儲存玉米中黃曲霉毒素主要產生菌的檢測及污染預防研究

劉增然, 張光一, 王南南, 徐 曼

(河北經貿大學生物科學與工程學院, 石家莊 050061)

儲存玉米中黃曲霉毒素主要產生菌的檢測及污染預防研究

劉增然*, 張光一, 王南南, 徐 曼

(河北經貿大學生物科學與工程學院, 石家莊 050061)

通過對儲存玉米霉變初期的感官癥狀觀察、分離菌的PCR檢測及在不同環境條件下的生長預測模型建立,探討了識別、預防儲存玉米發生黃曲霉毒素及其主要產生菌污染的實用方法。結果表明:籽粒色澤及致密性改變、表面有潮濕感、糧堆內局部發熱等癥狀的出現可表征儲存玉米有可能發生真菌污染。以毒素合成相關的全局性調控因子veA基因為靶標,對污染玉米樣品分離菌進行PCR檢測,擴增出約1.9 kb的條帶,與預期大小相符,證明污染菌是黃曲霉或寄生曲霉。污染曲霉在不同玉米水分活度和環境溫度下的生長數據,經Baranyi函數擬合、估測其最大生長速度,并建立了生長速度隨玉米水分活度和環境溫度變化的多項式回歸模型;模型顯示玉米水分活度和環境溫度對污染曲霉的生長影響具有協同性;要確保儲存玉米安全,儲存參數的限值選擇應遠離適合污染菌生長的區域。本研究為儲存玉米安全管理決策、玉米水分活度和環境溫度限值的選擇及調控提供支持,利于降低儲存玉米的黃曲霉毒素及其主要產生曲霉 (黃曲霉或寄生曲霉)的污染風險。

玉米; 黃曲霉毒素; PCR檢測; 生長模型; 感官變化

玉米作為三大糧食作物之一,粗纖維含量高、氨基酸平衡好,被廣泛食用和飼用。其胚部組織疏松、吸濕性強、富含碳水化合物,易受真菌侵染[1]。玉米長期儲存中如果管理不當,可能發生結露、蟲蝕、局部發熱、真菌孢子萌發并導致真菌毒素污染,造成經濟損失。

已有證據表明,玉米的真菌及毒素污染與玉米品種、污染菌種屬及環境條件有關[2]。很多研究基于高度保守DNA 序列 (如rDNA的內轉錄間隔區)或真菌毒素合成相關的結構基因 (如aflD、aflO、aflQ)與調控基因 (如aflR、aflS)進行分子檢測,確定玉米是否被真菌污染[3-8]。已有研究證明,真菌的全局性調控因子VeA控制其生長分化、形態發生、次生代謝、環境脅迫應答、侵染宿主致毒致病[9],是真菌產生毒素所必需的基因。因此veA可以作為檢測真菌是否存在及玉米籽粒是否為真菌毒素污染的靶標基因。

關于環境因子對玉米貯存中產黃曲霉毒素真菌的發育及其產毒的影響已有研究[10-13],證明玉米水分活度、環境溫度是決定儲存玉米霉變的主要因素。如果玉米籽粒含水量高或環境溫度和濕度波動大,可能導致玉米霉變。李瑞芳等[14]、趙立等[15]、岳曉禹等[16]也分別利用馬鈴薯培養基、玉米籽粒、玉米粉培養基進行了初步研究。一般認為,玉米籽粒含水量小于14%或儲存溫度低于10℃可實現玉米的安全儲存。然而,真菌生長預測模型在指導玉米種植戶調控玉米存儲條件、防控真菌污染領域的應用研究缺乏。

為了確保儲存玉米的質量、防控真菌及其毒素的污染,需要對儲存玉米的真菌污染予以實時監控、定期檢測,做到早發現早控制。因此,本研究基于分子檢測技術、感官分析和預測生長模型應用,提出了預防控制玉米黃曲霉毒素及主要產毒曲霉(黃曲霉和寄生曲霉)污染的方法,以期為我國散儲玉米的黃曲霉毒素污染防控、儲存環境關鍵參數監控、污染風險預警提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

