PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態性與系統性紅斑狼瘡發病的相關性

劉蘭婷 王 玉 宋繼權 裴 颯 歐運超

·論著·

PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態性與系統性紅斑狼瘡發病的相關性

劉蘭婷1王 玉2宋繼權1裴 颯1歐運超1

目的明確蛋白酶體(PSM)相關基因單核苷酸多態性與中國人群系統性紅斑狼瘡(SLE)的相關性。方法PCR擴增101例SLE患者和143名正常對照者外周血目的基因片段,通過二代測序對目的基因片段進行測序檢測蛋白酶體20 s亞單位和相關ATP酶基因的4個目標位點PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)的基因型及等位基因頻率。結果SLE組及對照組中rs2277460(GG,GA、AA)基因型頻率分別為97.22%,1.85%%,0.93%和96.5%，3.5%，0；rs2348071AA，AG，GG分別為30.56%、53.7%、15.74%和33.57%、50.35%、16.08%；rs2295826AA，AG，GG分別為75.93%、24.07%、0和69.23%、29.37%、1.4%；rs2295827CC、CT、TT分別為78.7%、19.45%、1.85%和76.22%、20.98%、2.8%，均無統計學差異(Pgt;0.05)。結論PSMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能與SLE的發病無關。

系統性紅斑狼瘡； 蛋白酶體； ATP酶； 單核苷酸基因多態性

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種復雜的自身免疫性疾病，以產生非器官特異性的自身抗體，免疫復合物沉積及多系統損害為特征，具有多種臨床表現[1]。其發病率約為(7.4～159.4)/10萬人。該疾病常進行性加重，不能根治，預后不良，是危害健康的重要公共衛生問題，因此SLE發病機制的研究也是皮膚科疾病、代謝疾病、風濕疾病等領域研究的重點和難點。

SLE是一種高度遺傳異質性疾病，其發病機制可以涉及細胞與體液免疫多個環節的異常。有證據表明泛素化在免疫應答的過程中發揮了重要作用[2]。在一些自身免疫性疾病及代謝性疾病中，均存在NF-kB通路的異常激活，以及前炎癥因子的轉錄異常，已知泛素化NF-kB轉錄后調控的重要方式。其中，已證實編碼泛素蛋白連接酶的基因UBC2L3在SLE中存在基因多態性[3]。有研究報道編碼蛋白酶體的相關基因PSMA6/PSMA3/PSMC6與一些免疫性及代謝性疾病相關，例如多發性硬化(MS)、支氣管哮喘(BA)、1型糖尿病等[4]。Alireza等證實在多發性硬化的患者中，可測得循環中蛋白酶體濃度顯著升高[5]。但是目前尚沒有研究表明蛋白酶體相關的基因多態性與SLE發病之間存在相關性。本文主要研究中國地區人群泛素-蛋白酶體系統(UPS)相關基因位點PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)多態性與SLE的相關性，以探討UPS在SLE發病過程中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 108例SLE女性患者資料均收集于2015年6月至2016年4月武漢大學中南醫院和武漢大學人民醫院門診和住院患者，年齡中位數為38.5歲。所有患者均符合1997年美國風濕協會修訂的SLE診斷標準[6]。對照組143名健康體檢者來自武漢大學中南醫院體檢中心，年齡中位數為41歲，經實驗室檢查及問卷調查排除了SLE、干燥綜合征、類風濕性關節炎、皮肌炎等自身免疫性疾病，且一，二，三級親屬中無SLE患者。所有受試者間均無血緣關系，且兩組的年齡分布無統計學差異(Pgt;0.05)。本次實驗通過了武漢大學中南醫院倫理委員會的批準，所有實驗受試者均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑 5424臺式離心機(Eppendorf公司)；S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)；DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)；Tanon1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新業生物技術有限公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318；百泰克生物技術有限公司，DP6101)

1.3 實驗方法 (1)采集受試者外周靜脈血5 mL，保存于-4℃環境中。(2)采用血液DNA提取試劑盒提取DNA(苯酚-蛋白酶K法)，采用紫外分光光度法測定DNA濃度，A260/A280gt;1.8,于-20℃保存。(3)PCR擴增目的基因，引物合成見表1。以下引物由武漢邦達生物科技有限公司合成。擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次，末次72℃延伸5 min。(4)瓊脂糖凝膠電泳：將擴增的產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，以驗證擴增結果(圖1)。(5)測序：由武漢邦達生物技術有限公司對PCR產物進行二代測序。(6)統計學方法：根據二代測序結果，利用直接計數法對基因型與等位基因頻率進行統計，利用SPSS 17.0對實驗組及對照組基因型頻率及等位基因分布差異進行χ2檢驗，當Plt;0.05時，兩組頻數有統計學差異。

