M型磷脂酶A2受體抗體高靈敏定量方法的建立及臨床應用

黃 飚，王 涼,肖華龍,張 藝,張秋花,楊 雪,胡志剛*

(1.江蘇省原子醫(yī)學研究所,江蘇 無錫214063;2.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院,江蘇 無錫214023)

M型磷脂酶A2受體抗體高靈敏定量方法的建立及臨床應用

黃 飚1，王 涼2,肖華龍2,張 藝1,張秋花2,楊 雪2,胡志剛2*

(1.江蘇省原子醫(yī)學研究所,江蘇 無錫214063;2.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院,江蘇 無錫214023)

目的建立抗PLA2R抗體的超靈敏定量檢測方法，改進抗PLA2R抗體檢測在膜性腎病診治中的應用。方法篩選出一個含高濃度抗PLA2R抗體的血清，采用尿素解離結(jié)合在PLA2R包被孔上的抗PLA2R抗體，并進行IgG抗體定量，推算出原血清中抗PLA2R抗體的濃度，將此已知抗PLA2R抗體濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R抗體的標準品。建立抗PLA2R抗體TRFIA檢測方法，從批內(nèi)批間精密度、靈敏度、回收率、測量范圍、臨床應用等方面對建立的TRFIA方法進行評價。結(jié)果制備了抗PLA2R抗體標準品，設置的抗PLA2R抗體的標準品濃度分別為0 μg/ml、0.17 μg/ml、0.68 μg/ml、3.42 μg/ml、17.1 μg/ml、68.4 μg/ml、343 μg/ml。有效檢測范圍為0.02 μg/mL-343 μg/ml，3份標本的回收率均值為98.96%，低、中、高濃度批內(nèi)CV%(n=20)分別為6.38%、5.55%、4.88%，低、中、高濃度批間(n=8)CV%分別為7.69%、6.23%、6%，均lt;10%。正常參考范圍為0-0.89 μg/ml，29%的IgA腎病、44.4%的紅斑狼瘡腎病、88.5%的IMN抗PLA2R抗體陽性。紅斑狼瘡腎病患者、IgA腎病患者和IMN患者的血清PLA2R抗體含量均顯著高于健康體檢者，對應的P值分別為0.036、0.034和0.000，P均lt;0.05。以正常健康人作為對照組，血清抗PLA2R-IgG抗體在紅斑狼瘡腎病、IgA腎病和IMN的靈敏度和特異度曲線下面積AUCROC分別為：0.738、0.607、0.968，其中對應腎病的檢測準確性程度由高到低分別為：IMN、紅斑狼瘡、IgA腎病。結(jié)論為膜性腎病患者提供一個除穿刺以外的可臨床實際應用的血清學診斷指標，為該病的診斷、活動性的判斷、治療時機的把握、藥物的選擇及療效判斷提供了一個理想的血清學標志物。

