組胺受體H4R對過敏性紫癜患兒體內樹突狀細胞的調節作用

雷 蕾 蔣瑾瑾 顧 軍

·論著·

組胺受體H4R對過敏性紫癜患兒體內樹突狀細胞的調節作用

雷 蕾1蔣瑾瑾1顧 軍2

目的明確組胺受體H4R對過敏性紫癜(HSP)患兒體內樹突狀細胞(dentritic cells, DC)的調節作用。方法1.流式細胞儀檢測126例HSP急性期、112例緩解期患者及94名健康對照外周血單核細胞(PBMC)中DC標志性分子CD80及CD86的表達情況；2.體外活化和誘導得到DC，分為組胺組，組胺+H4R拮抗劑組和PBS對照組，Western blot 檢測組胺、H4R蛋白和人磷酸化信號傳導子及轉錄激活子1(p-STAT1)的表達，酶聯免疫吸附試驗檢測趨化因子CCL17、CXCL16表達水平。結果1.HSP患者PBMC中CD86的表達明顯高于健康對照組(Plt;0.01)。急性期組CD80的表達低于緩解期組及健康對照組(Plt;0.01)，而緩解期組及健康對照組之間無顯著性差異(Pgt;0.05)；2.組胺+H4R拮抗劑組p-STAT1和H4R的蛋白及趨化因子CXCL16和CCL17水平明顯低于組胺組。結論組胺受體H4R可能通過促進DC的趨化因子CXCL16/CCL17的表達，激活JAK/STAT通路，引起HSP的發生發展。

過敏性紫癜； 樹突狀細胞

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是一類專職抗原提呈細胞，它是能激活初始T淋巴細胞，啟動免疫應答的唯一一種提呈細胞，還可進一步影響Th細胞分化以及極化。有研究發現過敏性紫癜(HSP)患兒的DC對Th細胞調控的三條途徑即抗原特異性信號、協調刺激信號和分化或極化信號均出現了異常[1]。說明其在HSP的發病與發展中起著關鍵性的作用，以DC細胞為主的免疫細胞調控異常引起了Thl/Th2細胞功能失衡，應當是HSP發病的最主要原因之一。另有研究發現DC表面可表達H4R，活化后可以調控Th細胞的分化，另外H4R還可以抑制DC生成IL-12p70[2]，上調朗格漢斯細胞表達CCL17 and CCL22[3]等多種細胞因子，相應的影響Th細胞向Th2型遷移[4,5]。

本課題組前期研究已發現組胺受體H4R參與了HSP的急性期的炎癥反應，通過對不同臨床表型的HSP進行比較，發現腎臟受累的HSP患兒外周血H4R的表達要高于單純皮膚組及無腎臟受累的混合組[6]，在本研究我們將進一步觀察DC上組胺受體，細胞趨化因子的表達情況，探討H4R可能通過何種途徑對下游的細胞因子的信號轉導途徑進行調控。

1 研究對象

HSP急性期組：收集在上海長海醫院就診的126例病程在1周內的首次發病患者，經家長知情同意后，納入HSP急性期組，(男60例，女66例)，年齡為2.5～20歲，平均(9.85±4.73)歲。均為病程在1周內的首次發病，所有患者在入院前1個月內確保未使用任何抗過敏藥物或免疫抑制劑；患兒在采血前24 h未使用任何藥物。

HSP緩解期組：HSP急性期組的患兒經過規范的臨床治療后各種急性期臨床表現已消失、實驗室檢驗各項指標恢復正常，滿足上述標準的HSP患兒納入HSP恢復期組，共有112例，其中男52例，女60例，年齡為3.5～14.5歲，平均(7.48±3.85)歲。

健康對照組：均為同一時間段來我科兒保門診體檢的健康兒童，共94名。其中男52名，女42名，年齡為3.8～10.5歲，平均(6.52±1.86)歲，年齡、性別與HSP組匹配。

2 實驗試劑與設備

FACS Calibur型流式細胞分析儀(美國BD公司)；PBS 磷酸鹽緩沖液(上海基爾頓生物有限公司)；淋巴細胞分離液(上海基爾頓生物科技)；Human CXCL16/CCL17 ELISA試劑盒，CD80，CD86單克隆抗體(Biotnt公司)；P-STAT1單克隆抗(abcom公司)；RPMI 1640(上海生工)；rhGM-CSF(Peprotech公司)；rhIL-4(Biovision公司)；JNJ-7777120(MCE公司)。