培養基:基礎培養基 (glucose minimal medium):葡萄糖10 g/L,硝酸鈉6 g/L,磷酸二氫鉀1.52 g/L,氯化鉀0.52 g/L,硫酸鎂0.52 g/L,1 000×微量元素溶液1 mL,瓊脂15 g/L,pH 6.5;馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(potato dextrose agar):馬鈴薯200 g/L,蔗糖20 g/L,瓊脂15 g/L;玉米粉培養基(corn extract medium):玉米粉30 g/L,煮沸后雙層紗布過濾,用甘油調整培養基所需水分活度(0.98、0.94、0.90、0.86、0.82)[12],瓊脂15 g/L。

試劑及儀器:PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DL5 000 DNA Marker,寶生物工程 (大連)有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;黃曲霉毒素B1酶聯免疫定量檢測試劑盒,上海佑隆生物科技有限公司;細胞破碎液:pH 8.0 Tris-HCl 10 mmol/L,Triton X-100 2%,NaCl 100 mmol/L,SDS 1%,pH 8.0 EDTA 1 mmol/L。PCR儀,德國Eppendorf公司;凝膠成像系統,美國Aplegen公司;酶標儀,美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米霉變調查和癥狀觀察

2015年和2016年對河北省石家莊市無極縣玉米儲戶進行現場調研,參考玉米儲存品質判定標準 (國標GB/T20570-2015),對儲存玉米的霉變、鼠害、蟲蝕情況進行檢測;記載玉米籽粒霉變引起的感官性狀變化,包括色澤、質地、觸感、氣味、完整性等。同時調查玉米存儲前霉變粒、破損粒及未熟粒的去除情況,玉米儲量、糧堆內發熱、鼠咬蟲蝕、溫度和濕度監控、污染玉米處理等。

1.2.2 樣品采集

采集霉變玉米、未霉變玉米作為供試材料。2015年10月-2016年6月從石家莊市無極縣的32個玉米儲戶和12個小型飼料廠隨機采集常溫儲存玉米80份、新收獲玉米44份。對玉米儲戶,將儲糧袋的玉米混勻取樣;對飼料廠儲存庫,在距糧堆表面20 cm和底部20 cm處分別取樣,中間區段根據高度再取1～2個樣。每個樣品約1 kg,裝入無菌采樣袋。樣品攜帶回實驗室后,每份樣品隨機取50 g,經70%乙醇浸泡3 min、無菌雙蒸水淋洗、濾紙吸干后,分別裝入無菌樣品瓶,4℃儲存,用于分離曲霉;其余樣品經干燥保存,用于測定黃曲霉毒素含量。

1.2.3 黃曲霉毒素B1檢測

黃曲霉毒素提取:每個玉米籽粒樣品取1 kg,籽粒粉碎后混勻。取500 mg粉碎的樣品,加入250 μL甲醇水(70∶30,V/V)萃取液,高速振蕩3 min,3 600 r/min離心10 min。上清液用于測定黃曲霉毒素含量。

黃曲霉毒素B1測定:96孔酶標板各標準孔加入50 μL不同濃度的黃曲霉毒素B1標準液,各樣品孔加50 μL待測樣液;向各孔加50 μL酶標工作液,輕搖混勻,25℃恒溫箱孵育10 min;甩干微孔板內液體,加250 μL洗液,靜置1 min,倒掉洗液,重復3次,吸水紙拍干;加100 μL顯色劑,25℃恒溫避光孵育10 min;加終止液100 μL搖勻,450 nm波長下測定吸光度值。黃曲霉毒素B1的檢測限為1 μg/kg,樣品重復測定3次,取平均值。

