急性氨氮脅迫對紅螯螯蝦血細胞凋亡的影響

潘訓彬+張秀霞+冼健安

摘 要：氨氮是水產養殖過程中的常見毒性污染物之一，為探討氨氮對紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細胞的細胞毒性機制，研究了氨氮脅迫作用下紅螯螯蝦血細胞凋亡狀態的變化。以17.6 mg/L氨氮對紅螯螯蝦幼蝦進行急性脅迫，于脅迫后的0、48、72和96 h取血淋巴，應用流式細胞術測定血細胞總數（THC）、胞內游離Ca2+含量、線粒體膜電位（MMP）和血細胞凋亡率。結果顯示，紅螯螯蝦的THC在脅迫的72 h開始有顯著的下降，在96 h時達到最低值；血細胞胞內游離Ca2+含量在48 h開始有顯著的升高，在96 h達到最高值；血細胞MMP在72 h開始有顯著的下降，在96 h達到最低值；血細胞凋亡率在72 h開始有顯著的升高，在96 h時達到最高值，為9.39%。這些結果表明，胞內游離Ca2+含量是對氨氮脅迫最為敏感的指標；氨氮急性脅迫誘導紅螯螯蝦血細胞發生了Ca2+參與調節、線粒體通路相關的細胞凋亡，從而導致了THC的下降。

關鍵詞：氨氮；紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）；血細胞；凋亡；流式細胞術

中圖分類號：X503.225文獻標識碼：A

水產養殖過程中，水體氨氮主要來源于水產動物的氮代謝排泄物以及糞便和殘餌的氨化作用[1]。眾多研究表明，氨氮對水產動物具有較強的毒性[2-4]。隨著養殖時間的延長，氨氮容易不斷地積累于水環境中，從而對養殖水產動物產生脅迫毒害作用。目前，氨氮對紅螯螯蝦毒性影響的研究仍甚少，主要集中在半致死濃度以及氨氮對生理生化的影響上[5-6]。蝦類等甲殼動物依賴先天性免疫進行免疫防御，其中血細胞在細胞免疫和體液免疫過程中具發揮十分重要的作用。本研究應用流式細胞術研究氨氮對紅螯螯蝦血細胞凋亡的影響，探討氨氮對紅螯螯蝦血細胞的細胞毒性以及氨氮的免疫抑制作用機制，以期為進一步研究如何提高紅螯螯蝦的抗氨氮脅迫能力提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）購自海南省瓊海市某養殖場，平均體重為（15.16±2.69）g，在實驗室環境條件下進行馴養，水體環境條件為：pH 7.9～8.0，溫度24±2℃，一直保持曝氣。馴養一周后，選取健康無病患、附肢完整、處于蛻皮間期且反應靈敏的螯蝦進行實驗。

1.2 氨氮脅迫

本研究組之前的試驗結果顯示，氨氮對紅螯螯蝦幼蝦的安全濃度為8.8 mg/L，根據這一結果以及實際養殖水體情況，本試驗設定的氨氮脅迫濃度為17.6 mg/L，以NH4Cl作為氨氮的來源進行配制，不添加組作為對照組。試驗在塑料儲物箱中進行，每箱放置30 L水和幼蝦12尾，每組設置3個平行。試驗期間不投喂，保持曝氣。為保證水體的氨氮濃度穩定，預先配制17.6 mg/L氨氮的水，每24 h換水一次。于試驗的0，48，72和96 h取樣測定。

1.3 血細胞懸液的制備

用2.5 mL一次性注射器吸取400 μl預冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH 7.5），然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴。取稀釋血淋巴200 μL，直接用于血細胞總數（THC）的測定，余下的稀釋血淋巴用預冷的抗凝劑進一步稀釋，調整細胞濃度約為1×106個/mL，制得血細胞懸液，用于其它流式細胞術指標的測定。每尾蝦的血淋巴作為一個單獨樣品進行檢測。