3 實驗方法

3.1 流式細胞儀FCM檢測外周血單個核細胞表面共刺激分子表達情況 采集HSP急性期，緩解期及健康對照組患兒外周血后，分離PBMC。將PBS懸浮的1 mL待測細胞以1x106加人FCM專用管中。在FCM專用管中加入PE標記的鼠抗人單克隆抗體CD80，CD86各20 μL，并設空白對照。避光孵育，4℃，30 min，10 min搖一次，再用PBS洗滌2次，重懸細胞后上機檢測。

3.2 樹突狀細胞的體外誘導及培養 DC誘導培養：采集健康志愿者血漿，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法制備PBMC，將分離出的PBMC用不含細胞因子RPMI 1640培養液制備成細胞懸液。于24孔培養板在37℃、5% CO2培養箱孵育3 h，用37℃預熱的1640培養液洗板1次，獲得貼壁的單個核細胞。再加入含細胞因子的RPMI 1640完全培養液l mL。同樣在37℃、5% CO2下孵育的培養箱中。通過顯微鏡觀察細胞生長情況。隔日半量換液并添加細胞因子以保證培養液中細胞因子終濃度不變。培養至第6天時進行分組：1.PBS對照組；2.組胺組(1×10-5mmol/mL)；3.組胺(1×10-5mmol/mL)+H4R受體拮抗劑(1×10-5mmol/mL)。第8天時收集懸浮細胞及細胞上清以備檢測H4R、CXCL16和CCL17的表達。

3.3 Western blot檢測組胺及其抗體干預后外周血單個核細胞上H4R的蛋白的表達 前期收集細胞懸液，加入蛋白裂解液并進行收集蛋白樣品，加入SDS-PAGE凝膠，經電泳，轉膜，封閉后，加入稀釋好的兔抗H4R抗體孵育2 h，洗膜后加入二抗羊抗兔工作液孵育1 h，洗滌后顯色，進行蛋白檢測。

3.4 酶聯免疫吸附試驗檢測CCL17、CXCL16蛋白含量 50 mM的碳酸鹽緩沖液加入前期收集的上清液，調整抗原濃度為10～20 μg/mL，加以100 μL/每孔的量到酶標板，4℃條件下放置過夜。次日用PBS洗滌3次，加入150 μL 1% BSA在37℃條件下封閉1 h。PBS洗滌3次后，在每孔加入100 μL按照不同倍比稀釋度的血清，同時加入對照樣品，37℃條件下孵育2 h。PBS洗滌5次后，加入100 μL稀釋后的HRP標記的二抗，在37℃條件下孵育1 h。PBS洗滌5次，加入顯色劑反應20 min，酶標儀上讀取A405吸收值。

4 結果

4.1 HSP患者外周血單個核細胞中的CD80,CD86的表達情況 首先通過用流式細胞術檢測了各組受試者PBMC中CD80/CD86表達變化,見圖1。急性期組和緩解期組患者外周血單個核細胞CD86的表達均明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義(Plt;0.01)，且急性期組患者升高的程度更大。急性期組CD80的表達低于緩解期組及健康對照組，差異有統計學意義(Plt;0.01)。

4.2 組胺受體拮抗劑對DC表達H4R、p-STAT1、CCL17及CXCL16的影響

4.2.1 形態學觀察 在培養早期，可看見細胞成圓形或類圓形。培養至3～4天時，細胞逐漸聚集，呈集落樣生長，并且部分細胞可觀察到突起，培養至7～8天時，細胞分散生長，并可見明顯樹枝樣突起(圖2)。

4.2.2 DC上H4R、p-STAT1、CCL17及CXCL16的表達情況 加入組胺刺激后，DC的p-STAT1和H4R的蛋白表達增高(圖3)，分泌的趨化因子CXCL16和CCL17增多，明顯高于對照組(Plt;0.01，圖4)；而加入H4R阻斷劑JNJ7777120后，以上分子表達量均明顯回落。