1.2.4 真菌孢子懸浮液制備

菌株接種MMG+0.2% YE固體平板,37℃培養2 d; 用5～10 mL無菌水收集孢子,控制懸浮液孢子濃度在1×106～5×106個/mL。

1.2.5 PCR檢測

真菌基因組DNA提取:將真菌孢子懸液接入含2 mL MMG液體培養基的試管,接種量為1×105個/mL;試管斜放、37℃靜置培養16 h;收集菌絲體,加500 μL細胞破碎液,500 μL酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)和300 μL 0.5 mm氧化鋯/硅玻璃珠,4℃高速均質2 min,離心;水相經無水乙醇沉淀、70%乙醇洗滌,再用pH 8.0 TE溶解。

玉米基因組DNA提取:取0.5 g粉碎的玉米樣品,加200 μL溶液A和20 μL RNaseA,100 mg玻璃珠,渦旋振蕩30 min;加20 μL蛋白酶K,55℃水浴消化30 min,12 000 r/min離心1 min收集上清液;加200 μL溶液B、200 μL無水乙醇、混勻,轉至吸附柱靜置2 min,離心棄廢液;吸附柱以600 μL漂洗液漂洗2次,室溫放置幾分鐘;吸附柱用20 μL 65℃的洗脫液洗脫,收集洗脫液即基因組DNA。

引物設計:根據黃曲霉 (GenBank登錄號為DQ296645.1)、寄生曲霉 (GenBank登錄號為AY445513.1)的veA基因序列,經NCBI/Primer-BLAST設計通用引物FUA1+FUA2,產物大小1 875 bp,用以檢測黃曲霉毒素主要產生曲霉;根據擬輪枝鐮孢 (GenBank登錄號為DQ274059.1)和尖鐮孢(GenBank登錄號為KF745043.1)的veA基因序列,設計通用引物FUF1+FUF2,產物大小913 bp,用以檢測玉米生長階段易污染的鐮孢菌。兩對引物序列分別為:FUA1:5′-TCATTGCTAGCTGGTCATTATT-TGAT-3′,FUA2:5′-ATTCTCCCGTTGGCTCGTTT-3′;FUF1:5′-AGTGTGGAAGAGGGCAAGGA-3′,FUF2:5′-AAGGGCACGAAGGAGGAATG-3′。

PCR擴增:以真菌的全局性調控因子veA基因為檢測靶標。PCR擴增體系為20 μL:2×PrimeSTAR Max Premix 10 μL,各引物1 μL,模板DNA 1 μL,雙蒸水加至20 μL。PCR 擴增程序:98℃變性10 s,55℃ 15 s,72℃ 5 min,循環30次;4℃保溫。PCR產物進行凝膠電泳:PCR產物5 μL,于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳約1 h (5 V/cm),凝膠經EB染色,用成像系統觀察照相。

1.2.6 污染菌生長模型建立

污染菌生長測定:參照Duran等[17]的方法,在不同水分活度的CEM平板中心處,用5 μL (1×106～5×106個/mL)的孢子懸浮液點板,一定溫度和水分活度下培養約20 d。不同培養條件用不同的塑料密封箱,內置500 mL甘油水溶液以保持需要的空氣濕度。每日測量菌落直徑 (過接種點,在互相垂直的方向測量2次,取平均值y),直到生長最快的菌落接近平板邊緣。每個條件設4個平板(4次重復),取平均值。

初級生長模型擬合:借助SPSS 19.0統計軟件,用Baranyi & Roberts[18]方程擬合生長數據,建立不同條件下污染菌的初級生長模型;并預測其最大菌落生長速度 (μmax, mm/d)。

exp(-μmaxλ)-exp(-μmaxt-μmaxλ)]

其中y、y0、ymax分別為菌落直徑(mm)、起始直徑(mm)、最大直徑(mm);μmax最大生長速度(mm/d);λ遲滯期(d);t培養時間(d)。

多項式回歸模型構建:通過回歸,獲得分離菌最大生長速度對玉米水分活度和環境溫度的二次多項式回歸模型。

生長速度二維等值圖:借助Sigma Plot 12.0(Systat Software Inc. Hounslow, London, UK)軟件,得出不同玉米水分活度和環境溫度下,污染菌的生長速度對數等值圖,用于描述玉米水分活度和環境溫度對污染菌生長的影響。

