利用綠色熒光蛋白GFP研究稻瘟病菌與水稻的互作

許有嬪, 廖海澄, 陳金華, 羅 櫞, 宿 加, 鄒成東,李偉滔, 王 靜, 馬炳田, 賀 閩, 陳學偉

(四川農業大學水稻研究所, 四川省教育廳作物重大病害實驗室, 雜交水稻國家重點實驗室,雜交水稻長江流域協同創新中心, 成都 611130)

利用綠色熒光蛋白GFP研究稻瘟病菌與水稻的互作

許有嬪, 廖海澄, 陳金華, 羅 櫞, 宿 加, 鄒成東,李偉滔, 王 靜, 馬炳田, 賀 閩*, 陳學偉

(四川農業大學水稻研究所, 四川省教育廳作物重大病害實驗室, 雜交水稻國家重點實驗室,雜交水稻長江流域協同創新中心, 成都 611130)

稻瘟病菌Magnaportheoryzae嚴重威脅水稻的產量與質量,明確稻瘟病菌與水稻互作過程及機理,對防治稻瘟病具有重要意義。本研究利用稻瘟病菌常用致病菌株GUY11和ZB25,構建了綠色熒光蛋白GFP的過量表達菌株,并通過熒光顯微觀察菌株侵染寄主水稻過程中侵染結構的形成與發育,包括孢子萌發、附著胞形成、侵染釘形成、侵染菌絲增殖、壞死斑形成及產孢。另外,通過比較過量表達菌株對稻瘟病高抗水稻和易感水稻的侵染過程,發現侵染過程的差異主要集中于侵染釘的穿透和侵染菌絲的定殖。本研究為分析稻瘟病菌對寄主水稻的定殖規律提供了一種有效工具。

稻瘟病菌; 綠色熒光蛋白; 侵染過程; 水稻

水稻是我國主要糧食作物之一,保障水稻生產安全對我國國民經濟發展至關重要[1]。稻瘟病菌Magnaportheoryzae作為水稻主要病原菌之一,嚴重威脅水稻的產量與質量[2]。培育及種植水稻抗病品種是防治稻瘟病主要措施,但稻瘟病菌生理小種多、繁殖變異快、流行性強,在自然條件下長期種植單一抗性品種易導致新的致病生理小種的累積及流行[3]。稻瘟病菌屬于半活體寄生菌,它在水稻組織內生長繁殖力與其致病性密切相關,實時監測稻瘟病菌在寄主水稻組織內動態生長情況,將有助于揭示稻瘟病菌與水稻之間互作過程,對分析稻瘟病菌致病流行性具有重要意義。

稻瘟病菌是絲狀真菌分子生物學和致病機理研究的模式菌,其侵染寄主水稻過程主要包括接觸、侵入、擴展等階段[4-8]。當前關于稻瘟病菌侵染過程的研究主要使用水稻易感材料,而對于以提高抗病性為目標的水稻抗病育種而言,急需明確稻瘟病菌與抗病品種之間的互作關系。研究病原菌與植物互作的傳統方法有組織印跡法、GUS染色法和放射性標記核酸探針法等,這些非活體檢測相比于活體觀察手段均具有一定局限性[9-13]。來源于水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)具有熒光性質穩定、觀察方便、對細胞無毒害、無物種特異性以及無需底物等優點[13],可用于直觀、實時監測病原菌發生、定殖和侵染過程,目前已成為生物化學和細胞生物學研究的重要分子標記之一[14]。

本研究構建過量表達GFP的ZB25和Guy11轉基因菌株,將過量表達菌株接種水稻葉片或葉鞘后,觀察稻瘟病菌在寄主水稻上侵染器官的發育、侵染菌絲增殖和產孢過程,并比較GFP過量表達菌株在水稻抗感材料上侵染過程的異同。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試劑

