谷胱甘肽S-轉移酶基因在B型煙粉虱寄主轉換中的差異比較

何 超, 謝 文, 張友軍*

(1.湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 中國農業科學院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

谷胱甘肽S-轉移酶基因在B型煙粉虱寄主轉換中的差異比較

何 超1,2, 謝 文2, 張友軍2*

(1.湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 中國農業科學院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

煙粉虱是一種世界性的重大農業害蟲,其寄主范圍十分廣泛,對農作物危害嚴重。為研究GST基因家族在B型煙粉虱寄主轉換中的響應機制,本文首先通過分析B型煙粉虱寄主轉換后,23個GST基因表達量的變化,然后利用轉錄組數據、PCR、克隆、測序得到GST7基因全長,最后對GST7基因進行生物信息學分析。結果表明:煙粉虱GST7和GST13在辣椒寄主上的表達量與在原始寄主棉花上有顯著差異,且GST7表達量上升了2.31倍;生物信息學分析結果顯示GST7基因的開放閱讀框全長657 bp,編碼219個氨基酸,沒有信號肽,沒有跨膜結構,理論等電點pI為4.81,其分子量為25.07 kD,系統發育樹分析表明GST7基因屬于Delta亞家族。本研究發現GST7基因在煙粉虱適應不適寄主植物中起到一定作用,為將來RNAi研究GST7基因的功能奠定了基礎。

煙粉虱; 基因克隆; 序列分析

煙粉虱Bemisatabaci(Gennadius)屬于半翅目,粉虱科,小粉虱屬,是一種世界性的農業害蟲,對農業生產造成了巨大的損失[1]。煙粉虱主要是通過刺吸寄主植物韌皮部、分泌蜜露、傳播植物型病毒對農作物造成危害[2-3]。煙粉虱是一個復合種,現在已經報道的至少有36個隱種,而且其寄主范圍非常廣泛,可以取食900多種植物[4-7]。Middle East-Asia Minor1(B型)和Mediterranean(Q型)是入侵性最強和危害農作物最嚴重的2個煙粉虱隱種。20世紀90年代末,B型煙粉虱在我國被發現,并成為危害我國很多經濟作物的主要害蟲[8-10]。煙粉虱在不同寄主植物上適合度差異很大,很可能與煙粉虱對不同植物的次生代謝產物的耐受性有關,很多研究是從昆蟲三大解毒酶(P450、GST、CCE)的生化和分子響應為切入點而開展工作[11-13]。如2008年,安志蘭測定了B型煙粉虱(羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶)在棉花、一品紅、茄子和番茄4種寄主植物上的酶活力,結果表明B型煙粉虱茄子種群谷胱甘肽S-轉移酶活性最高[14];2009年,宋月芹通過離體酶活性測定表明甜菜夜蛾取食寄主植物后,體內磷酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和乙酰膽堿酯酶活性均發生變化[15];2014年,Mohammed Shabab報道GST16參與了植物生長素的解毒[16]。然而,目前還沒有通過熒光定量PCR的方法分析煙粉虱在寄主轉換中GST基因mRNA表達量的變化報道。

谷胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transferases,GSTs)是一種多功能氧化酶,通過三肽谷胱甘肽(tri-peptide glutathione,GSH)與底物相結合,增加產物的溶解性,從而更好地排出體外,降低有毒物質對生物體產生的影響[17-18]。B型煙粉虱能在甘藍上很好地生長,而辣椒是一種不適宜的寄主[19]。對于這種現象,GSTs是否在其中起到關鍵作用還未見報道。本文通過分析B型煙粉虱在3種不同寄主(棉花、辣椒、甘藍)上23個GSTs基因表達量差異,進一步通過生物信息學方法和原核表達的方法來確定是否GST7在B型煙粉虱寄主適應性中起到了一定的作用,為以后進一步研究GSTs與煙粉虱寄主適應性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

B型煙粉虱為2004年采自中國農業科學院蔬菜花卉研究所北圃場基地的甘藍(‘京豐1號’)上,后轉移到棉花(‘中棉49’)上長期飼養,室內連續飼養超過150代,期間從未接觸過任何化學農藥,煙粉虱在L∥D=14 h∥10 h光周期、溫度為24～26℃、相對濕度50%～70%的條件下繼代飼養;每2～3個月檢測一次,看是否被其他煙粉虱污染。試驗中用到的寄主植物棉花(‘中棉49’)、甘藍、辣椒(‘中椒4’)單獨種在12 cm的營養缽里面,選擇大小基本一致(高30 cm)的植株進行試驗。

