或成分發生改變的一種現象。在該過程中，大量細胞外基質的沉積是形成纖維化的核心環節和關鍵步驟。心肌間質成纖維細胞是目前研究心肌纖維化的一個重要靶點。本實驗結果表示，不同濃度的血管緊張素Ⅱ作用于原代培養的心肌成纖維細胞后，其增殖有不同程度的提高，且表現為AngⅡ10-6mol/L 24 h組、AngⅡ10-7mol/L 48 h組與正常組比較，差異具有統計學意義。提示在該濃度及時間下心肌細胞增殖增加。AngⅡ和醛固酮是RAAS的兩種主要效應分子，AngⅡ與 AT1R結合后通過激動蛋白激酶C(PKC)活化各種信號通路[7，12-13]，促進CFs增殖及膠原合成，誘導心肌細胞纖維化。本研究表明，AngⅡ刺激心肌成纖維細胞，引起細胞發生增殖。

波形蛋白(vimetin)是存在于間質起源細胞中，是中間絲的主要結構蛋白，與微管、微絲共同構成細胞骨架，有支持細胞形態與活動的作用，體外培養時CFs存在有波形蛋白，而α-SMA特異性地存在于血管平滑肌細胞。在生理狀態下，CFs并不表達收縮性標志α-SMA。經歷損傷后，部分CFs轉分化為心肌成纖維細胞，特征為表達收縮性標志α-sMA和波形蛋白。α-SMA是成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的標志，這種轉變在心肌受損后的心肌纖維化過程中起到了關鍵性的作用[4]。本實驗結果表明，不同濃度的血管緊張素Ⅱ作用于原代培養的心肌成纖維細胞后，其α-SMA熒光表達量逐漸增加，可見在血管緊張素Ⅱ刺激下，心肌成纖維細胞發生了不同程度的轉分化。同時α-SMA蛋白表達量與正常組比較，差異具有統計學意義。

不同濃度AngⅡ刺激心肌成纖維細胞，CFs表現出增殖，轉分化改變，這將為后期研究中藥加參方對心衰保護作用的分子機制提供一定的細胞生物學基礎。

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2017-03-21)

(本文編輯 王雅潔)

R329，2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.006

1672-1349(2017)21-2680-05

國家自然科學基金面上項目(No.81173410)，國家自然科學基金青年項目(No.81503419)，國家自然科學基金青年項目(No.81603466)，國家自然科學基金青年項目(No.81603432)

1.河南中醫藥大學第一附屬醫院(鄭州 450000)；2.河南中醫藥大學院

朱明軍，E-mail：zhumingjun317@163.com

信息：崔琳，王幼平，謝世陽，等.血管緊張素Ⅱ對原代培養大鼠心肌成纖維細胞增殖及轉分化的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2680-2684.