圖1 rs2277460，rs2295826，rs2295827，rs2348071 (從左到右)PCR擴增產物的電泳圖

SNP位點上游引物下游引物rs22774605＇CTTTAAACACAATCCCTGGGC3＇5＇GCATGCAAGAGCGGAAGAA3＇rs23480715＇TTTCAGTCTAAGGCAGGGATG3＇5＇CTTACACCGAGCTTCCCCAG3＇rs22958265＇TTTTGTTGTTATACATGCCACC3＇5＇GTGTTTAAGTCGCTACGTCTCAC3＇rs22958275＇GTTGTTATACATGCCACCTACTCA3＇5＇CTGTAGGGCCTTCAGATCATTT3＇

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對實驗組、對照組各基因型的頻數及理論頻數進行H-W平衡檢驗，四個位點在兩組的分布均符合H-W平衡定律(Pgt;0.05)，表明所選取的樣品符合遺傳平衡定律，可以代表總體人群。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率(表2) PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率在SLE組與對照組中分別為97.22%，1.85%，0.93%和96.50%，3.50%，0，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，G，A等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為98.15%，1.85%和98.25%，1.75%，差異無統計學意義(Pgt;0.05);PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為30.56%，53.70%，15.74%和33.57%，50.35%，16.08%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為57.41%，42.59%和58.74%，41.26%，差異無統計學意義(Pgt;0.05);PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為75.93%，24.07%，0和69.23%，29.37%，1.4%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，A，G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為87.96%，12.04%和83.92%，16.08%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)；PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為78.70%，19.45%，1.85%和76.22%，20.98%，2.8%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)，C，T等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為88.43%，11.57%和86.71%，13.29%，差異無統計學意義(Pgt;0.05)

2.3 PSMA6(rs2277460)，PSMA3(rs2348071)，PSMC6(rs2295826，rs2295827)位點基因測序圖 為進一步驗證二代測序結果的準確性，隨機選擇SLE組4個位點的7各樣本進行一代測序(圖2～5)。

表2 PSMA6/PSMC6/PSMA3基因多態性在SLE患者和對照組的分布

圖2 rs2277460位點，樣品32(含G/A等位基因)的基因擴增產物測序圖圖3 rs2348071位點，樣品46(含A/G等位基因)的基因擴增產物測序圖

圖4 rs2295826位點，樣品48(含A/G等位基因)的基因擴增產物測序圖圖5 rs2295827位點，樣品51(含C/T等位基因)的基因擴增產物測序

3 討論

SLE的發病機制目前尚未完全明確，隨著GWAS技術的發展，通過多個獨立大數據的全基因掃描的病例對照研究，為研究SLE的發病機制提供了重要線索[7]。其中I型干擾素(IFN)活化異常是一個很重要的方面。在toll樣受體介導下，激活NF-kB通路，進而影響前炎癥因子的轉錄[8]。Lena等[9]在SLE血清引發的皮膚炎癥反應組織中檢測到升高的炎癥因子TNFR1、NF-kB、MCP-1等。而在炎癥反應的過程中，泛素-蛋白酶體系統是NF-kB通路主要的調節因子[10]。

UPS在免疫反應及自身免疫性疾病發病機制中的作用被人們作關注。UPS由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2s)泛素-蛋白連接酶(E3s)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成，是主要的非溶酶體依賴的蛋白降解途徑，其對蛋白的降解受到基因與免疫信號的共同調控[11]。泛素化是NF-kB轉錄后調節的重要方式，有研究發現編碼泛素連接酶UbcH7的基因UBC2L3在歐洲，亞洲及非洲裔的SLE患者與正常對照組中均存在基因多態性[3],并且高表達的T基因型與抗dsDNA抗體陽性可能存在相關性，進一步的研究表明在SLE患者群體中UbcH7在mRNA和蛋白質水平均有顯著的高表達[12]，在SLE患者體內，過度表達的UbcH7與其底物P105(NF-kB的前體蛋白)結合，增強了P105與蛋白酶體的結合與降解，使得其亞基P50二聚體增多并進入細胞核參與免疫調控。此外，有研究表明SLE的相關基因TNFAIP3編碼的A20蛋白，為泛素酶的成分之一[13]，與SLE發病及其系統損害密切相關。目前關于蛋白酶體在SLE發病機制的作用研究較少，已知在SLE患者體內同樣可以檢測到體內可以檢測到針對泛素-蛋白酶體成分的抗體表達增強:PA28α抗體[14](PA28α為一種蛋白酶體激活蛋白)，抗Ki抗體[15](Ki抗原是蛋白酶體11S調控因子的亞單位)，且這種表達與IFN通路的異常活化相一致。Sjowall等[16]應用26s蛋白酶體抑制劑治療兩例活動期SLE患者，經治療后患者的病情得到明顯的緩解，其機制可能與NF-kB的抑制與基質細胞的相互作用使內質網的錯誤折疊蛋白累積凋亡有關。