1.2 主要試劑

Trizol試劑(Trizol Reagent,北京生化科技有限公司);DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit北京全式金生物技術有限公司);反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa);TaqQ5酶(New England Biolabs);載體T1(北京全式金生物技術有限公司);感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司);實時熒光定量PCR試劑(TransStart Green QpcrSupermix UDG,北京全式金生物技術有限公司);SDS-PAGE(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.3 B型煙粉虱在3種不同寄主上轉換

隨機挑選大小相似的棉花、甘藍、辣椒植株放在無蟲籠中(60 cm×60 cm×60 cm),一共9個無蟲籠,每個無蟲籠里放一株植株,棉花、甘藍、辣椒3種寄主各3個重復;試驗中B型煙粉虱都來源于棉花蟲源,每次從棉花上取100頭不分性別的煙粉虱成蟲放到一個無蟲籠中,直到9個無蟲籠都有煙粉虱,釋放煙粉虱時,讓煙粉虱自然飛到寄主上,煙粉虱取食48 h后,收集試蟲立即放入液氮中,-80℃保存,供后續RNA提取。

1.4 煙粉虱總RNA的提取、cDNA的合成以及熒光定量PCR

RNA抽提采用Trizol方法,首先將已經收集好的試蟲(每個重復大約70頭)放入勻漿器中再加入1 mL Trizol快速研磨,然后用氯仿去除蛋白質等雜質,用75%乙醇洗滌,最后用無RNA酶的水進行溶解。對提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測其完整性,選取OD260/OD280值在2.0附近的RNA用DNA酶(TaKaRa,Japan)處理以去除包含的基因組DNA,再進行第一鏈和第二鏈cDNA的合成(Prime Script first-strand cDNA synthesis kit,TaKaRa, Japan),cDNA定量到1 μg,于-20℃保存備用。

熒光定量PCR引物參照表1,熒光定量PCR反應體系是:1 μL cDNA,10 μL TransStart?Green qPCR SuperMix UDG (TransGen, China),引物0.4 μL,加超純水至20 μL。Real-time PCR的反應程序為94℃預變性600 s, 接下來40個循環 95℃變性5 s,60℃退火 15 s,72℃延伸34 s(收集熒光信號);無RNA酶和無cDNA模板對照分別為了檢驗試驗中是否有基因組DNA的污染和引物二聚體的存在,以保證引物的擴增效率;相對定量的分析方法采用2-△△Ct[20],選用HSP90和RPL29作為內參基因[21]。

表1熒光定量PCR所用GSTs基因及引物信息

Table1GeneandprimerofGSTsforreal-timePCR

基因Gene正向引物(5′?3′)Forwardprimer(5′?3′)反向引物(5′?3′)Reverseprimer(5′?3′)大小/bpLength基因登錄號Accessionno．GST1TCTTTCCTCAAAATGAACCCGCATTCTTGTTTTTGCCGTATTTGTTGG119MF036015GST2GGCAAGGAAGACTCTCAATACCCAGTCACCGAACCGCTGGTAGAGT103MF036016GST3CAGGTCCTAAGTTCACACTGGCGCATTTTCTGGCTTCGGTCGGA125MF036017GST4AAGGCCACGATGAGGTGAAATCACGAGTGCAACATCAGCT123MF036018GST5ACCTGGCCAACGAGTACATGCACCTGCAAACATGAACGGG150MF036019GST6GGTGGACCAAGCACTGGATTTTAGATTTAGACACTTTTTGGAACCG124MF036020GST7TTGCCTCTCGGTTGTCTTGCTCGAATCCGCTGTCGTCCAAAC149MF036021GST8AGCAGGGATGACCTTCACGATAGTCTCTGCTTTGATTAAACCACCT123MF036022GST9CGAAAGGAGAACAAATGACCCCATGATGGCACGACTCTCTGTTAGA106MF036023GST10TGGTGATTTACCCGTAGACGAGGACCACGAGAGTGACATCAGCAACA131MF036024GST11GACAATGGGTTCTACCTGTGGGACGATTGCTCGTTTTTTAGGGTCT109MF036025GST12CCGCAAAACTGATTGGTGTGGTTGGAACCGTGTGCTGTGGATT108MF036026GST13ACTTCCCCATCCGAGGTCTTGAAGGGCGTGGTTGGCTTTATT121MF036027GST14ATGCCAAAAAATGTGGTCTCGTAAATAGGTTGAAATAGCTTGACGC106MF036028GST15CCGCAATGAAACCAAAAACTCCTTTTCCCAGTCATCTTCGCCAG136MF036029GST16GCGACTGGAGAAGCAAGTGAAAGGGGTGTTTTTCCTCCACGGTAAG135MF036030GST17TTGAAAGGTGCTGGCGAAACAACCATCAACTTCCAAAACGGG147MF036031GST18GTCGTTCATCAATCGCTGGCGTTCTTGGTGGTAGGCCCTC148MF036032GST19GCGGTATTCAGCCATTACAAAACGTATCTCCGAAGCAGTACTTCCCTG150MF036035GST20GCACTGGATTCAAAGAGGGCTTGGAATCTGCGAGCACTGAAG135MF036033GST21AGTTTCCTGCTGGCACTGTTCCTAAGGGGGTCAGATGAGTGTAGGC125MF036034GST22GAAGGGCTCACCAGAACGATGTGTGAACTATGCGCGCAAT136MF036036GST23CGAAGGGCTCATCTCAACGATGTGTGGAGGTATCGGGCTA138MF036037RPL29TCGGAAAATTACCGTGAGGAACTTGTGATCTACTCCTCTCGTG144HSP90ATCGCCAAATCTGGAACTAAAGCGTGTTTTGAGACGACTGTGACGGT135