稻瘟病菌生理小種Guy11和ZB25、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α菌株、水稻品種‘CO39’、‘地谷’(Digu)、‘麗江新團黑谷’(LTH)均由本實驗室保存,稻瘟病菌的培養、保存及基因組提取參照常規方法[15]。載體TSC13-GFP[16]、pEASY-Blunt-BAR由實驗室保存。pEASY-Blunt載體購于全式金公司(貨號K41009);Taq酶、KOD-Plus-高保真酶購于TOYOBO公司;限制性內切酶購于Fermentas公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit 購于QIAGEN(貨號208054);草銨膦購于Sigma公司(貨號45520);無內毒素質粒提取試劑盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit購于康為世紀生物科技有限公司(貨號CW2104M)。

1.2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體的構建

以Guy11基因組為模板,用引物對RP27pro-For/RP27pro-Rev擴增得到RP27基因啟動子片段,同時使用引物對GFP-RP27-For/GFP-ELO-Rev-SacI,從載體TSC13-GFP中擴增GFP片段,使用引物對RP27pro-For/GFP-ELO-Rev-SacI將兩個片段融合成RP27pro-GFP片段后,克隆至pEASY-Blunt載體,經SacI酶切后,切膠回收2 kb的DNA片段,最后將其連接至真菌篩選載體pEASY-Blunt-BAR的SacI位點,形成終載體pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR,驗證正確后,提取pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR質粒備用。PCR引物序列見表1。

表1本研究所用的引物

Table1Primersusedinthisstudy

引物名稱Primer序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)擴增片段AmpliconRP27pro?ForRP27pro?RevCGAGCTCATAAATGTAGGTATTACCTTTGAAGATTGGGTTCCTACGRP27proGFP?RP27?ForGFP?ELO?Rev?SacICGTAGGAACCCAATCTTCAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGCGAGCTCGTGGAGATGTGGAGTGGGCGCGFPOsUBI＿FOsUBI＿RTTCTGGTCCTTCCACTTTCAGACGATTGATTTAACCAGTCCATGAUbiquitinMoPot2＿FMoPot2＿RACGACCCGTCTTTACTTATTTGGAAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGATMoPot2

1.2.2 PEG介導的原生質體轉化

參照Talbot[17]所述方法進行稻瘟病菌原生質體轉化,并使用草銨膦進行重組菌株的篩選。

1.2.3 過量表達菌株的致病性檢測

采用葉片點滴接種方法檢測稻瘟病菌致病性。制備過量表達菌株的孢子懸浮液,接種于生長4周的易感水稻品種‘CO39’葉片,以接種無菌水的葉片作為陰性對照,置于25℃暗培養1 d后光照培養,5 d后觀察發病情況。

1.2.4 過量表達菌株的熒光顯微鏡觀察

通過河長制管理，全市河道水環境面貌得到較大改觀，各級領導重視程度得到明顯提高，公眾保護水環境的意識得到大幅度增強，河道水環境面貌得到明顯改善。2013年，全市納管河道環境衛生達到優秀的河道長度由1 338.5km增加到1 616.2km，同比上升20.75%；感官水質黑臭的河道長度由332.68km減少到275.92km，同比下降17.06%。全市河道劣V類水質的比例由85%下降到62%，全市河道水質總體實現好轉。

制備過量表達菌株孢子懸浮液,參照文獻報道方法[18]接種水稻葉片或葉鞘,通過熒光顯微鏡觀察稻瘟病菌侵染過程。

1.2.5 水稻組織內稻瘟病菌生長量的定量PCR檢測

采用文獻報道方法定量檢測侵染水稻葉片中的稻瘟病菌生物量[19],對侵染之后的水稻葉片,用CTAB法提取基因組DNA,再以稻瘟病菌的一段倒位重復序列MoPot2為擴增靶標、水稻基因Ubiquitin作為均一化內參基因,進行定量PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR融合表達載體的構建

稻瘟病菌核糖體蛋白27(ribosomal protein 27)的編碼基因RP27具有組成型高表達特點[18]。本研究利用該基因啟動子來調控綠色熒光蛋白GFP的表達。參照材料與方法中所述方法構建并獲得了稻瘟病菌GFP過量表達載體pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR(圖1)。載體圖譜詳見圖2。

