腸癌組織中抗生素檢測及胃腸消化模擬

劉一楠,王佳麗,張同森,陳 雷,沙 爽,張玉玲,邰建東*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 結(jié)直腸肛門外科，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院)

腸癌組織中抗生素檢測及胃腸消化模擬

劉一楠1,王佳麗2,張同森1,陳 雷1,沙 爽1,張玉玲2,邰建東1*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 結(jié)直腸肛門外科，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院)

環(huán)境中普遍存在的藥物殘留物，已經(jīng)成為潛在的環(huán)境生態(tài)危險源。磺胺類藥物是常用的一組人工合成的、具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物總稱，具有較強的抑菌性，被廣泛應(yīng)用于家畜細(xì)菌傳染病的預(yù)防和治療,同時也用來作為生長劑促進動物生長[1]。動物在使用磺胺類藥物以后，部分藥物將以原型化合物或代謝產(chǎn)物的形式隨排泄物進入生態(tài)環(huán)境，給土壤、水體等帶來不良影響，影響人類健康，其不良后果不容忽視[2]。由于在畜禽養(yǎng)殖及臨床醫(yī)療上抗生素的大量使用并不斷向環(huán)境中排放，造成水資源和土壤環(huán)境的嚴(yán)重污染，并誘發(fā)許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，對人類健康造成威脅[3]。

體外胃腸模擬法為研究學(xué)者研究人類及動物提供了一種簡單、快速、低成本的方法，該方法廣泛應(yīng)于各類物質(zhì)的研究[4,5]。該方法曾用于測試多酚、黃酮類及咖啡黑色素抗氧化性能等[6,7]。目前國內(nèi)外對于磺胺類抗生素已有部分研究，主要集中于磺胺類抗生素的檢測方法[8]、水土中的遷移轉(zhuǎn)化[9]、抗性基因[10]、污染修復(fù)[11,12]等方面的研究，但對于磺胺類抗生素的胃腸消化模擬實驗還未見，而已有報道在兒童尿液中檢測出磺胺類抗生素，該胃腸模擬研究可為抗生素在人體內(nèi)的消化代謝規(guī)律及腸癌致病風(fēng)險提供依據(jù)[13]。

1 資料與方法

1.1主要儀器

超聲清洗儀、恒溫水浴鍋、Agilent_1200高效液相裝置(Agilent公司，美國)、WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(上海博迅儀器有限公司)、電子天平(AL104，METTLER TOLEDO儀器有限公司)。

1.2主要材料

收集我院結(jié)直腸肛門外科大腸癌手術(shù)標(biāo)本共34例，其中男20例，女14例，年齡范圍45-79歲，平均年齡65.2歲，體重59-75 kg，平均體重65 kg。并于距腫瘤大于5.0 cm處取材近端腸管正常組織34例作為對照組。

1.3藥品與試劑

正己烷、乙腈(色譜純)；乙酸、無水硫酸鈉(分析純)、ST 、SM、SM2、SMX，磺胺藥物購自SIGMA 公司，純度均大于99.99%；甲醇(色譜純)，甲酸，胃蛋白酶(EP232-25G)、胰蛋白酶(ET355-25G)等，實驗用水為超純水。

1.4腸部組織樣本分析實驗

方法：稱取預(yù)處理樣品5 g置于離心管中，加入無水硫酸鈉20 g，乙酸-乙腈(1+99)混合溶劑20 ml，超聲提取 30 min，殘渣中加入乙酸-乙腈(1+99)混合溶劑20 ml，超聲提取10 min，上清液一并轉(zhuǎn)入棕色瓶中，40℃水浴中加熱破乳去上層油脂，加入正己烷凈化，氮吹濃縮[14,15]，取下清液過0.22 μm濾膜，高效液相儀測試分析[16]。

1.5抗生素胃腸消化實驗(表1)

1.5.1胃消化模擬實驗方法 磺胺類抗生素實驗設(shè)置一個人體模擬組(完全模擬人體環(huán)境)，三個對照組，各組除胃液、腸液成分加入不同外，其余條件均相同。取500 ml棕色瓶(錫箔紙包裹)，加入胃液50 ml，及抗生素，磺胺類抗生素初始濃度為0.25 mg/mL，通N2(避免空氣氧化)，于37℃水浴中搖動。在消化時間為0.5、1、1.5、2 h時取上層清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用HPLC測定。磺胺類抗生素實驗設(shè)置一個樣品組，三個對照組，對照組1胃模擬部分與樣品組相同，對照組2用蒸餾水代替胃液，對照組3用蒸餾水代替胃液中的HCl(區(qū)分酸環(huán)境與胃蛋白酶的作用)[17,18]。

1.5.2腸消化模擬實驗方法 胃模擬實驗后，在樣品組中加入40 ml的腸液，并用1 mol/L的NaHCO3調(diào)節(jié)各溶液pH至7.5，對照組1中加入等量0.1 mol/L的NaHCO3代替腸液(區(qū)分堿性環(huán)境和胰蛋白酶的作用)，對照組2中加入40 ml的腸液并用1 mol/L的NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH至7.5(只有腸液作用)。在消化時間為0.5、1、2、3、4 h時取上層清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用HPLC測定[19,20]。

