頸迷走神經刺激對大鼠心肌IR炎癥反應和細胞凋亡的影響

雷玉華，趙勁波，張長江，李元紅

頸迷走神經刺激對大鼠心肌IR炎癥反應和細胞凋亡的影響

雷玉華，趙勁波，張長江，李元紅

目的探討頸迷走神經刺激(CVNS)對大鼠心肌缺血再灌注(IR)炎癥和細胞凋亡的影響。方法24只成年雄性SPF級大鼠(200 g～250 g)，隨機分為假手術組(SO，n=8)、缺血再灌注組(I/R，n=8)和頸迷走神經刺激+I/R組(CVNS+I/R，n=8)。選用I/R模型(缺血30 min，再灌注4 h)。3組均分離左側頸迷走神經干，僅CVNS+I/R組給予電刺激(10 Hz，2 ms)，電壓以心率降低10%為標準。選用Biopac軟件記錄大鼠再灌注時肢導心電圖。再灌注4 h后取頸靜脈血和心肌組織，分別檢測心肌損傷標志物：肌酸激酶(CK)和肌鈣蛋白I(cTnI)；炎癥因子：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)；凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax水平，Tunel檢測凋亡指數(AI)。結果與SO組比較，I/R組中CK、cTnI、TNF-α、INF-γ、IL-6、caspase-3和AI顯著增高，Bcl-2/Bax值減小，CVNS可以顯著抑制I/R引起的CK、cTnI、TNF-α、INF-γ、IL-6、caspase-3和AI的增高，增加Bcl-2/Bax比值。結論CVNS可以通過抑制大鼠心肌細胞炎癥反應和凋亡減輕心肌IR損傷。

心肌缺血；再灌注損傷；心肌細胞；炎癥反應；細胞凋亡；大鼠

早期再灌注治療是臨床上治療心肌梗死最有效的方法，然而再灌注治療本身也會引起心肌細胞損傷，這種現象成為心肌缺血再灌注(IR)損傷。前期研究證實，急性心肌缺血而不給予再灌注治療，缺血區梗死面積達70%，給予再灌注治療后心肌梗死面積仍有30%，而給予有效的方法預防再灌注損傷時，心肌梗死面積僅有5%[1]。可見如何減輕IR損傷，對挽救病人心肌改善預后具有重要意義。近年來隨著我國急診經皮冠脈介入(PCI)治療的增多，如何預防和治療IR損傷應該給予更多的重視。

近年來研究發現心肌缺血往往伴隨著自主神經失衡，表現為交感神經過度激活，迷走神經活性相對減弱，自主神經失衡是加重心肌損傷、誘發室性心律失常的重要原因[2]。近期很多的研究試圖找到改善自主神經失衡的有效方法，如腎動脈消融、星狀神經節消融、心臟GP刺激和迷走神經刺激等，其中頸迷走神經刺激(CVNS)是一種安全且有效的方法[3-4]。迷走神經刺激可以顯著抑制炎癥反應，減輕心肌損傷[5]。炎癥是心肌IR損傷和心肌細胞凋亡的重要機制之一。CVNS是否可以通過抑制炎癥，減輕心肌細胞凋亡和心肌損傷，這是本研究設計的內容。

1 材料與方法

1.1 分組 選用成年雄性SD大鼠(200 g～250 g)，購于武漢大學動物實驗中心。將24只大鼠隨機分為3組。假手術組(SO組，n=8)：大鼠麻醉后開胸，前降支下穿線但不結扎；缺血再灌注組(I/R組，n=8)：前降支扎閉30 min后，再灌2 h；頸迷走神經刺激+缺血再灌注組(VNS+I/R組，n=8)：前降支扎閉時開始給予頸迷走神經電刺激，至再灌注2 h結束。用2%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg，ip)麻醉后，將大鼠仰臥固定于鼠板，氣管插管，連接小動物呼吸機(70次/min)，記錄肢導心電圖(BIOPAC，美國)，直至再灌注結束。開胸后，將大鼠前降支與一段帶凹槽的中空乳膠管用5-0線一同結扎，30 min后剪斷結扎線，再灌注2 h。結扎后心尖部變白和心電圖Ⅱ導連ST段抬高表示缺血成功。2 h再灌注后，經頸靜脈采血2 mL，靜置后離心，取上清，凍存于-80℃冰箱至檢測。迅速剪取心臟，清洗后，留取左室心尖區(梗死+缺血區)心肌，凍存于-80℃冰箱至檢測。