圖1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體構建Fig.1 Construction of the vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

圖2 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體圖譜Fig.2 Restriction map of vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

2.2 GFP過量表達菌株的遺傳轉化及篩選

Guy11為國際通用的稻瘟病菌標準菌株,它具有較強致病性,廣泛用于稻瘟病菌致病機理研究[20],而ZB25是根據我國7個常規水稻稻瘟病鑒定品種而鑒別出的一個強致病性菌株[21]。本文以這兩個菌株為材料構建了表達pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR載體的重組菌株。對轉化獲得的過量表達菌株Guy11-GFPox、ZB25-GFPox進行熒光顯微鏡觀察,發現在營養菌絲(圖3a)及孢子細胞(圖3b)中均能觀察到較強綠色熒光,說明GFP過量表達元件已在稻瘟病菌中穩定整合并表達。

2.3 過量表達菌株的生長及致病力檢測

為分析GFP基因的轉入是否影響稻瘟病菌營養生長及產孢,將野生型菌株和過量表達菌株接種于CM培養基,培養10 d后測量菌落直徑及產孢量,發現過量表達菌株具有與野生型菌株一致的營養生長及產孢量(圖4),這表明GFP基因的轉入不影響稻瘟病菌的生長及產孢。

圖3 GFP過量表達菌株的熒光分析Fig.3 Epifluorescent analysis of the Magnaporthe oryzae transformants overexpressing GFP

圖4 GFP過表達菌株在CM瓊脂平板上的菌絲生長及產孢Fig.4 Mycelial growth and sporulation of the transformants overexpressing GFP on CM media

菌株致病性分析結果表明,過量表達菌株及野生型菌株在葉片上產生的病斑大小之間無差異(圖5a)。此外,定量PCR檢測感病葉片中真菌生長量,發現過量表達菌株與野生型菌株在葉片中的定殖與侵染能力無差異(圖5b，c)。上述結果表明GFP基因的轉入不影響稻瘟病菌致病力。

圖5 稻瘟病菌的致病力分析Fig.5 Pathogenicity of Magnaporthe oryzae

2.4 過量表達菌株侵染生活史的熒光顯微觀察

為分析稻瘟病菌侵染水稻過程,將易感水稻‘CO39’葉片接種過量表達菌株并進行熒光顯微觀察。結果表明,侵染0 h時,過量表達菌株Guy11-GFPox與ZB25-GFPox的分生孢子可黏附于水稻葉片;侵染3 h后,這兩個過量表達菌株分生孢子均可萌發出芽管;隨著時間推移,芽管不斷延伸,并在芽管頂端膨大,分化形成侵染器官附著胞;15 h時,附著胞分化成熟,形成了黑色素(圖6)。此外,葉片侵染6 d后,在離侵染點較遠的葉片內未出現侵染菌絲,而在葉脈內已出現許多侵染菌絲(圖7),這表明稻瘟病菌在水稻葉片中定殖時可能優先沿葉脈擴展;還發現葉片上侵染位點附近的部位極易形成水浸狀斑點,并且該斑點在侵染菌絲還沒擴展到的地方就已形成(圖7)。

圖6 熒光顯微觀察稻瘟病菌侵染水稻葉片的過程Fig.6 Epifluorescent microscopy examination of the life cycle of Magnaporthe oryzae invading rice leaves

圖7 GFP過量表達菌株侵染水稻葉片后的病斑觀察Fig.7 Rice leaves infected with the GFP overexpressing strain