時間分辨熒光免疫分析；膜性腎病；特發(fā)性膜性腎?。涣字窤2受體

(ChinJLabDiagn,2017,21:1927)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是引起成人腎病綜合征的一個最常見的病因之一，約占30-40%，也是原發(fā)性腎小球疾病中最為常見的疾病[1,2]。根據(jù)病因不同MN主要分為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)、繼發(fā)性膜性腎病(second membranous nephropathy，SMN)，IMN約占膜性腎病的三分之二；SMN約占膜性腎病的三分之一。目前膜性腎病診斷上要依靠臨床表現(xiàn)及腎活檢病理改變，但存在諸多不足：可能留下創(chuàng)傷，會對腎臟本身造成二次損害，嚴重者可以引發(fā)大出血和感染；腎臟病變多呈局灶性改變，活檢獲取的組織較少，常出現(xiàn)偏差而導致醫(yī)生誤診；此外，腎穿刺的費用很高。如果能有其他醫(yī)學手段，特別是血清學檢查手段能對膜性腎病進行靈敏、準確地診斷和療效評估，將是該疾病診治的一個突破。2009年Beck等[3]在《新英格蘭醫(yī)學雜志》撰文首次發(fā)現(xiàn)存在于正常足細胞表面的膜性腎病的靶抗原：M型磷脂酶A2受體(PLA2R)是特發(fā)性膜性腎病的一個主要抗原。Hofstra等[4]研究發(fā)現(xiàn)抗PLA2R抗體表達轉(zhuǎn)陰或滴度的下降與IMN患者蛋白尿的緩解相關(guān)。隨后，越來越多的研究證實了抗PLA2R抗體的發(fā)現(xiàn)及檢測對膜性腎病的診斷和治療上的重要臨床應用價值[4-8]。但上述的報道主要是采用Western-blot方法進行抗PLA2R抗體的檢測的，要將純化或提取的PLA2R，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜等固相載體上，以固相載體上的PLA2R作為抗原，與患者血清中對應的抗PLA2R抗體特異性結(jié)合后，再加入酶標記的第二抗體起反應，通過加入底物顯色的方法來檢測血清中的抗PLA2R抗體。也有研究者采用了間接免疫熒光法和ELISA方法，但這些方法靈敏度有限，主要用于定性或半定量分析，而且操作復雜費時。血清樣本中抗PLA2R抗體主要是IgG抗體，本研究建立了抗PLA2R-IgG抗體TRFIA方法，并將此技術(shù)應用于膜性腎病的研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本 收集2014年1月至2015年7月間，無錫市人民醫(yī)院腎內(nèi)科已經(jīng)病理學確診的92例腎病患者血清，其中特發(fā)性膜性腎病52例，IgA腎病31例，紅斑狼瘡(SLE)腎病9例， 其他腎病9例(2例為紫癜性腎炎，3例糖尿病性腎病,4例乙肝相關(guān)性腎小球炎)。另從江蘇省江原醫(yī)院檢驗科選取45例健康體檢者(蛋白尿均陰性)血清，作為正常健康人對照組。所有血清樣本，均使用分離膠采血管，離心分離后分裝保存于-70℃冰箱，檢測前恢復室溫使用。特發(fā)性膜性腎病患者的入組標準：(1)臨床除外乙型肝炎病毒感染、惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、其他自身免疫性疾病和藥物等繼發(fā)因素；(2)病理診斷為膜性腎病。

1.1.2儀器與試劑 AutoDELFIA-1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀(美國，Perkin-Elmer公司)，DU-650紫外掃描儀(美國，Beckman公司)，伯樂680酶標儀(美國，伯樂公司)，BX51熒光顯微鏡(日本，OLYMPLUS 公司)，Eu3+標試劑盒(美國，Perkin-Elmer公司)，羊抗人IgG抗體和人IgG抗體(美國，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(DTTA)(美國，Sigma-Aldrich公司)，二乙烯三胺五乙酸五鈉(DTPA)(美國，Sigma-Aldrich公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(美國，Sigma-Aldrich公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國，Sigma-Aldrich公司)，Sephadex-G50柱(美國，Pharmacia公司)，CentriconYM-50超濾管(美國，Millipore公司)，96孔微孔板(丹麥，Nunc 公司)，β-萘基甲酰三氟丙酮(無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司)，HEK293細胞(美國，ATCC公司)，交聯(lián)瓊脂糖凝膠6B(美國，Pharmacia公司)，親和純化層析柱(美國，Pharmacia公司)，反應緩沖液、洗板液和增強液(無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2研究方法

1.2.1固相抗原制備 用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.6)緩沖液將純化的PLA2R(GenBank Accn:NM_001007267，自制)，稀釋成0.625，1.25，2.5，5，10，20 μg/ml， 96孔微孔板各孔加100 μl，4℃包被過夜。棄去包被液后，用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.6)緩沖液沖洗3次，每孔加200 μl 含3 g/L BSA的上述緩沖液封閉，4℃過夜。棄去封閉液，拍干后真空抽干，板條密封后置-20℃冷凍保存[9,10]。

1.2.2Eu3+標記抗人IgG抗體的制備 取羊抗人IgG抗體1 ml，采用含0.155 moL/L NaCl 的Na2CO3-NaHCO3(50 mmoL/L， pH 8.5)作為緩沖液，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件。收集蛋白峰的液體，并濃縮至2 g/L。在含0.4 mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)凍干粉的小瓶中加入l ml濃縮的羊抗人IgG抗體，25℃磁力攪拌反應20 h。反應液經(jīng)用80 mmoL/L tris-HCl pH 7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40 cm)層析，采用AutoDELFIA-1235全自動時間分辨熒光免疫分析儀檢測熒光值，收集蛋白峰，用緩沖液稀釋后分裝凍干保存[9,10]。