1.2 心肌損傷標志物檢測 檢測大鼠血清中CK和cTnI水平，評價心肌損傷情況。選用南京建成生物工程所試劑盒，檢測血清LDH和CTnI水平。

1.3 炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6檢測 檢測心肌組織TNF-α、INF-γ和IL-6的表達評價炎癥反應水平。選用武漢建成生物工程所試劑盒，檢測心肌組織TNF-α、INF-γ和IL-6的表達水平。

1.4 TUNEL檢測 采用TUNEL染色評價心肌細胞凋亡率。I/R組和VNS+I/R組中心肌組織經固定、包埋、切片、脫蠟和水化后，嚴格按照TUNEL試劑盒(羅氏應用科學公司，美國)和DAB染色試劑盒(武漢博士德生物工程研究所，中國)說明操作，凋亡細胞核被染成棕色，正常細胞核為藍色，在×200倍顯微鏡觀察，計算凋亡指數(AI)=棕色核細胞數/總細胞數×100%。

1.5 Western blot檢測 采用WB法檢測凋亡蛋白caspase-3，Bcl-2和Bax的表達。方法如前所述[6]，簡言之，采用12%PAGE膠，電泳轉膜后，選用5%脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗[抗caspase-3(1∶100稀釋，武漢三鷹，中國)，抗Bcl-2(1∶500，santa，美國)，抗Bax(1∶800，bioworld，美國)]過夜，用相應的二抗孵育后，ECL顯色，以β-actin為內參，計算三種凋亡蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 血清中LDH和cTnI表達 與SO組比較，I/R組中LDH和cTnI的表達顯著升高(Plt;0.05)；與I/R組比較，CVNS+I/R組中，LDH和cTnI的表達顯著下降(Plt;0.05)。詳見表1。

表1 CVNS對心肌損傷和炎癥因子的影響(±s)

2.2 心肌細胞炎癥反應 與SO比較，I/R組中炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6的表達水平顯著升高(Plt;0.05)。與IR組比較，CVNS可以限制抑制TNF-α、INF-γ和IL-6的表達。詳見表1。

2.3 心肌細胞凋亡 選用AI和凋亡蛋白(caspase-3，Bcl-2/Bax)表達水平評價心肌細胞凋亡。與SO組比較，I/R組中AI值和caspase-3表達顯著增加，Bcl-2/Bax比值減小(Plt;0.05)，而VNS可抑制I/R誘導的AI增加、caspase-3高表達和Bcl-2/Bax值的減小(Plt;0.05)。詳見表2。

表2 CVNS對心肌細胞凋亡的影響(±s)

3 討 論

前期研究證實，迷走神經刺激在多種心血管疾病中均有保護作用，如缺血性心肌病、心衰和心律失常等[3，7-8]。本研究發現，CVNS可以顯著抑制心肌損傷標志物CK和cTnI的表達，即減輕心肌IR損傷。這與前期的研究結果一致[9]。

炎癥是心肌IR損傷的重要機制之一。近年研究發現，迷走神經和免疫炎癥間可以相互調控，迷走神經刺激可以顯著抑制炎癥反應水平[10]。本研究發現，CVNS可以顯著抑制IR中心肌細胞的炎癥因子TNF-α、INF-γ和IL-6的表達，進一步印證了上述結論。究其機制可能與α7膽堿能受體有關。Hu等[11]的研究發現，迷走神經刺激對心肌IR損傷有保護作用，其機制與激活α7膽堿能抗炎通路有關。α7膽堿能受體激活后可以激活下游兩面激酶(JAK)和核因子(NF)κB通路，進而抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達[12]。 本實驗中CVNS通過激活α7膽堿能通路抑制心肌IR炎癥反應。

心肌細胞凋亡是I/R損傷的重要機制之一，研究證實，通過基因敲除技術抑制心肌細胞凋亡，可以減少I/R中心肌梗死面積，減少程度高達50%[13]。 Bcl-2家族成員由抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)組成，二者間表達的平衡決定了心肌細胞的命運。I/R中活性氧的過度生成和炎癥反應的過度激活可以誘導促凋亡蛋白Bax的過表達，Bcl-2/Bax值減小，促發心肌細胞凋亡[14]。

迷走神經刺激可以顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達，增加Bcl-2/Bax值，減少AI值，抑制心肌細胞凋亡。 VNS可以通過調節Bcl-2/Bax值，抑制I/R誘導的心肌細胞凋亡。

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2017-03-21)

(本文編輯 王雅潔)

R285.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.010

1672-1349(2017)21-2697-03

湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院 (湖北恩施 445000)

李元紅，E-mail：yuanhongwhu@126.com

信息：雷玉華，趙勁波，張長江，等.頸迷走神經刺激對大鼠心肌IR炎癥反應和細胞凋亡的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2697-2699.