2 結果與分析

2.1 儲存玉米霉變的感官性狀調查

對儲存玉米的感官性狀進行實地調查。結果表明,真菌污染使玉米籽粒外觀、質地、氣味發生改變,導致重量變輕、果皮層的致密性和光澤下降 (表1)。玉米霉變的早期癥狀包括:籽粒表面發生潤濕現象、色澤更顯鮮亮,糧堆內有潮濕感、發熱,有微甜味;然后籽粒硬度與光澤降低、顏色變暗,籽粒攪動聲不再清脆。經過大約1周的濕熱積累,玉米可能發生霉變,先是胚部變暗、變黑,然后胚部表面、破損粒斷面長出白色棉毛狀菌絲體,有淡淡霉味;進一步霉變產生肉眼可見的黃綠色、灰綠色、淡粉色的真菌孢子,有霉味、酒味和辛辣味 (圖1A)。潮濕天氣下,儲存玉米易發生蟲蝕,甚至形成蛀孔、隧道和玉米碎屑,蟲蝕將進一步促進玉米霉變。玉米儲戶或小飼料廠可通過定期觀察儲存玉米有無潮潤、發熱、輕度異味、蟲蝕、光澤降低、顏色變暗、毛狀物產生等現象,確定玉米有無霉變的趨勢或是否已經霉變。

表1儲存玉米霉變后的感官性狀變化1)

Table1Changesinthesensoryattributesofstoredcorninfectedbyfungi

指標Parameter正常玉米Uninfectedcorn霉變玉米Infectedcorn飽滿度Plumpness籽粒飽滿飽滿度降低、水中漂浮質地Texture籽粒緊密、堅實表面疏松、種皮易脫除色澤Colorandlustre保持固有的色澤、透亮初期顏色鮮亮，然后光澤降低、顏色變暗氣味Smell玉米清香味酸味、玉米酒味、霉味或其他異味口感Tastefeeling淡甜味淡苦味、酸味完整性Wholeness籽粒完整，不易發生霉變籽粒不完整，易發生霉變攪動性能Stirringperformance響聲清脆，流動性好響聲沉悶，有阻力濕熱感Wetandhotfeeling未產生濕熱感籽粒有潮濕感，糧堆局部發熱升溫蟲害Insectdamage無蟲蝕、無蟲蛀有蛀孔及碎屑霉變Mildew無初期胚部有白色菌絲，后期產生黃綠、灰綠、淡粉色、黑色孢子，呈粉末狀

1) 口感:玉米用開水煮1 h,控去水,咀嚼。 攪動性能:用手攪動玉米發出的聲音和感覺。

Taste feeling:Boil the stored corn with water for about one hour and drain the water, then chew to get the mouth feeling. Stirring performance:Sound emitted and feeling when corn is stirred with hands.

2.2 儲存玉米黃曲霉毒素污染水平測定

用酶聯免疫法檢測采集的儲存玉米樣品的黃曲霉毒素B1污染水平 (表2)。結果表明:部分儲存玉米樣品的黃曲霉毒素污染嚴重,最高達到155.6 μg/kg,遠遠超出國家標準 (20 μg/kg)。一般儲戶的玉米儲量小,檢測到黃曲霉毒素的幾率低,污染水平也低;小飼料廠的玉米儲量較大,儲存條件簡陋,缺少控制措施,檢測到黃曲霉毒素污染的幾率高,污染水平也高。因此,要確保玉米源的食品或飼料安全,有條件的飼料廠需定期檢測儲存玉米的黃曲霉毒素水平,更要采取措施預防控制玉米的黃曲霉毒素污染,確保玉米的黃曲霉毒素污染水平低于20 μg/kg。

表2儲存玉米的黃曲霉毒素B1污染水平1)

Table2LevelsofaflatoxinB1inthestoredcornsamplesfromlocalfeedmillsandfarmers

玉米樣品Cornsample樣品數/個Samplesize陽性率/%Incidencerate黃曲霉毒素B1含量/μg·kg-1AflatoxinB1level未儲玉米Unstoredcorn440ND儲存玉米Storedcorn飼料廠487539．1±2．6農戶322519．4±2．1

1) ND:未檢測。

ND:Not detected.

