Ghrelin對AngⅡ 誘導的心肌細胞凋亡的影響及機制

楊春艷,馮朝暉,楊 萍,任 平

(1.吉林大學中日聯誼醫院 心內科,吉林 長春130033;2.吉林大學第一醫院 胸外科)

Ghrelin對AngⅡ 誘導的心肌細胞凋亡的影響及機制

楊春艷1,馮朝暉1,楊 萍1,任 平2*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 心內科,吉林 長春130033;2.吉林大學第一醫院 胸外科)

目的闡明Ghrelin對血管緊張素Ⅱ( AngⅡ)誘導的心肌細胞凋亡的影響及其可能機制。方法體外培養H9C2心肌細胞，分為空白對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Ghrelin組及單純Ghrelin組，采用MTT法檢測細胞存活率，TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況，并應用RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、1型及2型Ang Ⅱ 受體(AT1R，AT2R)mRNA表達。結果與空白對照組相比，Ang Ⅱ組心肌細胞存活率明顯下降；細胞凋亡數目明顯增加；Caspase-3及促凋亡分子Bax表達明顯增加，而抗凋亡分子Bcl-2表達明顯減少；AT1R 及AT2R表達均明顯增加，AT1R增加尤為顯著。與Ang Ⅱ組相比，Ghrelin+Ang Ⅱ組心肌細胞存活率明顯增加；細胞凋亡數目明顯減少；Caspase-3及促凋亡分子Bax表達明顯減少，而抗凋亡分子Bcl-2表達明顯增加；AT1R表達明顯減少，而AT2R表達無明顯變化。結論AT1R及AT2R均參與Ang Ⅱ誘導心肌細胞凋亡進程，Ghrelin可抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡，其機制可能與Ghrelin下調通過下調AT1R表達有關。

Ghrelin;血管緊張素Ⅱ;心肌細胞凋亡;血管緊張素Ⅱ受體

(ChinJLabDiagn,2017,21:1982)

心肌細胞凋亡可導致心肌細胞數目的減少進而影響心肌收縮性，并可引起心肌細胞代償性肥大及纖維化，促進心血管系統疾病的進展。因此，抑制或改善心肌細胞凋亡是是臨床關心的一個重要課題，探尋可抑制心肌細胞凋亡的有效藥物，并明確其抑制心肌細胞的凋亡分子機制具有重要意義。促生長激素釋放多肽(Ghrelin)是生長激素促分泌素(GHS)受體的內源性配體，具有多種生物學活性，包括刺激生長激素(GH)分泌、調節代謝、促進攝食與肥胖等[1]。目前，有研究發現Ghrelin及其受體可在心臟表達[2]，并與心臟上的結合位點具有高度親合力[3-5]，提示心臟為Ghrelin作用的靶器官。Ghrelin還具有增加心肌收縮力、舒張血管、保護內皮細胞、改善心肌能量代謝以及預防保護心梗后心衰的形成等多種心血管保護作用[6-9]。然而，Ghrelin發揮心血管保護作用的細胞及分子機制尚有待進一步研究。H9c2心肌細胞是從胚胎大鼠心室肌中分離克隆的一個細胞系[10]，以往的研究表明，它是體外研究心肌細胞凋亡模型的理想細胞[11,12]。在本研究中，我們培養H9c2細胞，探討Ghrelin對血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導的H9c2細胞凋亡的影響及其可能機制，為臨床應用Ghrelin治療心血管疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑酰基化Ghrelin購自于中肽生物科技有限公司，Ang Ⅱ 與MTT購自于美國Sigma-Aldrich公司 (St.Louis,MO,USA)，TUNEL檢測試劑盒購自羅氏公司(South San Francisco,California,USA)。