為進一步分析稻瘟病菌在水稻組織內的生長定殖情況,本研究采用透明的水稻葉鞘作為侵染材料,來觀察侵染釘及侵染菌絲在水稻組織中的生長。熒光顯微觀察表明,侵染24 h之內,稻瘟病菌在葉鞘與葉片上的孢子萌發和附著胞形成過程相一致;侵染24 h之后,葉鞘內可見附著胞已分化形成侵染釘,并且侵染釘在植物細胞內形成多重分支的次生侵染菌絲;侵染48 h后侵染菌絲大量擴增,已占據多個植物細胞(圖8)。葉片侵染5～6 d后形成壞死斑,并在病斑處產生分生孢子梗及侵染單元分生孢子(圖6)。因此,GFP過量表達菌株可用于熒光觀察稻瘟病菌侵染循環各個階段的發育結構,包括分生孢子附著于寄主表面(圖9a)、分生孢子萌發及附著胞的產生(圖9b)、侵染釘的形成(圖9c)、侵染菌絲的產生(圖9d)、葉片病斑形成(圖9e)及病斑處產孢結構(圖9f)。

圖8 熒光分析水稻葉鞘中稻瘟病菌的附著胞和侵染菌絲的發育Fig.8 Epifluorescent analysis of the development of appressorium and infectious hyphae of Magnaporthe oryzae in rice sheathes

圖9 稻瘟病菌侵染循環Fig.9 Infection cycle of Magnaporthe oryzae

2.5 過量表達菌株對感病和抗病水稻品種的侵染過程觀察

目前已有大量報道闡述稻瘟病菌對親和性易感水稻的侵染過程[4, 7, 22],但有關稻瘟病菌與非親和性高抗水稻之間的互作過程還不是十分清楚。為分析稻瘟病菌在親和與非親和水稻品種侵染過程之間的差異,我們以易感水稻品種‘麗江新團黑谷’(LTH)和高抗水稻品種‘地谷’(Digu)為材料,比較了過量表達菌株Guy11-GFPox對兩者的侵染過程。結果表明,侵染5 h時,兩個水稻品種上均可觀察到分生孢子萌發形成附著胞(圖10);16 h時,兩種水稻葉片及葉鞘上的附著胞均可分化成熟并黑色素化(圖10)。這表明稻瘟病菌侵染易感和高抗水稻品種時,在穿透植物表皮之前的發育過程沒有明顯差異。

圖10 GFP過量表達菌株對感病和抗病水稻材料的侵染過程觀察Fig.10 Infection processes of GFP overexpression strain in susceptible and resistant rice

侵染葉鞘至24 h時,易感水稻‘麗江新團黑谷’葉鞘中大部分附著胞產生侵染釘,刺破水稻表皮而使侵染菌絲進入植物內部組織細胞,但在高抗水稻‘地谷’葉鞘中,只有極少數附著胞可形成侵染釘;36 h時,易感水稻中侵染菌絲已占滿初次侵染的植物細胞,并侵入臨近植物細胞,而在高抗水稻中僅見極短的侵染菌絲,而且侵染菌絲不能在高抗水稻細胞內擴增(圖10a)。上述結果表明,稻瘟病菌對易感和高抗水稻侵染過程的差異主要集中于侵染釘的穿透和侵染菌絲的增殖。

3 討論

建立對稻瘟病菌生理小種的快速準確示蹤方法,了解稻瘟病菌侵染過程及規律,將有利于水稻抗病品種的篩選和抗病性監測[23]。GFP具有熒光性質穩定、觀察方便、無毒害等優點,將其作為報告基因,應用十分廣泛。本研究構建了過量表達GFP的稻瘟病菌重組菌株,并利用過量表達菌株觀察了稻瘟病菌對水稻的動態侵染過程,發現侵染水稻時,稻瘟病菌經歷孢子附著、萌發、分化附著胞、形成侵染釘及侵染菌絲、分化產生分生孢子梗和孢子(圖6～9),這一侵染過程與前人報道的稻瘟病菌在水稻組織中的黏附[24]、萌發、穿透[25]、定殖[26]過程相一致。本研究豐富了GFP標記在稻瘟病菌研究中的應用,為進一步分析稻瘟病菌在水稻中定殖、擴展規律,揭示稻瘟病菌的生物學特性與病害發生之間的關系提供了一種有效的示蹤手段。

