人布魯菌病的實驗室診斷

李時孟,李 威,何成彥，謝 風(fēng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

人布魯菌病的實驗室診斷

李時孟,李 威,何成彥，謝 風(fēng)*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

布魯菌病作為最常見的人畜共患疾病之一，在該病高發(fā)地區(qū)感染率可達到1‰[1]，其主要的傳染源為感染的動物及未經(jīng)消毒的奶制品，此外，飲食習(xí)慣、氣候因素以及衛(wèi)生條件等也會影響疾病的傳播。布魯氏菌侵入人體后，起初表現(xiàn)為發(fā)熱、盜汗、頭痛、厭食等非典型癥狀，隨著病程進展，出現(xiàn)菌血癥、毒血癥而引發(fā)多器官感染。近些年我國布魯菌病發(fā)病率逐年上升，越來越重視預(yù)防及早期診斷。隨著近代實驗室技術(shù)的不斷發(fā)展，已有多種針對布魯氏菌的檢驗方法，現(xiàn)就各種實驗室檢測技術(shù)作一綜述。

1 分離培養(yǎng)

布魯氏菌的細菌培養(yǎng)，采集的標本通常為患者的血液、骨髓或其他體液，培養(yǎng)出致病菌是診斷布魯菌病的金標準。然而該法陽性率較低，易受布魯氏菌種屬、疾病分期等多種因素影響[2]。同時，布魯氏菌為緩慢生長型微生物，培養(yǎng)周期長，至少需培養(yǎng)45天無細菌生長才可確認為陰性[3]。此外，布魯氏菌是實驗室感染的主要病原菌之一，故血液培養(yǎng)過程嚴重威脅著實驗室人員的健康[4,5]。近年來隨著全自動血液分析系統(tǒng)的建立，布魯氏菌的培養(yǎng)時間可縮短至一周，但無法對培養(yǎng)出的細菌進行分離仍為一個亟待解決的問題。Fatolahzadeh[6]等人研制出的TUMS培養(yǎng)基解決了這一難題，該培養(yǎng)基為布魯菌病的診斷提供了幫助，在布魯菌病高發(fā)地區(qū)得以廣泛應(yīng)用。

2 血清學(xué)診斷

由于分離培養(yǎng)技術(shù)耗時長、危險性高、敏感性差，現(xiàn)今布魯菌病的診斷多依賴于血清學(xué)的間接診斷技術(shù)。布魯氏菌的主要致病物質(zhì)為光滑脂多糖(smooth lipopolysaccharides，s-LPS)，大部分傳統(tǒng)的血清學(xué)試驗就是應(yīng)用從細菌中提取出的高濃度的光滑脂多糖去檢測人體中的可凝集或非凝集的抗體[7]。但布魯氏菌脂多糖O型側(cè)鏈的免疫表位與多種致病菌相似，如耶爾森氏鼠疫桿菌O：9、沙門菌屬N抗原、霍亂弧菌、弗朗西斯氏菌屬及埃希式桿菌屬O：157，均可引起交叉反應(yīng)而降低診斷的特異性[8]。目前，最常用的血清學(xué)檢驗方法包括玻片凝集試驗(slide agglutination test，SAT)、虎紅平板凝集試驗(Rose Bengale plate test，RBPT)、抗人球蛋白試驗(Coombs’test，CT)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)，上述檢驗方法的精確度排序依次為ELISAgt;RBTgt;SATgt;CT[8]。

2.1玻片凝集試驗及虎紅平板凝集試驗

玻片凝集試驗(SAT)是診斷人布魯菌病的血清學(xué)參考方法。相比于傳統(tǒng)的試管凝集試驗(Wright test)，它具有耗時短、操作簡單的優(yōu)勢。在臨床應(yīng)用過程中，診斷布魯菌病滴度參考范圍仍未達成共識，通常認為若患者有布魯氏菌接觸史并伴有臨床癥狀，SAT滴度≥1∶160即提示與布魯氏菌感染有關(guān)，而在該病高發(fā)地區(qū)以SAT滴度≥1∶320作為診斷標準。在疾病早期及慢性感染過程中，SAT實驗診斷敏感性較低[9,10]。

虎紅平板凝集試驗(RBPT)是利用布魯氏菌1119-3抗原(USDA)進行檢測的快速篩查方法。該法對未接觸過布魯氏菌的患者診斷意義大，但對有過布魯菌接觸史或曾經(jīng)感染過布魯氏菌的患者易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11]，針對這部分患者，將待檢血清標本稀釋可提高診斷的準確性。盡管SAT試驗和RBPT試驗在結(jié)果判斷上受主觀性因素影響比較大，但大量研究表明在不同實驗室之間或應(yīng)用這兩種血清學(xué)方法檢驗時，多數(shù)能得到相同的檢驗結(jié)果。