1.2H9c2細胞培養及分組H9c2 細胞用含10%血清的高糖DMEM培養液培養,于培養瓶，37℃，5%CO2培養箱孵育，傳至2-3代后用于實驗。實驗分為以下四組：空白對照(Con)組(培養液對照)，Ang Ⅱ組(培養液+ 10-7mol/L Ang Ⅱ )，Ang Ⅱ+ghrelin組(培養液+10-7mol/L Ang Ⅱ +10-7 mol/L Ghrelin )，Ghrelin組(培養液+ 10-7mol/L Ghrelin)。

1.3MTT法檢測H9c2心肌細胞活性將濃度為5-6×105/ml的H9c2心肌細胞懸液接種于96孔板，待細胞長至70%-80%時給予Ang Ⅱ及Ghrelin干預，并于加藥刺激24 h后每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)，于37℃細胞培養箱繼續孵育4 h。去除細胞上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，避光搖晃10 min，于490 nm 處測細胞吸光度，并計算細胞存活百分率。

1.4原位末端標記檢測法(TUNEL)染色檢測H9c2心肌細胞凋亡將生長于玻片上的四組心肌細胞應用TUNEL試劑進行染色，具體步驟按TUNEL說明書進行。染色結束后于暗室光鏡下觀察，細胞核呈綠色熒光即為TUNEL陽性細胞。

1.5RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、AT1R及AT2R的mRNA表達提取總RNA及逆轉錄反應：Trizols提取各組H9c2細胞的總RNA，分光光度計測定RNA的濃度和純度，，然后取2 μg RNA進行逆轉錄,合成cDNA后擴增30個循環。所有引物均由上海生物工程技術有限公司合成,序列見表 1。

表1 RT-PCR引物合成表

2 結果

2.1Ghrelin及AngⅡ對H9c2心肌細胞凋亡的影響

應用Ang Ⅱ及Ghrelin干預H9c2心肌細胞24小時后，MTT法測心肌細胞存活率發現：與Con組相比，給予Ang Ⅱ刺激后H9c2心肌細胞存活率明顯下降(80.5±1.6%)，有顯著性差異(Plt;0.01)； Ghrelin干預組細胞的存活率無明顯改變(99.7±4.1%)，差異無統計學意義(Pgt;0.05)；與Ang Ⅱ組相比，Ghrelin 與Ang Ⅱ共同干預組細胞存活率明顯增高(90.4±4.7%)，有顯著性差異(Plt;0.01)，見圖1。

進一步應用TUNEL染色檢測H9c2心肌細胞凋亡情況，結果顯示：與Con組相比，Ang Ⅱ干預后H9c2心肌細胞凋亡率明顯增高，有顯著性差異(Plt;0.01)；與Ang Ⅱ組相比，Ghrelin與Ang Ⅱ共同干預組H9c2心肌細胞凋亡率明顯降低，有顯著性差異(Plt;0.01)，見圖2及圖3。

**Plt; 0.01 vs.the control group;##Plt; 0.01 vs.the Ang Ⅱ group.

圖1MTT法檢測心肌細胞存活率

2.2Ghrelin及AngⅡ對Caspase-3表達的影響

本研究利用Ang Ⅱ誘導H9c2細胞凋亡，在加藥刺激后24 h，采用RT-PCR檢測Caspase-3表達情況。結果發現Ang Ⅱ 組較空白對照組Caspase-3 mRNA表達水平明顯增加 (Plt;0.01)，而Ghrelin可以明顯下調Ang Ⅱ誘導的Caspase-3表達 (Plt;0.01)，見圖4。Caspase-3 為與細胞凋亡呈正相關的凋亡途徑關鍵分子，上述結果提示Ang Ⅱ可通過促進凋亡關鍵分子Caspase-3表達而誘導心肌細胞凋亡，Ghrelin則可通過下調Caspase-3表達而抑制其作用。

圖2 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡(×400)

