攜帶NDM-1基因ST571型肺炎克雷伯菌引起新生兒醫院感染暴發的研究

賈 楠，李延年，董丹丹，張 會，李宜雷，朱元祺，*

(1.青島大學醫學院，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫院，山東 青島266003)

攜帶NDM-1基因ST571型肺炎克雷伯菌引起新生兒醫院感染暴發的研究

賈 楠1，李延年2，董丹丹1，張 會1，李宜雷1，朱元祺1，2*

(1.青島大學醫學院，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫院，山東 青島266003)

目的調查某醫院兒科分離的6株對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥基因型和相互間的同源性，為控制醫院感染提供依據。方法采用梅里埃Vitek-2 Compact對6株肺炎克雷伯菌進行鑒定及藥敏試驗。改良Hodge試驗和金屬酶E條檢測菌株是否產碳青霉烯酶。聚合酶鏈式反應擴增菌株是否攜帶碳青霉烯酶、超廣譜β-內酰胺酶和Ampc等耐藥基因，并測序確定其基因型。多位點序列(MLST)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)驗證菌株之間的同源性。結果6株肺炎克雷伯菌表現為多重耐藥性，對臨床常用的抗生素耐藥。所有菌株改良Hodge和金屬酶E條試驗均陽性，且攜帶多個耐藥基因。其中5株菌，分別攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因。另外1株ST11型肺炎克雷伯菌攜帶KPC-2 、CTX-M-65、TEM-1和OXA-1基因。5株攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯菌中,有4株的PFGE帶型相同， 且都為ST571型，另一株為ST76型，帶型與前4株不同。結論新生兒病房中存在攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因的ST571型肺炎克雷伯菌引起的醫院感染暴發。

肺炎克雷伯菌；新生兒；醫院感染；新德里金屬β內酰胺酶1型

(ChinJLabDiagn,2017,21:1873)

近年來，由于抗菌藥物的不合理使用，分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌日益增多。尤其是2009年報道自印度分離的一株新德里金屬β內酰胺酶1型(NDM-1)的肺炎克雷伯菌以來，因其能夠水解除氨曲南以外所有的β-內酰胺類抗生素，引起了廣泛的關注。兒童作為免疫系統發育不完善的特殊群體，處于生長發育階段，限制了抗生素的使用，這為臨床在治療兒童感染耐碳青霉烯類腸桿菌時帶來極大的困難。我們收集某醫院分離自兒童的6株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，對其進行基因檢測，發現有5株攜帶NDM-1，1株攜帶KPC-2，且脈沖場凝膠電泳顯示4菌株間存在同源性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 6株肺炎克雷伯菌(JX1-JX6)收集自某醫院兒科報告的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，其中分離自尿液(4/6)、血液(1/6)和分泌物(1/6)標本。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2主要儀器與試劑 法國梅里埃Vitek-2 Compact系統全自動微生物分析儀；瑞典AB Bio MérieuxTM公司E-test藥敏試紙條；英國Oxoid公司M-H培養基；大連寶生基因組提取試劑盒、瓊脂糖、PCR試劑盒和核酸分子量標準；美國Bio-RAD公司MyCycle型PCR擴增儀；美國Bio-RAD公司CHEF MAPPER XA型脈沖場凝膠電泳儀；美國Alpha Innotech公司HP3400型全自動凝膠成像系統。

1.2方法

1.2.1菌株的鑒定、藥敏和碳青霉烯篩選試驗 使用Vitek-2 Compact全自動微生物分析儀對菌株進行菌種鑒定和藥敏試驗。藥敏結果判定依據美國臨床實驗室標準化委員會制定CLSI-2016標準。改良Hodge試驗和金屬酶E-test試驗按說明書進行。

1.2.2引物的設計、合成與耐藥基因的檢測 耐藥基因PCR擴增引物序列依據文獻[1-4]，分別檢測碳青霉烯類耐藥基因(blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaAIM、blaGIM、blaDIM和blaSIM)，超廣譜β-內酰胺酶基因( blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaOXA-1)， AmpC酶編碼基因(blaMOX、blaACC、blaDHA、blaCIT和blaEBC)，磷霉素fosA3基因和喹諾酮類耐藥基因(oqxA，oqxB)。引物合成和產物測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成，測序結果與GeneBank(http://blast.ncbi.nlm.gov/Blast.cgi)中序列進行分析比對。

1.2.3多位點序列分型 依據http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網站提供的引物序列，擴增7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB、rpoB)，擴增反應條件和片段大小見網站。擴增產物送北京睿博興科生物技術有限公司測序，測序結果在MLST網站上進行比對，以獲得細菌的ST分型。

1.2.4脈沖場凝膠電泳 利用脈沖場凝膠電泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)檢測菌株間同源性，具體操作步驟參考文獻[5]。電泳條件設定：片段大小5-400 kb，場強6V，轉角120°，轉換時間0.22-35.38 s，電泳時間18 h 30 min。最后，將膠放入0.5%TBE稀釋的0.5 μg/ml EB中染色30 min，再放入去離子水中脫色120 min，凝膠成像儀拍照成像。結果分析依據Tenover規則[5]。

2 結果

2.1菌株的藥敏和耐藥基因的檢測結果

肺炎克雷伯菌JX1號株除了磺胺甲惡唑/甲氧芐啶外，對目前常用的抗生素全部耐藥。同樣，其他5株(JX2-JX6)肺炎克雷伯菌除了呋喃妥因、環丙沙星、左氧氟沙星和阿米卡星外，也呈現多重耐藥表型。6株菌改良Hodge和金屬酶E條試驗均是陽性。經PCR擴增及測序證實，除了JX1號菌株擴增出blaKPC-2基因，其余5株均有blaNDM-1基因。同時，每一株菌也擴增出多種其他耐藥基因。藥敏和基因檢測結果見表1和表2。