2.3 儲存玉米污染菌的PCR檢測

分別以黃曲霉、擬輪枝鐮孢和新鮮玉米基因組DNA為模板,用引物FUA1/ FUA2+FUF1/FUF2混合物進行PCR,驗證設計引物的特異性。電泳圖顯示(圖1B):以黃曲霉基因組DNA為模板的PCR產物約1.9 kb,擬輪枝鐮孢基因組DNA為模板的PCR產物約0.9 kb,與設計大小一致;而新鮮玉米基因組DNA為模板沒有獲得PCR產物。經NCBI/Primer-BLAST對FUA1/FUA2和FUF1/FUF2進行特異性分析,FUA1/FUA2引物與擬輪枝鐮孢基因組DNA不能緊密互補,FUF1/FUF2引物與黃曲霉基因組DNA不能緊密互補。證明設計引物具有各自對應基因序列的特異性,可用于目標菌的檢測。

從污染嚴重的玉米樣品中分離純化到表型與黃曲霉一致的菌株。提取分離菌的基因組DNA作為模板進行PCR擴增,PCR產物約1.9 kb,與設計的黃曲霉基因組DNA的PCR產物大小一致;新鮮玉米樣品和陰性對照沒有擴增到任何條帶(圖1B)。結果證明污染玉米分離菌株是黃曲霉毒素產生菌,即黃曲霉或寄生曲霉,veA基因可以作為目標基因,用于鑒別玉米是否被黃曲霉或寄生曲霉污染。

圖1 污染玉米分離菌的檢測Fig.1 Identification of the isolate from the infected corn kernels

2.4 儲存玉米污染菌的生長預測模型建立

分離的黃曲霉毒素產生菌(黃曲霉或寄生曲霉)用不同水分活度(0.82、0.86、0.90、0.94、0.98)的CEM培養基,在不同溫度(15、20、25、30、35℃)下培養,測定菌落直徑,經Baranyi函數擬合獲得初級生長模型(圖2a),并估測最大直徑生長速率μmax。為了反映玉米水分活度及環境溫度對污染菌生長速率的影響,對最大菌落生長速率進行多項式擬合,并借助Sigma Plot 12.0繪制污染菌最大生長速度的對數等值線圖(圖2b)。獲得的回歸方程如下:

圖2表明水分活度(aw)和環境溫度(T)協同影響污染菌生長。污染菌生長顯著依賴CEM的aw,0.82aw時菌落生長較慢,aw越高菌落生長速度越大;隨著T升高,菌落生長加快,30℃時生長最快,然后迅速減慢,最適生長溫度是27～32℃;試驗條件下,污染菌的最佳生長條件是0.98aw+ 30℃,生長速度為7.2 mm/d。玉米水分活度和環境溫度對污染菌的生長影響具有協同性,aw和T交匯點在-0.7等值線下側,污染菌不生長,在-0.7線上側污染菌能生長;要確保儲存玉米安全,玉米儲存參數選擇應遠離適合污染菌生長的區域。

3 討論

玉米收獲前后易受到各種產毒真菌侵染,生長階段易感鐮孢菌,儲存階段易染曲霉[19]。調查發現,多數玉米種植戶能進行較規范的種植管理、晾曬干燥和霉變穗揀出。而玉米儲戶和小飼料廠對玉米儲存重視不夠,儲藏方式傳統、設施簡陋,儲前多未進行篩分處理，未去除不成熟粒和破損粒,儲存中未實施監控管理,使儲存玉米更易發生真菌污染。而且,農村儲糧存在嚴重的鼠害損失,預防難度較大。