1.5 基因的克隆與序列分析

采用上述合成的cDNA為模板,利用特異性引物GST7-F:ATGGATTTGTACTACTATC和GST7-R:AATTAGCTGACATCAATGGCTAA擴增GST7的全長。反應體系為:cDNA模板1 μL,5×PCR buffer 5 μL,dNTP 0.5 μL上下游引物各1.25 μL,Q5 DNA聚合酶0.25 μL,然后超純水補足25 μL,PCR擴增條件:98℃預變性30 s;98℃10 s,60℃退火25 s,72℃延伸30 s, 35個循環;最后總延伸2 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后膠回收目的片段,回收的擴增片段連接到T1載體上(按照說明書操作)再轉化到感受態大腸桿菌中,經過藍白斑與抗生素篩選,隨機挑取多個白色菌落擴大培養,選取PCR鑒定呈陽性的克隆菌液送至北京擎科生物技術有限公司進行測序分析。得到序列后,利用DNAMAN6進行序列的比對,采用ExPAsyProtemics Server(http:∥cn.expasy.org/tools/pi_tool.ttml)預測蛋白質的理化性質。用SignalP 4.1 軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預測,跨膜結構域的預測利用TMHMN2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/),采用MEGA6.0軟件鄰接法(Neighbor-joining)構建系統發育樹,各分支均進行1 000次重復檢驗,基因結構圖通過BLASTN比對B型煙粉虱基因組(http:∥www.whiteflygenomics.org/cgi-bin/bta/index.cgi)。

1.6 數據分析

各個寄主處理間,GSTs基因mRNA表達量差異采用單因素方差分析(ANOVA),平均數的多重比較采用圖基檢測(Tukey test),顯著性水平P<0.05,數據處理軟件為SPSS19.0。

2 結果與分析

2.1 GSTs基因在各寄主上表達量的變化

熒光定量PCR結果表明:GST7、GST13、GST10和GST18在辣椒、甘藍寄主上的表達量相對于棉花寄主有顯著差異,其中GST7表達量上升了2.31倍,GST13下降了60%,GST10和GST18分別下降了55%和0.53%,GST14則升高了1.52倍(圖1)。

圖1 23個GST基因在3種寄主上的表達量差異Fig.1 Expression levels of 23 GST genes in three hosts

2.2 B型煙粉虱GST7全長序列分析

GST7基因ORF序列長657 bp,編碼219個氨基酸(圖2a、b);進一步通過生物信息學分析發現,GST7沒有信號肽,沒有跨膜結構,理論等電點pI為4.81,其分子量為25.07 kD;另外,通過比對B型煙粉虱基因組序列,發現GST7基因在Scaffold 147上,有5個外顯子,4個內含子,內含子大小分別為:1 693、1 119、1 321、552 bp(圖2C)。