編碼蛋白酶體的基因主要位于14號染色體長臂，包括20s亞基的兩個a鏈(PSMA3和PSMA6)和兩個b鏈(PSMB5和PSMB11)，ATP酶(PSMC1和PSMC6)，11s非ATP酶催化劑(PSME1和PSME2)和PSMA3P假基因。有研究報道上述基因多態性與一些自身免疫性疾病及代謝性疾病相關，例如多發性硬化(MS)，支氣管哮喘(BA)，幼年特發性關節炎(JIA)等[15]。Tatjana等[17]通過研究174例JIA患者與191名健康對照者，選擇蛋白酶體相關的六個SNP位點(rs2277460，rs1048990，rs2348071，rs11543947，rs2295826，rs2295827)進行基因型及等位基因分析，發現位點rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827可能與JIA發病和臨床表現相關。

本次研究，為探究蛋白酶體相關基因SNPs與中國人群系統性紅斑狼瘡(SLE)的相關性，我們通過觀察108例SLE患者和143名健康對照，選擇4個SNP位點(rs2277460，rs234871，rs2295826，rs2295827)，采用高通量基因分型對DNA樣本SNP位點進行分析，結果示PSMA6(rs2277460)GG，GA，AA基因型頻率和G，A等位基因在SLE實驗組和對照組中無統計學差異(Pgt;0.05),PSMA3(rs2348071)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實驗組和對照組中無統計學差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295826)AA，AG，GG基因型頻率和A，G等位基因在SLE實驗組和對照組中無統計學差異(Pgt;0.05),PSMC6(rs2295827)CC，CT，TT基因型頻率和C，T等位基因在SLE實驗組和對照組中無統計學差異(Pgt;0.05)。上述四個SNP位點可能與SLE的發病機制無關。

本實驗首次探究蛋白酶體相關基因SNPs與中國漢族人群SLE之間的關聯，PSMA6/PSMC6/PSMA3 SNPs可能不是SLE的易感基因。一方面，本實驗在編碼蛋白酶體結構及相關酶蛋白的基因位點中僅選取了4個位點，不能排除其他SNPs在實驗組和對照組中表達有差異的可能性，另一方面，患者循環中蛋白酶體濃度升高可能與轉錄及轉錄后調控有關，已知編碼泛素連接酶(UbcH7)的基因UBC2L3為SLE的易感基因，UbcH7激活NF-kB通路可能參與了這一過程。同時本研究選取的樣本量小，人種單一，選取的位點不能代表蛋白酶體的全部結構，因此，UPS在SLE中的作用還需要通過大樣本，多基因點，多地區的研究，同時蛋白酶體轉錄后調控在SLE發病中的作用也有待進一步的研究。

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(收稿：2017-06-18 修回：2017-07-31)

AssociationbetweenPSMA6/PSMA3/PSMC6genepolymorphismandsystemiclupuserythematosus

LIULanting1,WANGYu2,SONGJiquan1,PEISa1,OUYunchao1.

1.DepartmentofDermatologyZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China; 2.DepartmentofDermatology,RenminHospitalHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of proteasome (PSM) related genes and systemic lupus erythematosus (SLE).MethodsThe aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 101 SLE patients and 143 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphisms of PSMA6 (rs2277460)，PSMA3 (rs2348071)，PSMC6 (rs2295826，rs2295827) alleles and the genotypes of proteasome 20 s subunit and related ATPase were detected by next generation sequencing technology.ResultsThe genotype frequencies of rs2277460 GG, GA, AA in the SLE patients and healthy controls were 30.56%, 53.7%, 15.74% and 33.57%, 50.35%, 16.08%, retrospectively. The genotype frequencies of rs2295826 AA, AG, GG were 75.93%, 24.07%, 0 and 69.23%, 29.37%, 1.4%. The genotype frequencies of rs2295827 CC, CT, TT were 78.7%, 19.45%, 1.85% and 76.22, 20.98%, 2.8%, with no significant differences between the two groups (Pgt;0.05).ConclusionThere may be no association between polymorphism of PSMA6/PSMC6/PSMA3 gene with SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); PSM; ATP ase; single nucleotide polymorphism

湖北省自然科學基金資助項目(編號:2015CKC902)

1武漢大學中南醫院皮膚科,武漢，430071 2湖北醫學院附屬人民醫院，十堰，442000

宋繼權,E-mail: songjiq@126.com