1.4 血細胞總數（Total haemocyte count，THC）

商品試劑SYBR GreenI（Sigma）的DMSO（二甲基亞砜）溶液的濃度為10 000×，以DMSO稀釋為1 000×的工作液。分別取稀釋血淋巴200 μL，加入2 μL SYBR GreenI工作液，使終濃度為10×，室溫避光孵育60 min，經 200目篩網過濾后上流式細胞儀（BD，FACSCalibur）檢測，每個樣品上樣1 min。以第一熒光通道（FL1）獲取SYBR GreenI的綠色熒光強度，根據熒光強度大小劃分細胞碎片區域與完整細胞區域（完整細胞因包含完整的核酸，結合SYBR GreenI后發出強的綠色熒光，非細胞顆粒或細胞碎片沒有核酸或核酸量少，SYBR GreenI結合量少，因而熒光強度弱），分析并記錄完整細胞的個數，每個樣品讀取3次。根據公式計算THC[7]。

1.5 胞內游離Ca2+含量

分別取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM（Sigma），室溫避光孵育60 min，經 200目篩網過濾后上流式細胞儀檢測。以FL1獲取Fluo-3的綠色熒光強度，以FL1為橫坐標，細胞數量為縱坐標作單參數直方圖，細胞的Fluo-3平均熒光強度與胞內游離Ca2+含量成正比。

1.6 線粒體膜電位（MMP）

分別取血細胞懸液200 μL，加入終濃度為2 mmol/L的DIOC6（Sigma），室溫避光孵育10 min，經 200目篩網過濾后上流式細胞儀檢測。以FL1獲取DIOC6的綠色熒光強度，以FL1為橫坐標，細胞數量為縱坐標作單參數直方圖，每個樣品的細胞獲取數為10 000個，細胞的DIOC6平均熒光強度與MMP成正比。

1.7 血細胞凋亡率

以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Invitrogen）測定血細胞凋亡率。實驗操作按照試劑盒說明書的步驟稍作調整來進行。取血細胞懸液600 μL，以800g，4℃離心10min，棄上清后，細胞沉淀重懸于1 x Annexin V結合緩沖液中，使細胞濃度約為3 × 106 個/mL，每100 μL血細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI工作液，避光染色15 min后加入400 μL 1 x Annexin V結合緩沖液，200目篩網過濾后立即上流式細胞儀檢測。以FL1獲取FITC的綠色熒光強度，以FL2獲取PI的橙紅色熒光強度，以FL1為橫坐標、FL2為縱坐標作雙參數散點圖，用十字門劃分各類細胞的區域（右下象限為前期凋亡細胞，右上象限為后期凋亡和死亡細胞，凋亡率為右下象限和右上象限的細胞所占的比例），每個樣品的細胞獲取數為10 000個，分析凋亡細胞所占的比例。endprint

1.8 統計分析

結果顯示為平均值 ± 標準差（Mean ± SD），實驗數據利用SPSS 18.0進行t檢驗分析，P<0.05確認為差異性顯著。

2 結果

2.1 血細胞總數

如圖1所示，對照組螯蝦的THC為7.91×106～8.72×106個/mL。氨氮脅迫48 h時，螯蝦THC沒有顯著變化（P>0.05）；脅迫72 h時，與對照組相比，脅迫組螯蝦的THC開始顯著下降（P<0.05），在96 h時達到最低值，為3.46×106個/mL；在脅迫120 h時，THC有所恢復，但仍顯著低于對照組（P<0.05）。

2.2 胞內游離Ca2+含量

如圖2所示，與對照組相比，脅迫組螯蝦血細胞胞內游離Ca2+含量在48 h開始有顯著的上升（P<0.05）；在96 h時達到了最高值，為對照組的2.82倍；在120 h有一定的下降，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。

2.3 線粒體膜電位

如圖3所示，與對照組相比，脅迫組螯蝦血細胞MMP在72 h開始有顯著的下降（P<0.05）；在96 h時達到最低值，為對照組的48.9%；在120 h有一定的恢復，但仍顯著低于對照組（P<0.05）。

2.4 血細胞凋亡率

如圖4所示，對照組螯蝦的血細胞凋亡率為2.46%～2.86%。與對照組相比，脅迫組螯蝦的血細胞凋亡率在72 h時開始有顯著的提高（P<0.05）；在96 h達到最高值，為9.39%；在120 h下降為7.01%，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。