要減少壞糧風險,確保玉米源食品和飼料安全,需要在玉米儲存階段采取有效措施,預防控制真菌污染[20-21]。玉米儲存應選用具有防鼠、防霉、通風降水等功能的新型儲糧裝具,或設施完備的糧倉;有裂紋或破損的玉米籽粒更易受黃曲霉、寄生曲霉等真菌感染,玉米儲存前要進行篩分處理去除破損粒;實施儲存管理規范,對儲糧倉的衛生進行有效控制,減少交叉污染;定期監控糧溫、濕度、蟲蝕、霉變、異味。鑒于玉米儲戶的儲存設施和條件差,實施規范管理具有一定的挑戰性,不建議儲戶長期儲存玉米。小飼料廠可以用色選機、玉米比重精選機等去除待儲玉米的不完善粒;完善基礎設施、改善倉儲條件,確保儲糧倉能通風換氣、隔熱防潮,保證儲存玉米的安全。

圖2 玉米水分活度和環境溫度對分離的黃曲霉毒素產生菌生長的綜合影響Fig.2 Combined effects of corn water activity and environmental temperature on the growth of isolated aflatoxigenic fungus

調控因子VeA的N末端序列比對顯示:主要黃曲霉毒素產生菌(黃曲霉和寄生曲霉)的序列相似性高達99%,擬輪枝鐮孢和尖鐮孢的序列相似性高達98%,而兩類菌的序列相似性僅為54%[9]。根據veA基因的特有保守序列,設計黃曲霉和寄生曲霉PCR檢測的特異引物FUA1/FUA2、尖鐮孢和擬輪枝鐮孢PCR檢測的特異引物FUF1/FUF2,對污染玉米分離菌進行PCR檢測。結果顯示玉米污染菌的PCR產物與黃曲霉的PCR產物大小一致,而且污染玉米樣品中檢測到了黃曲霉毒素B1,證明從污染玉米樣品分離到的污染菌是黃曲霉毒素產生菌(黃曲霉和寄生曲霉)。

產毒真菌污染玉米不一定產生毒素,其最佳生長條件與最適產毒條件不完全一致[22]。但是真菌孢子及菌核的毒素含量都高,說明真菌形態發生與毒素產生呈一定正相關性[23],利于形態發生的環境則應利于其產毒,所以玉米污染菌的生長趨勢可用以表征其致毒潛力,控制真菌生長可以有效減少真菌毒素積累。研究證明玉米發生真菌污染不僅取決于玉米籽粒的種類、含水量、破損度等,還與儲存條件(如環境溫度和濕度)和儲存時間相關[2]。鑒于玉米水分活度和環境溫度是影響真菌在玉米上定殖發育的關鍵參數[24],本研究針對黃曲霉毒素產生菌,建立了兩參數相關的污染菌生長預測模型,用以評估儲存玉米在不同玉米水分活度和環境溫度下發生真菌污染的趨勢。

污染菌生長預測模型顯示:如果玉米儲存條件位于-0.7等值線右上側,則污染菌的孢子能萌發、菌絲可生長;隨著儲存時間延長,玉米可能發生腐爛變質。河北地區秋玉米收獲時,環境溫度約20℃,玉米aw>0.84(含水量18%),處于污染菌生長側。因此,新收獲的玉米要及時晾曬至aw<0.84,否則污染菌就可能萌發生長,使玉米霉變。如果玉米儲存條件位于-0.7等值線左下側,污染菌則處于生長的極端脅迫區,其孢子不能萌發、菌絲停止生長。

借助等值圖控制儲存玉米的aw及環境溫度,使黃曲霉毒素主要產生菌生長被抑制,從而實現玉米的安全儲存。玉米儲庫在實施HACCP體系時,用玉米aw或含水量及環境溫度作為關鍵控制參數,借助預測模型建立其控制限值;通過實時監控,預測玉米發生污染的趨勢,確定玉米安全儲存的時間。玉米散儲戶都是常溫儲存,沒有溫控設施,要確保儲存玉米的安全,需根據儲存期間的溫度變化情況,將玉米干燥至真菌的生長臨界aw以下。環境溫度較低,玉米aw可稍高些;環境溫度較高,玉米aw要低一些。如冬儲玉米,環境溫度<15℃,則安全aw可高達0.94(含水量≈24%);夏儲玉米,環境溫度>20℃,則安全aw要降至0.84(含水量≈18%)以下,具體大小根據環境溫度決定。借助預測模型防控玉米的真菌污染,要考慮玉米在儲前(生長、晾曬、干燥)階段是否已染菌。玉米污染菌一旦生長代謝,產生濕熱并向周圍釋放,糧堆內產生局部熱點,進一步促進污染發生。所以與未污染玉米相比,帶菌玉米更易霉變,其含水量和環境溫度應控制得更低,并且只能短期儲存。