1.2.3抗PLA2R-IgG抗體標準品的制備 由于目前國內(nèi)外還沒有抗PLA2R-IgG抗體的定量的標準品，為了使每次的實驗有可比性，首先要制備一個實驗室標準品。

1.2.4抗PLA2R-IgG抗體標準品的提取和定量 通過初步實驗，篩選出一個含高濃度抗PLA2R-IgG抗體的血清，加到PLA2R包被的微孔中， 37°C振蕩反應2 h，用洗滌液沖洗3次，采用6M的尿素將特異性IgG解離到尿素溶液中，將含抗PLA2R-IgG的尿素溶液，在YM-50超濾管中超濾，再根據(jù)已知濃度的人IgG標準品來測定該緩沖液中抗PLA2R-IgG的含量，用反應緩沖液將此已知抗PLA2R-IgG抗體濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R-IgG抗體的標準品。

1.2.5建立抗PLA2R抗體TRFIA檢測方法 從包被濃度的選擇、標記抗體稀釋度的選擇、血清稀釋度的選擇、反應時間的選擇等各方面進行了優(yōu)化。從批內(nèi)批間精密度、靈敏度、回收率、測量范圍、臨床應用等方面對建立的TRFIA方法進行評價。

1.2.6抗PLA2R抗體TRFIA檢測實驗原理 將PLA2R抗原包被在固相，銪標記抗人IgG抗體，如果樣本中存在抗PLA2R-IgG抗體，則形成PLA2R抗原-抗PLA2R-IgG抗體-銪標記抗人IgG抗體復合物，加入解離增強液解離銪離子，采用時間分辨熒光儀檢測熒光值，熒光值的強弱與樣本中抗PLA2R-IgG抗體含量成正比，根據(jù)同樣本同步反應的抗PLA2R-IgG抗體的標準品熒光值繪制標準曲線，計算樣本中抗PLA2R-IgG抗體的含量。

2 結(jié)果

2.1Eu3+標記率Eu3+-羊抗人IgG抗體經(jīng)Sephadex-G50 柱層析，收集第一洗脫峰。以PE公司提供的Eu3+標準為參考，第一洗脫峰的Eu3+含量為26 μmol/L，蛋白含量為2.9 μmol/L，平均每個抗體上結(jié)合了8.9 個Eu3+。

2.2包被濃度的選擇用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.6)將PLA2R稀釋成0.625，1.25，2.5，5，10，20 μg/ml，4 ℃包被過夜，封閉后，加入抗PLA2R-IgG抗體高濃度的樣本，按操作步驟進行反應，檢測各包被濃度對應的熒光值，結(jié)果見圖1，從圖中可以看到，大于5 μg/ml已趨于飽和，實驗中選擇5 μg/ml作為包被濃度。

圖1 包被濃度的選擇

2.3標記抗體的稀釋度選擇將Eu3+標記抗體按1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600稀釋，加入反應緩沖液和抗PLA2R-IgG抗體高濃度的樣本，按操作步驟進行反應，檢測熒光計數(shù)，結(jié)果見圖2，Eu3+標記抗體濃度較低時，其本底也低，但抗PLA2R-IgG抗體高濃度的樣本的結(jié)合率也低，Eu3+標記抗體濃度太高時，本底上升的很高，影響檢測的靈敏度，實驗中選擇1∶400為合適的稀釋度。

2.4血清稀釋度的選擇由于人血清中含有大量的IgG，形成非特異吸附，造成本底的升高，可以通過稀釋降低其非特異吸附，實驗中將正常人血清用緩沖液按1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800稀釋后當樣品檢測，檢測熒光計數(shù)，結(jié)果見下圖3，可以看到，血清樣品稀釋度大于1∶200后，其熒光計數(shù)變化已不大，說明非特異吸附的干擾已經(jīng)很小了，實驗中選擇1∶200為血清合適的稀釋度。

2.5標準點的設置抗PLA2R抗體的標準品濃度分別為0 μg/ml、0.17 μg/ml、0.68 μg/ml、3.42 μg/ml、17.1 μg/ml、68.4 μg/ml、343 μg/ml，0 μg/ml濃度點為反應緩沖液。

