廣東‘鷹嘴蜜桃’上流膠病病原鑒定

凌金鋒, 彭埃天, 殷 瑜, 宋曉兵, 程保平, 崔一平, 陳 霞, 李子力

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640; 2. 華南農業大學農學院, 廣州 510642)

廣東‘鷹嘴蜜桃’上流膠病病原鑒定

凌金鋒1,2, 彭埃天1*, 殷 瑜1, 宋曉兵1, 程保平1, 崔一平1, 陳 霞1, 李子力1

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640; 2. 華南農業大學農學院, 廣州 510642)

‘鷹嘴蜜桃’是廣東的一個特色桃品種,以廣東的連平縣種植面積最大,但自2008年以來,桃樹流膠病嚴重影響當地‘鷹嘴蜜桃’產業的發展,成為桃生產中的一大病害。為明確廣東‘鷹嘴蜜桃’流膠病的病原菌種類,通過病原菌的分離和致病性回接試驗,并采用形態學鑒定方法結合基于rDNA-ITS、β-tubulin和TEF1-α基因序列分析的分子鑒定方法對病原菌進行了鑒定。結果表明,引起廣東‘鷹嘴蜜桃’流膠病的病原菌為Botryosphaeriadothidea(無性態Fusicoccumaesculi)。

鷹嘴蜜桃; 桃樹流膠病; 病原鑒定

桃Prunusperica(L.) Batsch是廣東的一個優稀水果品種,種植面積不大且零散。目前,在廣東省內種植的所有桃類品種中,‘鷹嘴蜜桃’是最好的品種,種植區域主要集中在河源的連平縣和韶關的翁源縣[1-2]。由于政府的大力扶持,‘鷹嘴蜜桃’產業得到了迅速發展。就連平縣而言,該縣于2005年被評為“中國鷹嘴蜜桃之鄉”;2011年,連平‘鷹嘴蜜桃’被評為“嶺南十大佳果”;2015年,連平‘鷹嘴蜜桃’獲得“國家地理標志保護產品”證書,這些榮譽和證書的獲得又對‘鷹嘴蜜桃’產業的發展起到了極大的促進作用。目前該縣‘鷹嘴蜜桃’種植面積已發展到2 797 hm2,是廣東省‘鷹嘴蜜桃’連片種植面積最大的一個山區縣,‘鷹嘴蜜桃’產業也已成為連平縣山區農民脫貧致富的主導產業之一。然而,桃流膠病一直是該縣‘鷹嘴蜜桃’產業發展面臨的一大難題。該病常造成植株樹勢衰弱甚至整株死亡,給果農造成極大損失。為了了解該病的危害情況,本課題組于2008年到連平縣進行了實地調查和病樣采集,對該病大面積發生流行的原因進行了分析,并提出了針對該病的防控建議[3];2010年,本課題組再次到該地調查采樣,并對‘鷹嘴蜜桃’流膠病的病原進行了分離和鑒定,為該病害的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及田間癥狀觀察

分別于2008年9月和2010年8月到廣東省連平縣上坪鎮‘鷹嘴蜜桃’果園調查‘鷹嘴蜜桃’流膠病發病情況,采集病害樣本并對癥狀進行拍照。

1.2 病原菌的分離培養

參照方中達[4]的組織分離法對‘鷹嘴蜜桃’流膠病病枝病健交界處組織進行分離,待長出菌落后根據菌落形態特征將不同分離菌株分別挑出培養并單孢純化,再移植到斜面培養基培養后4℃保存備用。

1.3 病原菌的致病性測定

采用離體接種方法,包括有傷和無傷接種[5-7],并稍作修改。選取當年生健康無癥春梢,先用自來水沖洗干凈,再用70%乙醇進行表面消毒,然后剪成約20 cm長的小段,在中部位置刻去0.1 cm×0.5 cm的表皮,再用已長滿病原菌菌絲的1 cm×5 cm滅菌紗布條包扎傷口,同時設空白對照,然后將枝條基部插入搪瓷盆中已滅菌的濕沙中(另一端用滅菌脫脂棉包扎保濕),最后將整個搪瓷盆裝入封口袋中密封保濕,于26℃培養6 d后觀察發病情況;無傷接種方法同有傷接種方法。