**Plt;0.01 vs.the control group;##Plt; 0.01 vs.the Ang Ⅱ group.

圖3TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡百分率

圖4 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA表達

2.3Ghrelin及AngⅡ對Bcl-2及Bax表達的影響

Bcl-2及Bax表達失衡與細胞凋亡密切相關。因此，本研究利用Ang Ⅱ誘導H9c2細胞凋亡，在加藥刺激后24 h，采用RT-PCR檢測Caspase-3表達情況。結果發現Ang Ⅱ 組較空白對照組Bax mRNA表達明顯增加 (Plt;0.01)，Bcl-2 mRNA表達明顯減少(Plt; 0.01)；而Ghrelin可以明顯下調Ang Ⅱ誘導的Bax表達增加(Plt;0.01)，并上調Ang Ⅱ誘導的Bcl-2表達減少(Plt; 0.01)，見圖5。上述結果提示：Ang Ⅱ可能通過誘導Bcl-2/Bax表達失衡而導致心肌細胞凋亡，Ghrelin則可抑制Ang Ⅱ誘導的Bcl-2/Bax表達失衡發揮心血管保護作用。

圖5 RT-PCR檢測Bcl-2及Bax mRNA表達

2.4Ghrelin及AngⅡ對AT1R及AT2R表達的影響

為明確AT1R及AT2R在Ang Ⅱ誘導H9c2細胞凋亡中的作用，實驗采用RT-PCR檢測AT1R及AT2R mRNA表達水平，研究結果顯示，Ang Ⅱ刺激培養的H9c2細胞24 h后，AT1R及AT2R mRNA較空白對照組表達均增加(BothPlt;0.01)，Ghrelin可明顯降低Ang Ⅱ誘導的AT1R表達增加 (Plt; 0.01)，而對AT2R表達無明顯影響 (Pgt;0.05)，見圖6。

圖6 RT-PCR檢測AT1R及AT2R mRNA表達

3 討論

以往的研究表明Ghrelin除刺激生長激素分泌、調節攝食及促進新陳代謝外，尚具有許多心血管保護作用[6-9]。然而，Ghrelin保護心血管作用的相關分子機制尚未完全明確。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)是維持心血管內環境穩定的重要機制之一，Ang Ⅱ是RAAS的核心分子，在許多心血管疾病進程中發揮重要作用[13-15]。以往的研究表明，Ghrelin可以保護Ang Ⅱ誘導的內皮細胞損傷[16],Ghrelin可以抑制Ang Ⅱ誘導的人主動脈內皮細胞移行[17]。因此，我們推測：在心血管系統，Ghrelin可能通過抑制Ang Ⅱ誘導的心肌損傷而發揮心血管保護作用。越來越多的研究表明，Ang Ⅱ可誘導心肌細胞凋亡[18]，為此，我們用Ang Ⅱ誘導H9c2細胞凋亡，并用Ghrelin加以干預，探討Ghrelin對Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡的影響。結果發現Ang Ⅱ可誘導H9c2 細胞凋亡，而Ghrelin可抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡。

Caspase-3 為凋亡途徑的關鍵分子，其表達與細胞凋亡正相關[19,20]。為進一步明確Ghrelin對心肌細胞凋亡的影響，本研究進一步采用RT-PCR法檢測Caspase-3表達情況，結果發現Ang Ⅱ 組Caspase-3 mRNA表達水平明顯增加，而ghrelin可以明顯下調Ang Ⅱ誘導的Caspase-3表達。進一步證實Ang Ⅱ可通過誘導凋亡途徑的關鍵分子Caspase-3活化而導致心肌細胞凋亡，Ghrelin則可抑制其作用。

Bcl-2及Bax表達失衡與細胞凋亡密切相關[21-22]，當Bcl-2表達相對較高而bax表達較低時，細胞活力增強；反之，則可促進細胞凋亡。為探討Ghrlein抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡的分子機制，我們還應用PCR法檢測了Bcl-2 與Bax的mRNA表達水平，結果發現在Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡過程中Bax的表達增加而Bcl-2表達減少，導致Bcl-2及Bax表達失衡，Bcl-2/Bax比值降低，而ghrelin則對其具有抑制作用。上述結果提示，ghrelin可能通過減輕Ang Ⅱ誘導的Bax/Bcl-2比值增加而糾正其表達失衡，從而抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡。