圖2 標記抗體的稀釋度選擇

圖3 血清稀釋度的選擇

2.6反應時間的優(yōu)化選擇在確定了合適的包被濃度、標記抗體的稀釋度及血清合適的稀釋度，進行反應時間的優(yōu)化，固定第2步室溫振蕩反應時間為120 min第1步室溫振蕩反應時分別是30、40、50、60、70、80、100和120 min，固定第1步室溫振蕩反應時間為120 min,第2步室溫振蕩反應時分別是30、40、50、60、70、80、100和120 min，加入抗PLA2R-IgG抗體高濃度的樣本，按操作步驟進行反應，檢測熒光值，從圖中可以看出免疫反應時間對于抗原抗體結(jié)合有影響，第1步和第2步反應時間均在60 min后開始走平，故第1步和第2步反應最優(yōu)時間均為60 min，見圖4。

圖4 反應時間的優(yōu)化選擇

2.7檢測范圍和標準曲線經(jīng)雙對數(shù)線性擬合本檢測方法的標準曲線，x軸代表抗PLA2R-IgG抗體的濃度，y軸代表熒光強度，結(jié)果顯示抗PLA2R-IgG抗體的濃度與對應的熒光強度呈良好線性相關(guān)。見圖5。標準品各個濃度點為(0 μg/ml、0.17 μg/ml、0.68 μg/ml、3.42 μg/ml、17.1 μg/ml、68.4 μg/ml、343 μg/ml)，測定20孔零點標準品，mean+2s的熒光值對應的濃度為0.02，即其靈敏度為0.02 μg/ml，檢測上限為343 μg/ml，有效檢測范圍為0.02 μg/mL-343 μg/ml。

圖5 檢測范圍和標準曲線

2.8精密度低、中、高3份血清樣品采用TRFIA法檢測抗PLA2R-IgG抗體的批內(nèi)CV%(n=20)分別為6.38%、5.55%、4.88%，批間(n=8)CV%分別為7.69%、6.23%、6%。

2.9回收率將3份已知抗PLA2R-IgG抗體濃度的血清標本作倍比稀釋，計算實測抗PLA2R-IgG抗體濃度與預計抗PLA2R-IgG抗體濃度比值作為回收率，3份標本的回收率均值為98.96%。

2.10不同腎病患者組與正常對照組抗PLA2R-IgG抗體含量比較經(jīng)T檢驗顯示：9例紅斑狼瘡腎病患者、31例IgA腎病患者和52例IMN患者的血清PLA2R抗體含量均顯著高于45例健康體檢者，對應的P值分別為0.036、0.034和0.000，P均lt;0.05。由此可知，血清PLA2R抗體含量顯著升高與上述腎病密切相關(guān)，可作為分析紅斑狼瘡腎病、IgA腎病和INM腎病患病與否的重要指標，見表1。

2.11ROC分析血清PLA2R抗體在紅斑狼瘡腎病、IgA腎病和IMN分析的靈敏度和特異度曲線下面積AUCROC分別為：0.738、0.607、0.968，均gt;0.500。因ROC曲線面積大小反映檢測準確性，所以血清PLA2R抗體含量在分析腎病方面具有檢測意義，其中對應腎病的檢測準確性程度由高到低分別為：IMN、紅斑狼瘡、IgA腎病。

表1 不同腎病患者組與正常對照組抗PLA2R-IgG抗體含量比較

3 討論

IMN患者血清中PLA2R抗體檢測有不同的陽性率，從50%到85%不等，甚至在一些繼發(fā)性膜性腎病中可檢測到。在他們的研究中至少存在兩個問題可能導致結(jié)果的差異：首先，不同的方法，經(jīng)常使用顏色深度或吸光度濃度，被用來評估PLA2R抗體濃度；第二，較低靈敏度可能很難區(qū)分不同的腎臟疾病。上述研究主要采用western-blot方法進行PLA2R抗體的檢測，Hoxha等[11]在腎臟透析移植研究時提出了一種間接免疫熒光試驗(IIFT)，可以簡單的和可靠的檢測血清中PLA2R抗體，發(fā)現(xiàn)在52%的IMN患者中血清中PLA2R抗體陽性，但沒有發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性膜性腎病血清中PLA2R抗體陽性。也有研究者采用了ELISA方法，但這些方法靈敏度有限，主要用于定性或半定量分析，而且操作復雜費時。所以建立一個靈敏度高的、可定量檢測PLA2R抗體的方法對診斷MN至關(guān)重要。