本研究發現稻瘟病菌侵染水稻表皮早期發育過程,包括分生孢子萌發、芽管形成、附著胞發育及成熟,在水稻抗感材料上沒有明顯差異。但在穿透及定殖植物表皮階段,稻瘟病菌可穿透易感水稻表皮并大量增殖,但對高抗水稻的穿透增殖能力卻顯著受到抑制(圖10)。這表明,抗病品種對稻瘟病菌的防衛反應主要針對附著胞穿透和侵染菌絲定殖生長,這與Li等[27]的研究中提到抗病水稻可識別早期的附著胞發育,并啟動防衛反應的論述一致。抗病材料中含有相應抗性基因,當受到病原菌侵染后,水稻啟動抗性基因的表達,以抵御病原菌的入侵。

本研究還發現稻瘟病菌在水稻葉片中優先選擇葉脈處擴展增殖(圖7),而且葉片侵染位點的組織周圍易形成水浸狀病斑(圖7)。稻瘟病菌定殖植物組織時,其生長依賴于宿主產生的營養物質。我們推測稻瘟病菌沿著植物運輸通道葉脈生長,可能更有利于獲取營養。此外,前人研究表明[28],稻瘟病菌在水稻組織細胞中分泌BAS1和BAS4等多種效應蛋白,以調控宿主細胞免疫反應。本研究觀察到侵染葉片上形成水浸狀病斑,其原因可能是侵染菌絲生長過程中所分泌的效應蛋白影響了宿主的免疫力,從而以水浸狀斑點表現出來。后續研究解析稻瘟病菌如何調控水稻免疫力及致病過程,將有助于深化對稻瘟病菌與水稻分子互作機理的認識。

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(責任編輯： 田 喆)

FluorescentmicroscopicanalysisoftheplantinfectionprocessofMagnaportheoryzaeusinggreenfluorescentprotein

Xu Youpin, Liao Haicheng, Chen Jinhua, Luo Yuan, Su Jia, Zou Chengdong,Li Weitao, Wang Jing, Ma Bingtian, He Min, Chen Xuewei

(CollaborativeInnovationCenterforHybridRiceinYangtzeRiverBasin,StateKeyLaboratoryofHybridRice,KeyLaboratoryofMajorCropDiseasesofSichuanDepartmentofEducation,RiceResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Blast disease caused by the fungusMagnaportheoryzaeleads to tremendous loss in production and quality of rice worldwide. To effectively control rice blast disease, we need to understand the infection process and pathogenic mechanism ofM.oryzae. Green fluorescent protein (GFP) has been widely used as a labelling tool in life science research. Here we report the construction of a vector overexpressing GFP and the successful introduction of the vector into two commonly usedM.oryzaestrains Guy11 and ZB25. By using the resulting fungal transformants overexpressing GFP, we observed the successional and dynamic plant infection processes byM.oryzaeincluding conidial germination, germ tube elongation, formation of an appressorium and penetration peg, proliferation of infection hyphae within the rice tissue, appearance of blast lesion, development of conidiophore and production of conidia at the blast lesion. We also compared the infection processes ofM.oryzaebetween interactions with compatible rice host and incompatible host, and found thatM.oryzaeunderwent normal appressorium on both rice hosts. After the formation of appressorium,M.oryzaewas able to develop penetration peg and invasive hyphae within rice tissue in a compatible interaction, but lost these abilities in an incompatible interaction. Our study proves that theM.oryzaeexpressing GFP facilitates our observation of the processes ofM.oryzaeinfection on rice plant, thus providing an effective tool for examination of pathogen-plant interaction.

Magnaportheoryzae; green fluorescent protein (GFP); infection process; rice

2017-02-24

2017-03-29

國家自然科學基金(31301626);四川省科技廳國際合作項目(2014HH0066);國家轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800903B,2016ZX08001002)

* 通信作者 E-mail:cqhemin_1983@163.com

S 435.111.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.008