表1 各組加入胃液、腸液內(nèi)物質(zhì)情況

2 結(jié)果

2.1腸部組織樣本測試結(jié)果分析

通過對34名病患樣本進行測試分析(圖1-4)，少量病患體內(nèi)組織含有磺胺類抗生素，磺胺類抗生素在正常組織部位和病患組織部位均有富集，4種抗生素測試出峰時間分別為2.344s、2.967s、3.907s、5.388s。受地域限制，本次病患樣本多來自東北地區(qū)，東北區(qū)某受污染的地下水土中曾有磺胺類抗生素的檢出，受污染的水土可能通過各種途徑進入人體，而影響人體健康[21]，其中SM2最高檢出含量達(dá)8.03 μg/kg。

圖1病患樣本ST含量圖2病患樣本SM含量

圖3病患樣本SM2含量圖4病患樣本SMX含量

2.2胃腸消化模擬實驗結(jié)果分析

2.2.1磺胺類抗生素的胃腸消化規(guī)律 人體模擬組(圖5)模擬了整體胃腸消化過程。在胃消化階段，4種抗生素均在1.5h時達(dá)到最大消化率，SMX的消化率較高為80%，SM和ST的胃消化過程相似，最高達(dá)到30%，而SM2消化率僅為8%；胃消化主要在后1 h內(nèi)進行。在腸模擬消化階段，SMX的消化率下降至5%，再最后的2 h回升至15%，SM2的消化率為20%，而ST和SM腸消化初期消化率均達(dá)到50%以上，在腸消化后期有所下降。可見SMX的消化主要在胃消化階段進行，而ST、SM、SM2的消化主要在腸消化階段進行。

對照組1(圖6)在胃消化階段與樣品組相同，而在腸消化階段加入0.1 mol/L的NaHCO3代替腸液，在胃消化階段與樣品組相似，SMX的消化率最高；而在腸消化階段沒有胰蛋白酶的作用時，四種磺胺類抗生素的消化規(guī)律相似，最高消化率在50%左右，而在腸消化后期有所下降，可見胰蛋白酶對4種磺胺類抗生素有一定的作用，且作用程度不同，對SM2及SMX的消化有一定的抑制作用，而對SM的消化有促進作用，對ST幾乎沒有影響。

圖5人體模擬組4種抗生素消化率圖6對照組14種抗生素消化率

對照組2(圖7)在胃模擬加入超純水代替胃液，4種磺胺類抗生素含量有較大波動，但在胃模擬結(jié)束時，四種磺胺類抗衡素的殘留量接近初始值，進入到腸模擬階段，四種抗生素消化規(guī)律相似，消化率均在3h時達(dá)到最大，沒有經(jīng)過胃液消化的抗生素，在加入腸液后消化率均僅在5%以下，可見在4種磺胺類抗生素的消化過程中胃消化起著很大的作用。

對照組3(圖8)只模擬了胃消化階段，且加入不含HCl的胃液，與樣品組對比，在僅有胃蛋白酶作用下，各抗生素的消化率均增高，ST和SM在55%左右，SMX消化率最高在80%左右，而SM2最低為30%左右。可見酸性環(huán)境不利于磺胺類抗生素的消化。

圖7對照組24種抗生素消化率圖8對照組34種抗生素消化率

2.2.2胃腸消化酶作用規(guī)律分析 實驗設(shè)置實驗組和對照組[22]，對照組不添加磺胺類抗生素，如圖9、10實驗組和對照組的胃蛋白酶活性變化趨勢相近，實驗組酶活性在0.06 μg/g左右，酶活性總體上大于對照組。在胃模擬0.5和1.5 h時磺胺類抗生素的消化率上升時，胃蛋白酶活性也上升，可見胃蛋白酶可以提高磺胺類抗生素的消化率。

胰蛋白酶測試同樣實驗設(shè)置實驗組和對照組，對照組不添加磺胺類抗生素，對照組的胰蛋白酶活性在70上下波動，而實驗組的胰蛋白酶性變化較大，其變化趨勢與磺胺類抗生素消化率的變化趨勢相近，可見磺胺類抗生素也促使了胰蛋白酶活性的增長。

3 討論

3.1在34名腸癌患者中，共有23名患者檢出磺胺類抗生素，其中有8名檢出有兩種磺胺類抗生素。可見磺胺類抗生素可以通過一些途經(jīng)由水土環(huán)境中進入到人類體內(nèi)，并存留，可能會對人體健康造成威脅。

圖9胃蛋白酶活性變化圖10胰蛋白酶活性變化

3.2抗生素的胃腸消化模擬實驗中，SMX在胃消化1.5 h時消化率最大為80%；在各對照實驗中，胰蛋白酶對SM2及SMX的消化有一定的抑制作用，而對SM的消化有促進作用，對ST幾乎沒有影響；沒有經(jīng)過胃液消化的抗生素，在進入腸消化時消化率均僅在5%以下，可見在四種磺胺類抗生素的消化過程中胃消化起著很大的作用；在僅有胃蛋白酶作用下，各抗生素的消化率均增高。

3.3通過對酶活的測定，胃蛋白酶活性及胰蛋白酶活性與磺胺類抗生素的消化率呈正相關(guān)。

[1]郭欣妍，王 娜，許 靜，等.5種磺胺類抗生素在土壤中的吸附和淋溶特性[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2013，33(11):3083.

