Decorin對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

孫大菊，張玉成，王雅麗

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心，130033; 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

Decorin對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響

孫大菊1，張玉成2*，王雅麗3*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心，130033; 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科，吉林 長(zhǎng)春130033)

骨肉瘤是最普遍的發(fā)生于長(zhǎng)骨干骺端的一種惡性腫瘤。盡管最近幾十年骨肉瘤的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是由于化療藥物抵抗、放療以及輔助治療的有限性，加之惡性骨肉瘤具有較高的侵襲和轉(zhuǎn)移性，使得晚期骨肉瘤的治療和預(yù)后的效果仍然不理想。因此，闡明骨肉瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制，以及尋找有效的治療方法對(duì)于骨肉瘤的治療和發(fā)病機(jī)理的研究將起到重要的作用[1-3]。核心蛋白聚糖(decorin，DCN)是一種屬于分泌型和富含亮氨酸多糖基因家族成員之一，其主要存在于結(jié)締組織中，研究表明decorin能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。本研究將利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染decorin基因進(jìn)入到骨肉瘤MG63細(xì)胞中，探討decorin對(duì)于骨肉瘤MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與侵襲的抑制作用，為進(jìn)一步研究decorin抑制腫瘤的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料抗人decorin單克隆抗體(Ramp;D公司)；MTT、PI和細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；western blot相關(guān)試劑來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。Transwell chamber(Corning公司)，Matrigel 基底膜(BD bioscience)；Diff-Quick試劑盒染色(Fisher scientific)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM，置于5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。重組decorin真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-DCN)的構(gòu)建方法如前期文章所述[5]。應(yīng)用脂質(zhì)體2000將已構(gòu)建完成含有decorin基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-DCN或pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染到MG63細(xì)胞中。本研究共分為兩組：空白質(zhì)粒對(duì)照組(對(duì)照組)和轉(zhuǎn)染DCN實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)組)。DCN蛋白的表達(dá)應(yīng)用western blot進(jìn)行檢測(cè)。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況用胰酶消化MG63細(xì)胞，吹打以制成單細(xì)胞懸液，并均勻種植于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到90 %左右細(xì)胞融合時(shí)，利用脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后記為第1天，用MTT法連續(xù)3天檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況。測(cè)定當(dāng)天，每孔加入20 μl的5 mg/ml濃度的MTT，避光孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，經(jīng)振蕩充分溶解后，利用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，每組重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以觀察細(xì)胞增殖情況。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到90 %融化時(shí)，利用脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染第3天后，胰蛋白酶進(jìn)行消化，均勻吹打，PBS清洗細(xì)胞兩次，分別按照細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞周期步驟大體如下：50 μl的細(xì)胞懸液加入1 000 μl 70%冰乙醇過(guò)夜，固定完全后，用PBS清洗2次，最終留有50 μl左右的細(xì)胞原液，分別加入25 μl碘化丙啶、10 μl RNase和500 μl的染色緩沖液，避光30 min，最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞凋亡步驟大體如下：細(xì)胞懸液1 000 g離心5 min，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC，以及加入10 μl碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min，最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法劃痕實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種于敷有纖維粘連蛋白的平皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到100 %融合時(shí)，在單層細(xì)胞表面用無(wú)菌槍頭進(jìn)行劃痕，換掉培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，計(jì)算傷口愈合的百分率。每組細(xì)胞重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Transwell小室法：細(xì)胞(5×104個(gè))重懸在100 μl含有1 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞加入到transwell chamber上層小室中，下層小室放入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，transwell chamber上層小室包被10 μg/ml的growth-factor-reduced Matrigel 基底膜；孵育24 h后，去除過(guò)濾膜上層的非侵襲細(xì)胞，固定過(guò)濾膜下層表面遷移的細(xì)胞并用Diff-Quick試劑盒染色和拍照。每孔中隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野下細(xì)胞數(shù)，用每視野平均細(xì)胞數(shù)來(lái)代表侵襲程度。

1.6統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)值用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，Plt;0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DCN蛋白表達(dá)情況Western blot方法檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DCN表達(dá)情況，如圖1所示，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染重組decorin基因后，轉(zhuǎn)染組DCN蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，表明本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功地將DCN基因轉(zhuǎn)染到骨肉瘤MG63細(xì)胞中。

圖1 轉(zhuǎn)染DCN的表達(dá)情況

2.2DCN抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞生長(zhǎng)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組decorin基因第三天，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯生長(zhǎng)緩慢，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05，見(jiàn)圖2)，而轉(zhuǎn)染的前兩天，兩者比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見(jiàn)DCN能夠抑制MG63細(xì)胞的增殖。

2.3DCN阻止骨肉瘤MG63細(xì)胞于G0/G1期細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖3)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增多，而S期和G2/M期明顯減少(Plt;0.05)，可見(jiàn)DCN可以將MG63細(xì)胞阻止于G0/G1期。

2.4DCN對(duì)于骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05，見(jiàn)圖4)，表明DCN可以促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡。