1.4 病原菌的培養性狀及形態特征觀察

將病原菌接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PSA)上,于26℃恒溫培養,觀察記錄菌落、分生孢子等的形態特征,并測量菌落生長速率及分生孢子大小。自然基質上病原菌的形態特征觀察則選取帶有子實體的病部組織進行徒手切片,以水作浮載劑制成臨時玻片,然后在Nikon Eclipse 90i正置熒光電動顯微鏡下進行顯微觀察、測量和拍照,記錄其載孢體、產孢細胞和分生孢子的形態特征。

1.5 病原菌的分子生物學鑒定

1.5.1 病原菌基因組DNA的提取

用解剖刀刮取新鮮菌絲體于2 mL離心管中,加入6個鋼珠(直徑3 mm),再加入800 μL FG1[E.Z.N.A.TMFungal DNA Mini Kit (Omega Biotek)],在室溫下采用MTM-60 Cell Mill(方統生物科技有限公司,Fastwin Bio-tech Co. Limited)(intensity: 99)研磨30 min,其余步驟按試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA,然后將DNA模板置于-20℃保存備用。

1.5.2 病原菌的PCR擴增及測序

以病原菌基因組DNA為模板進行PCR擴增,引物ITS5(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAGG-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3′)[8]用于擴增核榶體基因轉錄間隔區(rDNA-ITS)片段,引物Bt2a(5′-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3′)和Bt2b(5′-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3′)[9]用于擴增β-微管蛋白基因(β-tubulin)片段,引物EF1-728F (5′-CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG-3′)和EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)[10]用于擴增轉錄延伸因子1-α(TEF1-α)片段。

PCR反應體系(50 μL):10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 5 μL,dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL,TaKaRaTaq酶(5 U/μL)0.4 μL,以上試劑均為TaKaRa公司產品,模板DNA 2 μL,引物(英濰捷基(上海)貿易有限公司合成)各2 μL(5 μmol/L),超純水34.6 μL。

反應條件:95℃預變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將含有目的條帶的PCR產物交由英濰捷基(上海)貿易有限公司分別用各基因相對應的PCR擴增引物進行雙向測序。

1.5.3 序列比對及系統發育分析

將獲得的病原菌rDNA-ITS、β-tubulin、TEF1-α序列提交到GenBank,并與GenBank中的DNA序列進行同源性比較分析,下載相關序列及其模式菌株序列,以Macrophominaphaseolina為外群,用MEGA 6.0軟件[11]進行比對,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育進化樹,以自展法(bootstrap)進行檢測,重復1 000次并計算NJ系統發育進化樹內每個分支的bootstrap值。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

該病既可危害實生苗、嫁接苗,也可危害成年結果桃樹主干和側枝。發病初期枝干表面形成近圓形褐色病斑,略凹陷,后逐漸擴展為圓形、橢圓形、梭形大斑,或發展成隆起的小皰斑,在水分充足特別是持續陰雨時,病斑皮層易開裂,流出淡黃色透明黏稠膠液,凝結氧化后逐漸變成茶褐色或黑褐色凝膠。發病嚴重時,病斑擴大連成片,當病斑環繞枝干一周時,病部以上枝干生長逐漸衰弱,最后枯死(圖1a～c)。解剖病部,病部皮層變褐壞死,可深達木質部。

2.2 病原菌的分離及致病性測定

兩次采樣組織分離結果表明,依據菌落形態特征可將分離到的菌株劃分為7個類群,分屬于葡萄座腔菌屬Botryosphaeriasp.、擬莖點霉屬Phomopsissp.、鐮刀菌屬Fusariumspp.、鏈格孢屬真菌Alternariaspp.和炭疽菌屬Colletotrichumsp.。其中,葡萄座腔菌屬的分離頻率最高。