表1 肺炎克雷伯臨床株對抗生素的藥敏結果(μg/mL)

表2 肺炎克雷伯菌攜帶的耐藥基因和多位點分型

2.2菌株的多位點序列分型和脈沖場凝膠電泳結果

經對每株菌7個管家基因擴增測序，在http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網站比對，JX1和JX2分別屬于ST11和ST76型，而JX3-JX6屬于ST571型，見表2。

根據Tenover規則，6株肺炎克雷伯菌經脈沖場凝膠電泳按條帶分布被分為A、B、C型三個型。其中，JX3-6號菌株為A型，條帶位置及數目相差小于3條，表明這4株菌之間存在克隆聚集性，即新生兒科病房中存在攜帶blaNDM-1基因肺炎克雷伯菌的暴發感染。JX1和JX2分別為C和B型，與JX3-6號菌株沒有同源性，見圖1。

注：M，lambda ladder PFG marker；1-6，肺炎克雷伯菌臨床株(JX1-6)

圖1肺炎克雷伯菌XbaI酶切后脈沖場凝膠電泳圖

3 討論

自首例產NDM-1肺炎克雷伯菌報道[6]以來，全球多個地區出現產NDM-1細菌的散發或流行。尤其產NDM-1腸桿菌科細菌感染可導致相對高的死亡率引起越來越廣泛的關注。兒童群體中，由于免疫系統發育不完善，增加了這一群體感染的機率，并且兒童處于生長發育階段，限制了喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類等抗生素的應用。作為最后一道防線的碳青霉烯類抗生素耐藥的出現，使兒童細菌感染的治療將比成年人面臨更多的困難。目前，全球報道兒童感染攜帶blaNDM-1的腸桿菌中，肺炎克雷伯菌占多數，并呈明顯上升趨勢[7]，這就使得控制產NDM-1腸桿菌的感染迫在眉睫。

本研究中，4株攜帶blaNDM-1的ST571型肺炎克雷伯菌(JX3-6)是主要的致病流行株，在分離時間上相近，且均分離自新生兒，有3株分離自尿液，1株分離自分泌物，雖然耐藥表型不完全一致，但脈沖場凝膠電泳顯示這4株菌在條帶分布上相差小于3條，根據Tenover規則判斷為暴發菌株,即該新生兒病房存在攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌的暴發感染。與先前報道攜帶blakpc-2的主要流行株型—ST258 為起源的克隆復合體(包含ST258、ST11和ST512等)一樣， 本次僅分離1株攜帶blakpc-2的ST11型肺炎克雷伯菌。

近年來，國內外也有不少碳青霉烯類耐藥腸桿菌在兒童群體中暴發感染的研究[7,8]。攜帶blaNDM-1的ST571型肺炎克雷伯菌在中國也曾有過散發的病例[9]，但沒有該ST型暴發感染的報道。目前的研究顯示，感染多與侵入性操作、定植、抗生素的不合理使用、住院時間延長等因素有關[10]。由于我們是回顧性研究，沒能收集環境采集的標本，進一步明確感染來源，下一步將繼續進行該流行株基因環境的研究。

我們的研究表明，新生兒病房中存在攜帶NDM-1、SHV-11、DHA-1、 oqxA和fosA3基因的ST571型肺炎克雷伯菌引起的醫院感染暴發。因此，要引起臨床重視，并加強對碳青霉烯類耐藥腸桿菌的監測。

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OutbreakofNDM-1-producingKlebsiellapneumoniaeST571isolatesinaneonatalunit,China

JIANan,LIYan-nian,DONGDan-dan,etal.

(TheMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,and control outbreak of nosocomial infections.MethodsTotal 6 strains of K.pneumoiae were isolated from urines (4/6),blood (1/6) and secretion(1/6) from October 2013 to September 2015.VITEK-2 Compact system (BioMérieux) was used for identification and antibiotic susceptibility test of these isolates.The carbapenemase sceening were done by modified Hodge test and metallo-beta-lactamases E-test(MBL,IMP+EDTA).The drug resistance genes encoding the extended-spectrum-β-lactamases ( CTX-M,SHV,TEM and OXA-1),AmpC enzymes ( MOX,ACC,DHA,CIT and EBC),carbapenemases (KPC,NDM,BIC,OXA-48,IMP,SPM,VIM,AIM,GIM,DIM and SIM),PMQR genes(oqxA,oqxB) were detected by using PCR and product sequencing.The clonal relatedness of the strains was determined by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE) and multilocus sequence typing(MLST).ResultsThe Hodge tests and metallo-beta-lactamases tests were positive in all of six K.pneumoniae isolates .Meanwhile these isolates were highly resistant to most of cephalosporins and carbapenems.One of six isolates carried blaKPC-2,five harbored blaNDM-1.Also other antibiotics resistant genes,encoding SHV-11,TEM-1,OXA1,CTX-M-65,DHA-1,oqxA and fosA3 genes were detected.The PFGE revealed that four ST571 K.pneumoniae strains isolated from neonates belong to the same type.ConclusionOut results showed that there was an outbreak of ST571 K.pneumoniae isolates harboreing the NDM-1,SHV-11,DHA-1,oqxA and fosA3 genes in the neonatal unit.

Klebsiella pneumonia;neonates;nosocomial infections;NDM-1

青島開發區重點科技發展項目(2013-1-82)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1873-04

R378.99

A

2017-05-13)