圖2 GST7的序列分析Fig.2 Analysis of GST7 sequence

2.3 煙粉虱GST7基因系統發育樹分析

將GST7推導出來的氨基酸序列與NCBI已公布的其他昆蟲GST序列(果蠅、麗蠅蛹集金小蜂、豌豆長管蚜、長紅錐蝽)進行序列比對,然后用MEGE6.0軟件中的鄰接法進行系統發育樹構建,結果表明,谷胱甘肽S-轉移酶一共有6個亞家族(Delta、Epsilon、Theta、Zeta、Omega、Sigma),B型煙粉虱GST7基因屬于Delta亞家族,與DmGSTd11、RpGSTd1和NvGSTd5聚為一支(圖3)。

3 討論

谷胱甘肽S-轉移酶作為第二階段解毒的關鍵酶,在昆蟲的生長發育中起著關鍵的解毒作用,包括對外源物質、內源物質的解毒,以及保護自身自由基的氧化作用[22-24]。雜食性昆蟲一般會利用自己的解毒系統去適應廣泛的寄主植物,尤其是代謝寄主植物的次生代謝物質[26],且通過特異解毒酶系的改變而與寄主植物相互適應協同進化[27]。煙粉虱寄主非常廣泛,可取食900多種植物[25]。為明確煙粉虱谷胱甘肽S-轉移酶基因家族在煙粉虱寄主適應中尤其是寄主轉換中的作用,本文通過研究B型煙粉虱23個谷胱甘肽S-轉移酶基因表達量在3種寄主中的變化差異,發現煙粉虱GST7和GST13在辣椒這種不適宜寄主上的表達量相對于在原始適宜寄主棉花上的表達量都有顯著差異,且GST7表達量上升了2.31倍(圖1),GST7的誘導表達可能表明GST7基因在B型煙粉虱適應辣椒這種不適宜的寄主過程中會起到一定的作用。一般認為,當昆蟲遇到新的植物次生代謝物質時,昆蟲體內的解毒酶活性會增加以適應不利的環境條件。2011年,周奮啟等通過酶活力的測定表明,取食黃瓜的與取食苘麻、番茄、茄子的B型煙粉虱種群,其谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活力之間存在顯著性差異[29];2015年,Halon利用熒光定量PCR和原核表達等手段研究表明BtGST2在煙粉虱適應寄主中起到關鍵的作用[11];2016年,Zou等報道谷胱甘肽S-轉移酶SlGSTE1可能在寄主適應中起到一定的作用[30],對比本文研究,都表明谷胱甘肽S-轉移酶在昆蟲適應寄主中的次生代謝物質有重要作用。

圖3 B型煙粉虱GST7與其他物種GST基因系統發育進化樹構建分析(鄰接法)Fig.3 Phylogenetic analysis of GST7 in B type of Bemisia tabaci with other insect GST genes based on amino acid sequences (neighbor-joining method)

昆蟲Delta亞家族在面對環境的選擇壓力中扮演著重要的作用[31],讓昆蟲更好地去適應各種寄主植物的次生代謝物質,而本研究發現的煙粉虱最重要的響應誘導基因GST7就屬于昆蟲特有的Delta亞家族(圖3)。

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(責任編輯： 田 喆)

ComparisonoftheresponsesofglutathioneS-transferasegenesinBemisiatabaciBtodifferenthostplanttransfers

He Chao1,2, Xie Wen2, Zhang Youjun2

(1.CollegeofPlantProtectionofHunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.DepartmentofPlantProtection,InstituteofVegetablesandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)

The sweet potato whiteflyBemisiatabaciwith wide host range is an important worldwide agricultural pest, causing serious damage to the crops. In order to study the response of glutathioneS-transferases (GSTs) ofB.tabaciB to host transfer, the expression of 23 GST genes were analyzed and then the transcriptome data, PCR and sequencing were used to get the ORF ofGST7 gene. The bioinformation ofGST7 was also elucidated. The results indicated that the expression levelsGST7 andGST13 had significant difference in pepper compared with that in cotton (up to 2.31-fold forGST7). In addition, bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofGST7 gene was 657 bp, encoding 219 amino acids, and it contained no signal peptide and transmembrane structure. The theoretical isoelectric point (pI) was 4.81 and its molecular weight was 25.07 kD. The phylogenetic tree analysis showed thatGST7 belonged to the Delta subfamily. These results suggest thatGST7 gene may play an important role in host plant adaptation ofB.tabaciB and provide a fundamental study forGST7 gene.

Bemisiatabaci; gene cloning; sequence analysis

2017-01-15

2017-05-12

“十三五”國家重點研發計劃(2016YFD0201000)

* 通信作者 E-mail:zhangyoujun@caas.cn

S 433.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.011