分別從上述7個菌落類群中各選出一個菌株進行單孢純化,用于致病性接種試驗,接種結果表明,有傷接種6 d后,經Botryosphaeriasp.接種的枝條,接種部位及其周圍的表皮明顯變褐壞死(圖1d),病部木質部也明顯變褐,取病健交界處組織進行再分離,可重新分離獲得與原分離菌株一致的菌株,而對照及其他6個菌株均未表現出任何發病癥狀,也未分離到測試菌株;無傷接種及對照均未發病。根據柯赫氏法則,證明該Botryosphaeriasp.菌株為‘鷹嘴蜜桃’流膠病的病原,菌株編號為LPPG0801。

圖1 ‘鷹嘴蜜桃’流膠病癥狀及菌株LPPG0801的致病性測定Fig.1 Symptoms of ‘Yingzuimitao’ peach tree gummosis and pathogenicity test of isolate LPPG0801

2.3 病原菌的培養性狀和形態特征

在PSA培養基上26℃培養4 d后菌落直徑達7.01～7.44 cm,圓形或近圓形,邊緣不規則,中央灰褐色或欖綠色,邊緣白色,菌落背面中央暗褐色,邊緣白色,氣生菌絲棉絮狀(圖2a～b)。菌落上生黑色顆粒狀物,即子座,成熟分生孢子單胞,無色,薄壁,無隔,正直,紡錘形至梭形,具不規則油球,大小為(16～23.5)μm×(5～7)μm,平均(20±1.6)μm×(6.2±0.4)μm,54個分生孢子的95%置信區間為(19.6～20.4)μm×(6.1～6.4)μm,長寬比為3.2±0.26(平均值±標準差),95%置信區間為3.1～3.3。

在自然基質上,載孢體埋生于表皮下,后突破表皮外露,為真子座,暗褐色至黑色,單腔室至多腔室,腔壁黑褐色、革質,向內側漸呈無色(圖2c～d);分生孢子梗缺或不明顯,無色,基部不分枝,圓柱形;產孢細胞全壁芽生式產孢,無色,圓柱形或瓶梗形(圖2e);分生孢子單胞,無色,薄壁,無隔,正直,紡錘形至梭形,具不規則油球,大小為(20.5～30)μm×(5.5～7.5)μm,平均(26.5±2.1)μm×(6.4±0.5)μm,50個分生孢子的95%置信區間為(25.9～27.1)μm×(6.3～6.5)μm,長寬比為4.2±0.37(平均值±標準差),95%置信區間為4.1～4.3(圖2f),較PSA培養基上形成的分生孢子略大。

在自然條件和人工培養基上均未發現有性型。根據病原菌的培養性狀和形態特征,參考以往文獻對該菌描述[12-14],初步鑒定此病原菌為Fusicoccumaesculi。

圖2 ‘鷹嘴蜜桃’流膠病病原的菌落及形態特征Fig.2 Colonies and morphological characteristics of the pathogen causing ‘Yingzuimitao’ peach tree gummosis

2.4 分子生物學鑒定

為進一步明確該病原種類,對病原菌株的rDNA-ITS、β-tubulin和TEF1-α基因進行擴增并測序,分別得到581、439和300 bp的基因片段,將所得序列提交到NCBI的GenBank 數據庫中,獲得序列登錄號分別為KU928258、KU928260和KU928259,并與數據庫中的已知序列進行同源性比對,初步確定歸屬,并下載同源性較高的相關序列,與本研究供試菌株共同構建系統發育樹(圖3)。圖3表明,供試菌株LPPG0801與B.dothidea和Dichomerasaubinetii處于同一分支,但本研究未見菌株LPPG0801產生Dichomera型分生孢子,因此將該菌株鑒定為B.dothidea(無性態F.aesculi)。