Ang Ⅱ是影響心血管系統的重要內分泌因子之一，主要通過1型及2型受體(AT1R，AT2R)發揮生物學作用[23]，其中Ang Ⅱ與AT1R的結合率約50%-70%[24]。Ang Ⅱ通過AT1R及AT2R發揮生物學作用，然而Ang Ⅱ是經由AT1R還是AT2R介導心肌細胞凋亡，仍存在很大爭議[25-27]。為明確AT1R及AT2R在Ang Ⅱ誘導H9c2心肌細胞凋亡中的作用，研究應用RT-PCR法檢測AT1R及AT2R表達，結果發現Ang Ⅱ刺激后，AT1R及AT2R表達均上調，而Ghrelin可下調AT1R表達，但對AT2R表達無明顯影響。上述結果提示：AT1R及AT2R均參與Ang Ⅱ誘導心肌細胞凋亡過程，通過Ghrelin下調AT1R表達而抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡，進一步提示Ang Ⅱ通過AT1R介導促凋亡分子Bax及Caspase-3表達，抑制抗凋亡分子Bcl-2表達，進而誘導心肌細胞凋亡。此外，Ang Ⅱ干預后AT2R表達亦增加，可明確Ghrelin不通過AT2R抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡，但AT2R是拮抗AT1R的作用還是與AT1R共同介導Ang Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡尚不能明確，仍有待于進一步研究。結合2008年Yanfei等[28]研究發現的新生乳鼠AT2R過表達可誘導心肌細胞凋亡，推測本研究發現的AT2R上調可能也對Ang Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡起促進作用。

綜上所述，我們目前的體外研究不僅明確了ghrelin 可抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡，更重要的是，明確了ghrelin 抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡的可能機制，即：Ghrelin可通過下調H9c2細胞上的AT1受體，影響凋亡相關基因bax、Bcl-2及凋亡關鍵分子caspase - 3的表達，進而抑制Ang Ⅱ誘導的H9c2細胞凋亡。

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EffectandMechanismofGhrelinonH9c2CardiomyocytesapoptosisinducedbyAngⅡ

YANGChun-yan,FENGZhao-hui,YANGPing,etal.

(Departmentofcardiology,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo clarify the effect and possible mechanism of ghrelin on H9c2 cardiomyocytes apoptosis induced by Angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)．MethodsH9c2 cells were cultured and divided into blank control group,group of Ang Ⅱ and Ang Ⅱ + Ghrelin and Ghrelin group.MTT was used to detect cell survival,TUNEL staining was used to observe the apoptosis of H9c2 cells,and the RT-PCR was used to detect the mRNA expression of bcl-2,Bax,Caspase- 3,type 1 and type 2 Ang Ⅱ receptors (AT1R,AT2R).ResultsCompared with the control group,the survival rate of H9c2 cells decreased significantly in Ang Ⅱ group.The number of apoptosis was significantly increased.The expression of Caspase-3 and Bax was significantly increased,while the expression of bcl-2 was significantly decreased.AT1R and AT2R were significantly increased,especially AT1R.However,ghrelin could significantly increase the survival rate of myocardial cells,reduce the number of apoptosis,down-regulate the expression of Caspase-3,Bax and AT1R,and up-regulate the expression of bcl-2.Interestingly,there was no significant change in AT2R expression.ConclusionAT1R and AT2R were both involved in the induction of myocardial apoptosis in Ang Ⅱ.Ghrelin inhibited the apoptosis of myocardial cells induced by Ang Ⅱ,and its mechanism could be related to the down-regulation of AT1R.

heart failure;ghrelin;angiotensin Ⅱ;myocardial apoptosis

國家自然科學基金(81570360,81400298)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1982-06

R541.6+1

A

楊春艷(1980- )，女，博士，主治醫師，主要從事心力衰竭發病機制及治療研究。

2017-02-13)