由于目前國內(nèi)外還沒有抗PLA2R-IgG抗體的定量的標準品，為了使每次的實驗有可比性，首先要制備一個實驗室標準品。通過初步實驗，本課題篩選出一個含高濃度抗PLA2R-IgG抗體的血清，并推算出原血清中抗PLA2R-IgG抗體的濃度，將此已知抗PLA2R-IgG濃度的樣品稀釋到不同濃度作為抗PLA2R-IgG抗體的標準品，為抗PLA2R-IgG抗體檢測的量化提供了依據(jù)。經(jīng)雙對數(shù)線性擬合本檢測方法標準曲線，x軸代表抗PLA2R-IgG抗體的濃度，y軸代表熒光強度，結(jié)果顯示抗PLA2R-IgG抗體的濃度與對應的熒光強度呈良好線性相關(guān)。測定20孔零點標準品，mean +2s的熒光值對應的濃度為0.02，即其靈敏度為0.02 μg/ml，檢測上限為343 μg/ml，有效檢測范圍為0.02 μg/mL-343 μg/ml，表明建立的TRFIA方法檢測抗PLA2R-IgG抗體具有良好的檢測性能。低、中、高3份血清樣品采用TRFIA法檢測抗PLA2R-IgG抗體的批內(nèi)CV%(n=20)分別為6.38%、5.55%、4.88%，批間(n=8)CV%分別為7.69%、6.23%、6%。將3份已知抗PLA2R-IgG抗體濃度的血清標本作倍比稀釋，計算實測抗LA2R-IgG抗體濃度與預計抗PLA2R-IgG抗體濃度比值作為回收率，3份標本的回收率均值為98.96%，表明建立的TRFIA方法檢測抗PLA2R-IgG抗體具有良好的檢測精密度。

紅斑狼瘡腎病患者、IgA腎病患者和IMN患者的血清PLA2R抗體含量均顯著高于健康體檢者，對應的P值分別為0.036、0.034和0.000，P均lt;0.05。由此可知，血清PLA2R抗體含量顯著升高與上述腎病密切相關(guān)，可作為分析紅斑狼瘡腎病、IgA腎病和INM腎病患病與否的重要指標。以正常健康人作為對照組，血清抗PLA2R-IgG抗體在紅斑狼瘡腎病、IgA腎病、SMN和IMN的靈敏度和特異度曲線下面積AUCROC分別為：0.738、0.607、0.968，均gt;0.500。因ROC曲線面積大小反映檢測準確性，所以血清PLA2R抗體含量在分析腎病方面具有檢測意義，其中對應腎病的檢測準確性程度由高到低分別為：IMN、紅斑狼瘡、IgA腎病。T檢驗與ROC曲線分析的結(jié)果一致。

以往的研究中一些IMN患者血清中抗PLA2R-IgG抗體沒有被檢測出來，檢測敏感性在50-85%之間，可能是由于檢測方法的局限性，我們建立的TRFIA法檢測血清中抗PLA2R-IgG抗體的檢測靈敏度可以達到0.02 μg/mL，有88.5%的 IMN患者血清中可以檢測到抗PLA2R-IgG抗體。然而，為什么抗PLA2R-IgG抗體不是在所有的膜性腎病患者血清中發(fā)現(xiàn)？那么，進一步分析，造成IMN患者血清抗PLA2R-IgG抗體陰性的可能原因有：(1) 采用的檢測方法靈敏度還不夠；(2)可能存在其他亞型的PLA2R抗原，其產(chǎn)生的抗PLA2R-IgG抗體不能被我們重組的的PLA2R抗原結(jié)合；(3)抗體水平與疾病活動波動，特別是免疫抑制治療會導致假陰性結(jié)果[3,4,12,13]，病人病情產(chǎn)生緩解，在病人尿液中蛋白質(zhì)下降之前，血清中抗PLA2R-IgG抗體已經(jīng)消失；(4)一些未知的繼發(fā)性因素，抗PLA2R-IgG抗體陰性的患者可能是被錯誤歸類為IMN，他們實際上有可能是繼發(fā)性膜性腎??； (5) 存在其他致病抗體：醛糖還原酶、超氧化物歧化酶 2、ɑ-烯醇酶、1型血小板反應蛋白-7A域(THSD7A)等[14,15]；(6)血清抗體真陰性的特發(fā)性膜性腎病。