2.2抗人球蛋白試驗及免疫捕獲凝集試驗

抗人球蛋白試驗(CT)在布魯菌病的診斷中可作為SAT試驗的補充檢測，旨在檢測不完全抗體、封閉抗體及非凝集抗體。該法可檢測到布魯氏菌抗體滴度的細微變化，多用于慢性感染或疾病復(fù)發(fā)時的診斷[12]。

免疫捕獲凝集試驗(Brucellacapt)的靈敏性和特異性與CT試驗相當。相比于傳統(tǒng)血清學(xué)試驗操作復(fù)雜、耗時長的缺點，Brucellacapt最大的優(yōu)勢在于能通過一步法快速檢測凝集及非凝集的IgG和IgA抗體，同時也能提示疾病的預(yù)后[13]。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是一種標準化快速篩查方法，在臨床廣泛應(yīng)用。該法可用于進行IgG、IgM、IgA的定量及免疫球蛋白總量的檢測。IgM滴度檢測可提示布魯菌病的早期感染，然而IgM抗體在檢測中受很多因素影響，如IgM抗體量過大時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。當被檢者同時患有風(fēng)濕類疾病時，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[14,15]。因此，在檢測之前可應(yīng)用特異性免疫吸附劑對待檢血清標本進行吸附。在臨床應(yīng)用過程中，僅對一種免疫球蛋白檢測可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，為了避免這種情況，至少應(yīng)對IgG、IgM兩種抗體檢測，IgG、IgM均陽性時才可診斷為布魯菌病[16]。

隨著檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已出現(xiàn)多種新型商品試劑盒，其中間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(indirect ELISA antibody detection，iELISA)試劑盒具有成本低、耗時短的優(yōu)點，其包被的抗原為光滑脂多糖和粗糙脂多糖的混合物，可用于大范圍篩查[17]。競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(competition ELISA antibody detection，cELISA)試劑盒靈敏性和特異性高，提高了診斷的準確性[18]。此外，補體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(complement fixation ELISA antibody detection，CF-ELISA)可檢測到0.01IU的布魯氏桿菌抗體，其檢測靈敏度與iELISA相當，遠超過SAT及RBPT。

2.4間接熒光抗體試驗

間接熒光抗體試驗(Indirect fluorescent antibody test，IFA)利用熒光標記二抗來檢測IgG、IgM、IgA抗體，檢驗過程需2-3 h。其檢驗結(jié)果需在熒光顯微鏡下觀察，對檢驗人員要求較高且檢驗結(jié)果易受主觀因素影響[9,10]。

2.5側(cè)向?qū)游鲈囼?/p>

側(cè)向?qū)游鲈囼?lateral flow assay，LFA)是一種操作簡單、可用于床旁或牧場直接接種的新型檢驗方法。與其他血清學(xué)檢驗方法不同，該法無需任何實驗室設(shè)備，反應(yīng)試劑也不需要冷凍保存，適用于實驗室條件較差的地縣級醫(yī)院使用。R.Shome等[19]的研究表明LFA的敏感性略低于ELISA，特異性與RBPT相近，雖不適用于人群中大范圍篩查，但可用于農(nóng)舍中動物感染的早期診斷。

3 分子生物學(xué)診斷

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction，PCR)可檢測外周血及其他組織標本[20]，其特異性優(yōu)于血清學(xué)試驗，靈敏性高于傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)，同時降低了實驗室感染發(fā)生的幾率。大量研究表明PCR技術(shù)對急性、慢性及復(fù)發(fā)性布魯氏菌病的診斷均有意義[21]。1990年，F(xiàn)ekete等人首次應(yīng)用PCR技術(shù)對布魯氏菌進行檢測，此后，隨著研究的不斷深入，已能夠?qū)Σ剪斒暇鷮龠M行分類[22]。現(xiàn)今，PCR技術(shù)在人布魯菌病及動物布魯菌病的診斷中應(yīng)用廣泛[23]。

3.1標準聚合酶鏈反應(yīng)

