我國部分蘋果產區蘋果銹果類病毒的檢測和全序列分析

陳冉冉, 謝吉鵬, 葉 婷, 董云浩, 國立耘, 周 濤

(中國農業大學植物病理學系, 北京 100193)

我國部分蘋果產區蘋果銹果類病毒的檢測和全序列分析

陳冉冉, 謝吉鵬, 葉 婷, 董云浩, 國立耘*, 周 濤*

(中國農業大學植物病理學系, 北京 100193)

近年來,由蘋果銹果類病毒Applescarskinviroid(ASSVd)引起的蘋果花臉病、銹果病在我國一些蘋果產區日趨嚴重,對我國蘋果生產和蘋果產業發展造成嚴重危害。為了解ASSVd在我國一些蘋果產區的發生和變異情況,采用RT-PCR對陜西、山東、山西、河北、北京和黑龍江6個蘋果產區的35份蘋果樣品進行檢測,并克隆獲得30個分離物的基因組全序列,大小為330～333個核苷酸。分析表明,這些分離物的基因組全序列與GenBank中ASSVd基因組核苷酸序列相似度為96%～100%,在蘋果銹果類病毒屬的末端保守區及中央保守區保守,在致病區和左端區域有突變,一些分離物的突變位點相同。系統發育分析表明分離物因相同的突變位點而聚類,而與地理來源無關。

蘋果; 蘋果銹果類病毒; RT-PCR; 變異分析; 系統發育

蘋果是我國重要的栽培果樹,其栽培面積和產量居世界首位[1]。由病毒和類病毒引起的蘋果病害在我國蘋果產區發生普遍,已經成為影響蘋果產量和質量的重要因素[2]。蘋果銹果類病毒Applescarskinviroid(ASSVd)是馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科Pospiviroidae蘋果銹果類病毒屬Apscarviroid成員[3]。1985年我國學者陳煒等在國內首次報道了ASSVd[4]。1987年Hashimoto等發表了ASSVd的基因組全序列[3]。ASSVd基因組為一條環狀的單鏈RNA,全長約330個核苷酸[3],具有5個功能區,形成穩定的桿狀或擬桿狀的二級結構[5]。有研究發現類病毒的保守區域與復制密切相關[6-7],RNA的缺失、插入、替換主要發生在致病區和可變區[8]。關于變異位點對ASSVd致病性的影響尚無明確數據,需進一步研究。目前發現ASSVd可侵染蘋果[9]、梨[10]、桃[11]、杏[12]和野櫻桃[13]等植物。植株一旦感染ASSVd,終生帶毒,果樹幼樹期不出現病癥,結果后病癥顯現,果實的食用價值和商品價值大為降低。

當前我國蘋果產業發展迅速,苗木需求量大,因苗木的調運和無性材料的快繁等因素, ASSVd的發生呈加重趨勢,在蘋果生產中造成的危害日益嚴重[2]。為研究ASSVd在我國一些蘋果產區的發生和變異情況,本文對采自我國6個蘋果產區的35份蘋果樣品進行檢測,克隆得到30個ASSVd分離物的全序列,通過對全序列的比對分析,發現了一些相同的變異位點,為研究ASSVd的變異和進化提供了新的數據。

1 材料和方法

1.1 蘋果樣品

2011年-2016年在陜西、山東、山西、河北、北京和黑龍江的蘋果產區采集有癥狀的蘋果果實樣品和無明顯癥狀的枝條樣品,共35份(表1)。樣品整理后保存于4℃和-20℃。

表1樣品基本信息

Table1Informationofsamples

編號Number采集時間/年-月Samplingtime采集地點Samplingsite品種Variety采樣部位Tissue樣品癥狀表現Symptomonsamplexa?12011-11陜西西安短枝禮富枝條枝條無明顯癥狀(葉片花葉)xa?42011-11陜西西安短枝禮富枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)sxqy?12015-09陜西千陽未知枝條枝條無明顯癥狀sxqy?22015-09陜西千陽未知枝條枝條無明顯癥狀qd?12012-07山東青島SH38枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)qd?22012-07山東青島SH38枝條枝條無明顯癥狀(果實花臉)yt?12012-11山東煙臺富士果實果實花臉qd?32015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?42015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?52015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?62015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?72015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀qd?82015-09山東青島未知枝條枝條無明顯癥狀sx?12016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?52016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?82016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀sx?142016-04山西瑞陽枝條枝條無明顯癥狀hb?32012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?62012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?72012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?82012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀hb?122012-11河北未知(砧木)枝條枝條無明顯癥狀shz2?12012-11北京三合莊富士果實果實花臉cp?12012-11北京昌平富士果實果實銹果cp?22012-11北京昌平富士果實果實花臉mdj?22011-09黑龍江牡丹江金紅123果實果實著色不勻mdj?112011-09黑龍江牡丹江龍豐果實果實著色不勻mdj?122011-09黑龍江牡丹江金紅123果實果實花臉mdj?132011-09黑龍江牡丹江龍冠果實果實畸形592-022015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-032015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-082015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-102015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-202015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀592-222015-11黑龍江牡丹江山丁子枝條枝條無明顯癥狀