玉米發生霉變引起感官性狀變化,通過視覺觀察、觸覺掂摸、嗅覺聞和味覺嘗等分析,觀察儲存玉米有無表面潮潤、發熱、光澤降低、顏色變暗、質地疏松、失重、異味、蟲蝕、毛狀物或孢子產生等現象,作為診斷玉米發生真菌污染的早期癥狀,初步判斷玉米發生霉變的趨勢,以利于玉米儲戶在儲存環境多變的情況下,初步評估玉米發生真菌污染的趨勢,并及時處理或用作它用,減少經濟損失。快速有效地識別可能污染真菌、檢測真菌毒素污染水平,需要設備投資大、檢測費用高,小型玉米儲存企業和農戶難以實施。要確保盈利,需根據環境條件變化,定期觀察玉米感官性狀變化,調整玉米儲存時間,減少儲糧損失是目前可行的方法。

將來應開發真菌毒素快速檢測儀,實現即時檢測。雖然黃曲霉毒素主要由黃曲霉A.flavus和寄生曲霉A.parasiticus產生,近年又發現特異曲霉A.nomius、溜曲霉A.tamari等也產生黃曲霉毒素,而且隨著分子生物技術不斷應用,可能發現更多的黃曲霉毒素產生菌,今后應進一步尋找區分這些菌的實用方法。已知干熱脅迫利于高耐旱真菌(如黃曲霉)成為玉米污染優勢菌,提高玉米的真菌污染敏感性[13],將來需要進一步了解氣候變暖對玉米真菌互作的影響,提高玉米的抗真菌能力,為玉米生產體系的可持續發展提供保障。

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(責任編輯： 田 喆)

DetectionandpreventionofthemainaflatoxigenicAspergilluscontaminationinstoredcorn

Liu Zengran, Zhang Guangyi, Wang Nannan, Xu Man

(CollegeofBioscienceandBioengineering,HebeiUniversityofEconomicsandBusiness,Shijiazhuang050061,China)

Practical methods were developed based on observation of the early signs and symptoms of corn mildew, PCR detection of theAspergillusstrain isolated from the contaminated corn, and establishment of the predictive models for the growth of the isolate under different corn water activities and environmental temperatures. The results indicated that the occurrence of sensory symptoms, such as changes in color and luster, moist feeling over the surface of the corn kernels, and local hot spots in the corn piles, were characterized as the trend of fungal contamination under variable storage conditions. Additionally, PCR assay was carried out using the fungal global regulatorveAas the detective target and a PCR product of the expected size (1.9 kb) was generated, indicating that the isolate isA.flavusorA.parasiticusstrain. Moreover, the predictive models for the growth of the isolate were constructed via fitting the primary Baranyi model to the growth data of the isolate collected under different corn water activities and environmental temperatures, for estimating the maximum colony growth rates of the isolate. The obtained maximum growth rates were then modeled as a function of corn water activity and environmental temperature by using second-order polynomial equation. The developed models indicated that corn water activity and environmental temperature have interactive effects on the growth of the isolate and for corn safety storage, the set critical limits should be away from the growth region. Totally, this research could support the decision-making for corn safety storage, the set and monitoring of the critical limits for corn water activity and environmental temperature, and thus favor to the control of aflatoxin and aflatoxigenicA.flavusorA.parasiticuscontamination in stored corn.

corn; aflatoxin; PCR detection; growth model; sensory change

2017-06-24

2017-07-14

河北省科技計劃項目(15225503D);河北經貿大學科研基金項目(2014KYZ05)

* 通信作者 E-mail:liuzengran@163.com

S 435.13

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.007