標準聚合酶鏈反應(yīng)(Standard PCR)操作簡單、耗時短，檢測樣本多為血液。PCR反應(yīng)的高效性主要依賴于引物的特異性，在以往的研究中已發(fā)現(xiàn)了多種布魯氏菌的引物，但針對人感染布魯氏菌的引物卻不多。Baddour MM等[24]的研究發(fā)現(xiàn)了三組引物，分別為編碼BCSP 31(B4/B5)的基因、布魯氏菌16S RNA序列以及編碼omp2(JPF/JPR)的基因，實驗結(jié)果顯示針對人感染布魯氏菌其敏感性差異較大，分別為98%、88.4%及53.1%。除引物因素外，待測血液標本中高白細胞含量或存在亞鐵血紅素復(fù)合物時亦會影響實驗結(jié)果。

此外，對待檢血液標本的選擇也存在爭議，Zerva L[25]等的研究表明血清更適用于PCR技術(shù)在布魯菌病診斷中的應(yīng)用，而 Mitka S[26]等則認為全血是更優(yōu)的實驗標本，主要原因在于白細胞層對布魯菌病的診斷意義更大。

3.2實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time PCR)可對血液標本中的核酸進行定量檢測。目前，實時定量PCR技術(shù)已經(jīng)能夠區(qū)分布魯氏桿菌的不同菌屬，其檢測靶點分別為16S-23S內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer region ，ITS)、omp25編碼基因、omp32編碼基因、BCSP31編碼基因以及IS711編碼基因[27-29]。Surucuoglu S[30]等的研究表明實時定量PCR技術(shù)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為88%、100%、100%、83%。鑒于該法高效、高靈敏性、高特異性的特點，可用于診斷無典型臨床表現(xiàn)且微生物學(xué)檢驗陰性的早期感染患者[31]。此外，實時定量PCR技術(shù)對布魯氏菌病的療效及復(fù)發(fā)也有提示作用。

3.3多重聚合酶鏈反應(yīng)

多重聚合酶鏈反應(yīng)(Multiplex PCR)可用于檢測病毒、細菌及其他病原體。其主要優(yōu)點為成本低、耗時短、可同時對多種病原體進行檢測。有研究表明快速多重PCR可在一個半小時內(nèi)完成對布魯氏桿菌的診斷及分型[32,33]。并非所有種屬的布魯氏菌均對人類致病，因此檢驗過程中對布魯氏菌的分型尤為重要。Ignacio[34]等的研究表明新型布魯氏菌多重階梯聚合酶鏈反應(yīng)(New Bruce-ladder multiplex PCR assay)可快速區(qū)分豬屬布魯氏菌和犬屬布魯氏菌的感染，既可用于實驗室檢驗，也可用于動物檢測。此外，多重PCR還可用于肺外結(jié)核病與不典型布魯菌病的鑒別[35]。由于有多組引物的存在，多重PCR易形成引物二聚體，清除非特異性PCR產(chǎn)物及保持各組份相同的擴增效率可提高檢驗的準確性。

3.4巢式及半巢式聚合酶鏈反應(yīng)

巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested PCR)是有兩次相繼進行的聚合酶鏈反應(yīng)組成的PCR技術(shù)，其第二次PCR是在第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物序列范圍內(nèi)進行擴增[36]。與巢式PCR相似，半巢式PCR(semi-Nested PCR)也含兩組引物，但其第二次PCR引物與第一次的相同[37]。這兩種方法提高了PCR的成功率和分析的特異性。然而，巢式及半巢式PCR也存在一些不足，比如在反應(yīng)過程中易出現(xiàn)引物二聚體及PCR產(chǎn)物的交叉反應(yīng)。此外，該法僅能對單個布魯氏桿菌進行檢驗，不能鑒別不同菌屬。

綜上所述，分離培養(yǎng)仍是布魯菌病診斷的金標準，但耗時長，常錯失抗菌藥物的最佳治療期。血清學(xué)檢驗更高效，但缺乏國際統(tǒng)一的診斷標準，在臨床上，布魯氏菌病的確診仍很困難。有研究指出血清學(xué)檢驗陰性的血樣，在細菌學(xué)檢驗中可分離出布魯氏菌，布魯氏菌抗體效價的高低和細菌學(xué)檢驗中能否分離出致病菌也無必然聯(lián)系。故有臨床癥狀的患者，建議同時行細菌學(xué)及血清學(xué)檢驗，避免漏診。隨著檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)檢驗方法以快捷、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，有望成為布魯氏菌的常規(guī)檢驗方法，但其費用較高，無法用于大范圍篩查。因此，還需要更多、更有價值的研究不斷改進現(xiàn)有的實驗方法，以實現(xiàn)布魯氏菌病的早期診斷及治療。

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吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)專項項目(2015Y033-1)

*通訊作者

1007-4287(2017)11-2033-04

2016-12-18)