圖1 各組受試者PBMC中CD86及CD80的表達

a：培養早期；b：培養3～4天時；c：培養7～8天時

圖3 刺激后DC的H4R和p-STAT1的表達變化 圖4 DC培養上清中的CXCL16和CCL17的表達變化

4 討論

Th1功能低下，Th2優勢活化是目前公認的HSP的病理基礎。而Th細胞是根據抗原提呈細胞提供的不同的信號分子而進一步活化，分化的。CD80(B7-1)，CD86(B7-2)分子作為免疫調控中重要的共刺激分子，可刺激T細胞活化，而活化的T細胞可促進B細胞進一步分泌大量免疫球蛋白，影響Th1/Th2平衡。其中DC作為最主要的抗原提呈細胞，是唯一能夠作用于na ?ve T細胞的細胞，從而激發獲得性免疫應答的一類抗原提呈細胞，是聯系固有免疫與獲得性免疫的樞紐，在免疫應答的誘導中占有獨特的地位[7]。同時也是最主要表達這兩種分子的細胞之一。有研究發現哮喘小鼠骨髓細胞表面CD86表達明顯升高，使其抗原提呈功能明顯增強，T細胞過度活化，尤其主要是向Th2類細胞過度活化[8]。另有研究者[9]對T細胞進行體外T細胞分化分析，發現抗CD80(B7-1)單克降抗體使MBP特異性T細胞向Th2分化，而抗CD86(B7-2)單克隆抗體使之向Thl分化，因此CD80(B7-1)可刺激Thl生成，而CD86(B7-2)則可協同刺激Th2生成。

本研究首先通過用流式細胞術檢測了各組受試者PBMC中CD80和CD86表達變化，發現急性期組和緩解期組患者外周血單個核細胞CD86的表達均明顯高于健康對照組。而急性期組CD80的表達低于緩解期組及健康對照組。說明HSP患者體內的DC出現了異常活化，呈現Th2亢進狀態。如前所述，DC表面的H4R活化后可調控Th細胞的分化，影響Th細胞向Th2型遷移。因此我們進一步通過體外分組培養DC進行觀察。分別加入組胺，組胺+H4R受體拮抗劑JNJ7777120進行誘導，結果發現加入組胺刺激后，DC的p-STAT1和H4R的蛋白表達增高，分泌的趨化因子CXCL16和CCL17增多，明顯高于空白對照組(Plt;0.01)；而加入H4R阻斷劑JNJ7777120后，以上分子表達量均明顯回落，尤其是CXCL16的表達與空白對照組無明顯差異。

綜上所述，DC在HSP患者體內呈異常活化狀態，在體外經組胺刺激后其表面的H4R表達升高，分泌趨化因子增多，而加入H4R拮抗劑后表達水平明顯回落。我們考慮組胺受體H4R可能通過促進DC的趨化因子CXCL16/CCL17的表達，激活JAK/STAT通路，引起或加重HSP的發生發展。

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(收稿：2017-06-26 修回：2017-07-26)

RegulatoryeffectofH4RondendriticcellinchildrenwithHenoch-Sch?nleinpurpura

LEILei1,JIANGJinjin1,GUJun2.

1.DepartmentofPediatrics,ChanghaiHospitalAffiliatedtotheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China; 2.DepartmentofDermatologyandVenereology,ChanghaiHospitalAffiliatedtotheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

GUJun,E-mail:gujun79@163.com

Objective: To determine the regulatory effect of histamine 4 receptor (H4R) on dendritic cells (DC) in children with Henoch-Sch?nlein purpura (HSP).MethodsThe expression levels of CD80 and CD86 in PBMC from 126 patients at acute stage, 112 at remission stage and 94 healthy controls were detected by flow cytometer. The DC was isolated and divided into the histamine group, histamine+H4R antagonist group and PBS control group. The levels of H4R and P-STAT1 proteins on DC were detected by Western blot and the levels of CCL17and CXCL16 were detected by ELISA.ResultsThe level of CD86 from the patients with HSP was higher than that in healthy controls, with a significant difference (Plt;0.01), while the level of CD80 was lower in the patients at acute stage than that in the patients at remission stage and healthy controls (Plt;0.01). The difference in the level of CD 80 between the patients at remission stage and healthy controls was not significant. The level of H4R and P-STAT1 proteins, CXCL16 and CCL17 on DC in the histamine+H4R antagonist group were lower than those in histamine group.ConclusionH4R is associated with the onset and development of HSP, which may go through up-regulating the levels of CXCL16 and CCL17 and activating the JAK/STAT pathway.

Henoch-Sch?nlein purpura; dendritic cell

1第二軍醫大學附屬長海醫院兒科，上海，200433 2第二軍醫大學附屬長海醫院皮膚性病科，上海，200433

顧軍，E-mail：gujun79@163.com