3 討論

血細胞在蝦類等甲殼動物的免疫過程中發揮著重要的作用，因此THC常作為體現蝦類免疫狀態的重要指標。各種環境因子的脅迫作用均會導致蝦類THC的顯著下降，從而對蝦類的免疫功能產生了抑制作用[8-9]。還有研究認為，THC下降到一定的閾值時會導致蝦類的死亡[10]。因此，環境脅迫對THC的影響不容忽視。本研究前期的研究結果顯示，紅螯螯蝦的氨氮耐受能力較強，其幼蝦的氨氮安全濃度為8.8 mg/L，為使脅迫作用明顯，本試驗設置了2倍的安全濃度作為脅迫濃度。以往的研究顯示，氨氮脅迫會導致凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[11]、日本對蝦（Penaeus japonicus）[12]、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[13]、日本沼蝦（M.nipponense）[14]、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[15]等蝦類的THC的下降。本研究結果也顯示，氨氮脅迫導致了紅螯螯蝦THC的顯著下降。也有研究得出了相反的結論，其研究結果顯示氨氮脅迫對羅氏沼蝦的THC沒有顯著影響[16]，但比較可發現，這一相反結果可能與該研究所設置的氨氮濃度以及取樣時間有關。該研究設置的氨氮濃度較低，為0.55～3.18 mg/L，可能對血細胞沒有產生顯著的細胞毒性作用；該研究的取樣時間點僅為脅迫的第7天，取樣時間點太少，可能導致錯過了顯著影響的時期，本研究結果顯示，在脅迫48 h時THC沒有顯著變化，72 h時THC才開始顯著下降，96 h時達到了最低值，而120 h時有一定的恢復，這些結果表明氨氮對THC的影響與脅迫時間有密切的關系。

亞硝酸鹽、重金屬等脅迫作用的研究報道顯示，血細胞數量的減少與血細胞被誘導發生凋亡有關[8-9]。高濃度氨氮脅迫會誘導中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）血細胞中凋亡蛋白Caspase的表達量的顯著升高[17]。本研究結果顯示，氨氮脅迫72 h開始，紅螯螯蝦血細胞凋亡率有顯著的升高，在120 h時，凋亡率有所下降，這些結果與THC的結果吻合，表明氨氮脅迫誘導了血細胞的凋亡，從而導致THC的下降。胞內游離Ca2+含量的升高以及MMP的下降是細胞凋亡的兩個典型事件。在細胞凋亡的前期，內質網等Ca2+庫受到損傷，其儲存的Ca2+被大量釋放到細胞質中，造成胞質內的游離Ca2+含量的迅速升高，游離Ca2+含量會進一步促進其它凋亡事情的發生[18]。本研究結果顯示，氨氮脅迫48 h開始，血細胞胞內游離Ca2+含量已出現顯著的升高，此時THC、凋亡率和MMP仍未發生顯著的變化，表明胞內游離Ca2+含量是對氨氮脅迫最為敏感的指標，同時也表明氨氮所誘導的血細胞凋亡是一個Ca2+參與調節的凋亡過程。由于質子泵存在于線粒體內膜，可將線粒體基質中的質子泵入膜間隙，線粒體內膜兩側形成的跨膜電位則MMP。正常的MMP是線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP所必需的。細胞凋亡過程中，線粒體膜的通透性發生改變，造成了MMP的下降，一些凋亡因子被釋放到胞質中，誘導其它凋亡事件的進一步發生[19]。本研究結果顯示，氨氮脅迫可造成紅螯螯蝦血細胞MMP的顯著下降，這一結果與凋亡率的結果吻合，表明氨氮所誘導的血細胞凋亡是線粒體通路相關的細胞凋亡。

本試驗結果表明，氨氮脅迫作用對紅螯螯蝦血細胞產生了毒害作用，氨氮誘導血細胞發生了Ca2+參與調節、線粒體通路相關的凋亡，從而導致THC的下降。THC的下降可能引起螯蝦免疫力的下降，使螯蝦更容易受到病原體的感染，因此在養殖過程中應注意加強對水體氨氮含量的控制，在氨氮積累較為嚴重的養殖后期，更應注意預防疾病的爆發。

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