[2]Susan D，Richardson.Water Analysis Emerging Contaminants[J].Current Issues，2007，79:4295.

[3]YogeshChander，Satish C Gupta， Sagar M Goyal,et al.Antibiotics Has the magic gon[J].Journal of the Science of Food and Agriculure， 2007，87:739.

[4]Cinq-Mars CD，Hu C，Kitts D D，Li-Chan，et al. Investigations into Inhibitor type and mode simulated gastrointestinal digestion and cell transport of the angiotensin converting enzyme-inhibitory peptides in pacific hake (Merlucciusproductus) fillet hydrolysate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56:410.

[5]Sannaveerappa T.，Westlund S，Sandberg，et al. Changes intheantioxidative property of herring (Clupeaharengus) press juice during asimulated gastrointestinal digestion[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55:10977.

[6]Bermudez-Soto MJ， Tomas-Barberan，et al. Stabilityofpolyphenols in chokeberry (Aroniamelanocarpa) subjected to in vitro gastricand pancreatic digestion[J].Food Chemistry,2007，102: 865.

[7]Rufian-Henares JA， Morales. Effect of in vitro enzymatic digestion onantioxidant activity of coffee melanoidins and fractions[J].Journal of Agriculturaland Food Chemistry，2007，55:10016.

[8]Malintan，Nancy T，Mohdl. Determination of sulfonamides in selected Malaysian swine wastewater by high-performance liquid chromatography[J]. Chromatogr，2006， 1127:154.

[9]Kay P，BJackwell BA.Transprot of veterinary antibiotics in overland flow following the application of slurry to arabaleIand[J].Chemosphere，2005，59:951.

[10]Holger Heuer，Kornelia Smalla.Manure and sulfadiazine synergistically increased bacterial antibiotics resistance in soil over at least two months[J].Environmental Microbiology，2007，9(3):657.

[11]Li wang，Guangcai Chen，Gary Owens，et al. Enhanced antibiotic removal by the addition of bamboo charcoal during pig manure composting[J].Royal Society of Chemistry，2016，6:27575.

[12]Jinsong He，Jiangdong Dai，Tao Zhang，et al. Preparation of highly porous carbon from sustainable α-cellulose for superior removal performance of tetracycline and sulfamethazine from water[J].Royal Society of Chemistry， 2016，6:28023.

[13]Gil-Izquierdo A，Gil M. I，Tomas-Barberan，et al. Influence ofindustrial processing on orange juice flavanone solubility and transformation tochalcones under gastrointestinal conditions[J].Journal of Agricultural and FoodChemistry，2003，51:3024.

[14]Potter RA，Burns BG，van de Riet JM，et al. Simultaneous determination of 17 sulfonamides and the potentiatorsormetoprim and trimethoprim in salmon muscle by liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection[J].Journal of AOAC International，2007，90(1):343.

[15]Bing Shao，Dan Dong，Yongning Wu，et al. Simultaneous determination of 17 sulfonamide residues in porcine meat kidney and licer by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry，2005，546(2):174.

[16]周愛霞，蘇小四，高 松，等. 高效液相色譜測定地下水、土壤及糞便中4中磺胺類抗生素[J].分析化學(xué)，2014，3(42):397.

[17]Dennis D.Miller，Brian R. Schricker，Rober R. Rasmussen，et al. An in vitro method for estimation of iron availability from meals[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,1981，34:2248.

[18]張東平，于迎新，張 帆，等. 環(huán)境污染對人體生物有效性測定的胃腸模擬研究現(xiàn)狀[J].科學(xué)通報，2008，53(21):2537.

[19]Oomen AG，Tolls J，Sips AJAM，et al. In Vitro Intestinal Lead Uptake and Transport in Relation to Speciation[J]. Arch Environ Contam.Toxiacl，2003，44:116.

[20]胡義東. 體外模擬消化條件下芒果抗氧化活性的變化研究[D].廣西大學(xué)，2014.

[21]周愛霞. 潛水中磺胺抗生素遷移轉(zhuǎn)化機理及修復(fù)技術(shù)研究[D].吉林大學(xué)，2015.

[22]Rick W. In，Bergmeyer H U ed. Methods of Enzymatic Analysis，New York and London Academic Press，1963:807.

本項目受吉林省財政廳應(yīng)用類科研基金資助(2016swszx017)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-1948-05

劉一楠(1987-)，男，碩士研究生，從事結(jié)直腸肛門疾病的研究;邰建東(1972-)，男，博士，副教授，從事結(jié)直腸肛門疾病的研究。

2017-02-14)