總之，TRFIA法定量檢測抗PLA2R-IgG抗體具有很好的臨床應用價值，為膜性腎病患者提供一個除穿刺以外的可臨床實際應用的血清學診斷指標，為該病的診斷、活動性的判斷、治療時機的把握、藥物的選擇及療效判斷提供一個理想的血清學標志物。使該病情的診斷和監(jiān)控更為方便，患者容易接受，有利于特發(fā)性膜性腎病的早期診斷和治療。到目前為止，我們的研究仍處于早期階段，需要進一步做更多的工作。值得注意的是，抗PLA2R-IgG抗體中，IgG4亞型占主要地位[3,16,17]。在接下來的研究中，我們將建立抗PLA2R-IgG4亞型抗體的定量檢測方法，進行特異性和敏感性研究。此外，抗PLA2R-IgG抗體的濃度與IMN的嚴重程度相關(guān)。然而，抗PLA2R-IgG抗體標準品的研究才剛剛開始，在以后的研究中，我們也將著力于更穩(wěn)定、可國際通用的標準品的研制。

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ApplicationofMembranousNephropathydiagnosiswithultrasensitivequantitativedetectionofAnti-PhospholipaseA2Receptor

HUANGBiao1,WANGLiang2,XIAOHua-long2,etal.

(1.JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214063,China;2.WuxiPeople'sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214023,China)

ObjectiveTo establish an ultrasensitive detection method of PLA2R antibodies.Improve the application of PLA2R antibodies in membranous nephropathy.MethodsSelect a serum with high-concentration PLA2R antibodies.Dissociated PLA2R antibodies based on urea from PLA2R .Calculated the original anti PLA2R antibodies concentration in serum with IgG antibody quantitative.The concentration of a known PLA2R antibodies of the sample diluted to different concentrations as a standard of anti PLA2R antibodies.To establish a detection method of PLA2R antibodies by TRFIA .To evaluate TRFIA method from the intra- and inter-batch precision,sensitivity,recovery rate,measurement range and clinical application.ResultsRecombinant PLA2R of the specific immune reactivity was generated and it can be used to detect PLA2R antibodies .The standard of PLA2R antibodies were prepared.Quantitative detection of PLA2R antibodies was performed on the basis of the PLA2R antibodies standards.We developed a highly sensitive and quantitative assay for PLA2R using a time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) for the detection of PLA2R antibodies.This method detects PLA2R antibodies to a lower limit of 0.02 μg/L,with a broad measurement range of 0.02-343 μg/L.The average recovery rate was 98.96%.The intra-assay and inter-assay coefficients of variation (CVs) were both lt; 10% .According to our results,when the cut-off for normal anti-PLA2R-IgG concentration was defined as lt;0.89 μg/mL,the positive rate of detection was 88.5% in IMN,29% in IgA nephropathy cases,44.4% in lupus nephropathy cases.Lupus erythematosus (sle) patients with kidney disease patients,patients with IgA nephropathy and IMN of PLA2R serum antibody levels were significantly higher than that of healthy physical examination,the corresponding P values were 0.036,0.034 and 0.000.In normal healthy people as control group,serum anti PLA2R - IgG antibody in lupus erythematosus (sle) and kidney disease,IgA nephropathy,IMN sensitivity and specific AUCROC offline area are:0.738、0.607、0.968.The corresponding kidney disease detection accuracy degree from high to low are:IMN,lupus erythematosus,IgA nephropathy.ConclusionThis research provides an ideal serological marker for the diagnosis of the disease,active judgment,treatment timing,selection of drugs and curative effect judgment.This method will make the diagnosis of the disease and monitoring is more convenient,and it is easy to be accepted by patients,it is helpful to early diagnosis and treatment of idiopathic membranous nephropathy.

Time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA);membranous nephropathy (MN);idiopathic membranous nephropathy (IMN);Phospholipase A2 Receptor (PLA2R)

江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2014-WSN065)、江蘇省臨床醫(yī)學科技專項(BL20140022)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1927-06

R692

A

黃飚，48歲，男，博士，研究員，博導，江蘇省原子醫(yī)學研究所生物技術(shù)部主任，主要從事高靈敏免疫分析研究。

2016-11-07)