圖3 用NJ法基于rDNA-ITS、TEF1-α和β-tubulin基因核苷酸序列構建的系統發育樹Fig.3 The NJ phylogenetic tree obtained from the combined rDNA-ITS, TEF1-α and β-tubulin gene sequence data

3 討論與結論

桃流膠病可分為侵染性流膠病和非侵染性流膠病,但兩種情況常常混合發生。2008年本課題組調查發現,發生于廣東連平的‘鷹嘴蜜桃’流膠病除非侵染性流膠外,還一個重要原因是侵染性流膠[3]。關于侵染性流膠病的病原,國內外已有許多研究報道[15-23]。發生于廣東的桃流膠病病原,已報道的有Leptosphaeriapruni[16]、Cucurbitariasp.[16]、Dothiorellagregaria[17]和B.dothidea(無性態F.aesculi)[20]4種。經形態學鑒定和分子生物學鑒定,確定本研究中引起廣東‘鷹嘴蜜桃’流膠病的病原為B.dothidea(無性態F.aesculi),與李夏等[20]報道的病原一致,但未發現其有性世代。

關于Botryosphaeria真菌的鑒定,傳統的鑒定方法主要是依據無性型的形態學特征,但對于很多Botryosphaeria真菌來說,僅依據這一特征并不能作出準確鑒定,而同時引入多基因系統發育分析,可以有效解決這個問題[24],本研究結果進一步驗證了這一觀點。本研究發現,病原菌在自然基質上形成的分生孢子明顯比在 PSA培養基上形成的分生孢子長,與趙曉軍等[25]的報道一致,但與Slippers等[26]的報道不同,這可能與培養基的不同有關。此外,在依據Phillips等[14]提出的葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae檢索表進行檢索時,在屬級水平可查到Botryosphaeria、Neofusicoccum兩屬,在種級水平可查到B.fusispora、B.dothidea和B.fabicerciana三個種,僅依靠分生孢子長度和長寬比很難確定到種。在進行多基因系統發育分析時,菌株LPPG0801與B.dothidea和D.saubinetii聚為一類,與B.fusispora和B.fabicerciana等明顯處于不同分枝,因此依據分子生物學的鑒定可將菌株LPPG0801鑒定為B.dothidea或D.saubinetii。然而,Dichomera真菌一個明顯的特征是會產生Dichomera型分生孢子[27],而在本研究中未見菌株LPPG0801產生Dichomera型分生孢子,因此排除D.saubinetii而將其鑒定為B.dothidea。由此可見,采用形態學鑒定和分子生物學鑒定相結合的方法能夠有效解決Botryosphaeria真菌中形態相似種難以區分的問題。

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(責任編輯： 田 喆)

Identificationofthepathogencausing‘Yingzuimitao’peachtreegummosisinGuangdongProvince

Ling Jinfeng1,2, Peng Aitian1, Yin Yu1, Song Xiaobing1, Cheng Baoping1, Cui Yiping1, Chen Xia1, Li Zili1

(1.ResearchInstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences;KeyLaboratoryofHigh-TechnologyforPlantProtectionofGuangdongProvince,Guangzhou510640,China; 2.CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)

‘Yingzuimitao’ is a characteristic peach cultivar in Guangdong Province, and Lianping is the largest county in planting area. However, since 2008, the development of ‘Yingzuimitao’ industry in Lianping has been seriously affected by peach tree gummosis, a destructive disease. Through pathogen isolation and pathogenicity test, combining morphological identification with molecular identification based onrDNA-ITS,β-tubulinandTEF1-αgene sequence analysis, the pathogen was identified asFusicoccumaesculi, the anamorph ofBotryosphaeriadothidea.

‘Yingzuimitao’ peach; peach tree gummosis; pathogen identification

2017-01-12

2017-03-23

廣東省現代農業產業技術體系嶺南水果創新團隊建設專項(2016LM1077);廣東省農作物重大病蟲與植物檢疫防控項目(粵農保[2015]10號)

* 通信作者 E-mail: pengait@163.com

S 436.621.19

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.013