2.5DCN抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移劃痕實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染組細(xì)胞傷口愈合百分率明顯低于對(duì)照組(Plt;0.05，見(jiàn)圖5)，Transwell小室法顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(Plt;0.05)，這些結(jié)果共同表明DCN能夠抑制MG63細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

圖2 DCN抑制MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖3 代表性的細(xì)胞周期結(jié)果圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖

圖4 代表性的細(xì)胞凋亡結(jié)果圖及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

3 討論

在本研究中，我們將decorin基因轉(zhuǎn)染到骨肉瘤MG63細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)decorin基因能夠抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞生長(zhǎng)、將細(xì)胞阻止在G0/G1期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的侵襲和遷移。

以前的研究表明decorin可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，例如肝癌[6,7]、結(jié)腸癌[8]、乳腺癌[9]、鱗癌[10]等。另外，Decorin在許多上皮來(lái)源腫瘤中表達(dá)下調(diào)，這表明decorin可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到抑癌基因作用[11]。此外，decorin不但能夠在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而且在體內(nèi)也能夠起到相同的作用[12]。同時(shí)，許多研究顯示decorin能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲；比如Silvia 等研究發(fā)現(xiàn)移植有乳腺癌細(xì)胞的小鼠，經(jīng)過(guò)DCN治療之后，原發(fā)性腫瘤體積明顯縮小；DCN能夠?qū)ｉT(mén)靶向抑制腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常的細(xì)胞沒(méi)有影響，而且研究還發(fā)現(xiàn)DCN能夠顯著阻止乳腺癌細(xì)胞的肺部轉(zhuǎn)移；另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)DCN的骨肉瘤細(xì)胞系LM8，將其注射種植于小鼠背部，觀察骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)DCN能夠顯著延長(zhǎng)小鼠生存的時(shí)間，而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)DCN可以阻止骨肉瘤的肺部轉(zhuǎn)移。這些研究均表明decorin可以抑制體內(nèi)和體外多種上皮來(lái)源的腫瘤，且能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[13,14]。

在本研究中，我們的成果也顯示，decorin可以抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，這將有利于闡明骨肉瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制，同時(shí)為decorin抑制腫瘤的作用及其作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Thompson LD.Osteosarcoma [J].Ear Nose Throat J， 2013， 92(7):288.

[2]Liang W,Gao B,Fu P,et al.The miRNAs in the pathogenesis of osteosarcoma [J].Front Biosci， 2013，18:788.

[3]Li Y,Zeng C,Tu M,et al.MicroRNA-200b acts as a tumor suppressor in osteosarcoma via targeting ZEB1 [J].Onco Targets Ther， 2016， 9:3101.

[4]王雅麗,張玉成,吳曉冬,等.重組核心蛋白聚糖轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌HepG 2細(xì)胞周期、caspase-3影響的研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志， 2009， 29(4):808.

[5]張玉成,杜珍武,王雅麗,等.分泌型核心蛋白聚糖真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 [J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008，34(2):354.

[6]Yucheng Zhang,Yali Wang,Zhenwu Du,et al.Recombinant human decorin suppresses liver HepG2 carcinoma cells by p21 upregulation [J].Onco Targets Ther， 2012， 5:143.

[7]Hamid AS1,Li J,Wang Y,et al.Recombinant human decorin upregulates p57KIP2 expression in HepG2 hepatoma cell lines [J]. 2013， 8(2):511.

[8]Bi X,Pohl NM,Qian Z,et al.Decorin-mediated inhibition of colorectal cancer growth and migration is associated with E-cadherin in vitro and in mice [J].Carcinogenesis， 2012，33(2):326.

[9]Liang S,Xu JF,Cao WJ,et al.Human decorin regulates proliferation and migration of human lung cancer A549 cells [J].Chin Med J (Engl).2013，126(24):4736.

[10]Campioni M,Ambrogi V,Pompeo E,et al.Identification of genes down-regulated during lung cancer progression:a cDNA array study [J].J Exp Clin Cancer Res，2008， 27:38.

[11]Gu Y,Zhang S,Wu Q,et al.Differential expression of decorin,EGFR and cyclin D1 during mammary gland carcinogenesis in TA2 mice with spontaneous breast cancer [J].J Exp Clin Cancer Res，2010， 29:6.

[12]Reed CC,Gauldie J,Iozzo RV.Suppression of tumorigenicity by adenovirus-mediated gene transfer of decorin [J].Oncogene，2002,21(23):3688.

[13]Goldoni S,Seidler DG,Heath J,et al.An antimetastatic role for decorin in breast cancer [J].Am J Pathol， 2008， 173(3):844.

[14]Shintani K,Matsumine A,Kusuzaki K,et al.Decorin suppresses lung metastases of murine osteosarcoma[J].Oncol Rep， 2008，19(6):1533.

吉林省衛(wèi)生計(jì)生青年科研項(xiàng)[2014Q25]，白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃項(xiàng)目[2013207058]

*通訊作者;*相同貢獻(xiàn)

1007-4287(2017)11-1987-04

孫大菊(1980-)，女，碩士，主管技師，主要從事細(xì)胞病理學(xué)診斷及技術(shù)。

2017-01-18)