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA的提取

取0.1～0.2 g樣品(葉片,枝條韌皮部或果皮)用SiO2吸附法[14]進行植物總RNA提取。提取的RNA直接反轉錄或-80℃保存備用。

1.2.2 RT-PCR檢測

反轉錄體系為20 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、M-MLV(40 U/μL)0.5 μL、RNase inhibitor(40 U/μL)0.5 μL、隨機六聚體引物和Oligo(dT)引物各0.5 μL、植物總RNA 3.5 μL,用DEPC水補足至20 μL,42℃水浴反應1 h,產物直接進行PCR或-20℃保存備用。

參照報道的擴增ASSVd全基因組序列的引物(正向引物:5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′;反向引物:5′-CCTTCGTCGACGACG-ACAGGTGAG-3′)[5]進行PCR。PCR反應體系為25 μL:2.5 mmol /L dNTPs 1.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25 μL,正、反向引物各0.5 μL,反轉錄產物2.0 μL,用ddH2O補足至25 μL。PCR反應循環參數:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,67℃退火30 s,72℃延伸40 s,30個循環;最后72℃延伸10 min。4℃保存。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.2.3 PCR產物克隆和測序分析

在紫外燈下切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠,使用普通DNA凝膠回收試劑盒對擴增產物進行回收純化。將純化的PCR產物連接至克隆載體pMD19-T(simple)上,轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,篩選單菌落于800 μL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的 LB培養基中培養,通過菌液PCR驗證鑒定重組質粒,每個樣品篩選3個陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進行序列測定。

1.2.4 序列比對和系統進化分析

用DNAMAN軟件對所得基因序列進行分析。通過BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對分析目的片段。序列對比運用DNAMAN軟件和Multalin在線軟件[15]進行,以GenBank中ASSVd標準序列(NC_001340.1)為對比序列。進化樹構建運用ClustalX和MEGA 6.06的鄰接法(neighbor-joining)進行,重復次數為1 000,以GenBank中ASBVd(NC_001410)、PSTVd(NC_002030)和ADFVd(NC_003463.1)標準序列作為外組對照,其中ASBVd作為不同科的外組對照,PSTVd作為不同屬的外組對照,ADFVd作為同屬的外組對照。

2 結果與分析

2.1 ASSVd檢測結果

RT-PCR檢測結果表明,從采自陜西的4份樣品(sxqy-1,sxqy-2,xa-1和xa-4),采自山東的8份樣品(qd-1,qd-2,yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7和qd-8),采自河北的5份樣品(hb-3,hb-6,hb-7,hb-8和hb-12),采自北京的3份樣品(shz2-1,cp-1和cp-2)和采自黑龍江的10份樣品(mdj-2,mdj-11,mdj-12,mdj-13,592-02,592-03,592-08,592-10,592-20,592-22)中均檢測到330 bp左右的特異片段,與ASSVd陽性對照樣品檢出的條帶一致,表明樣品被ASSVd侵染。ASSVd的檢測結果如表2所示。

表2RT-PCR檢測蘋果樣品中ASSVd結果

Table2ResultssummaryofdetectionofASSVdinapplesamplesusingRT-PCR

采樣地點Collectionsite檢測樣品數/個NumberofsamplesASSVd陽性樣品數/個Numberofpositivesamples陽性檢出率/%Detectionrate陜西Shaanxi44100山東Shandong9888．9山西Shanxi400河北Hebei55100北京Beijing33100黑龍江Heilongjiang1010100合計Total353085．7

圖1 我國部分蘋果產區30個ASSVd分離物基因組核苷酸序列比對Fig.1 Multiple genome sequences alignment of 30 ASSVd isolates from some apple production areas in China

2.2 ASSVd分離物序列測定與變異分析

將30個樣品的PCR產物克隆測序,結果表明所有片段的長度均為330～333 nt。序列比對結果表明,擴增得到的30個片段與GenBank中ASSVd基因組核苷酸序列一致性為96%～100%,表明這些片段均為ASSVd基因組序列。其中樣品xa-1,xa-4,mdj-2,mdj-11和 mdj-12擴增獲得的ASSVd序列與登錄號為AF421195.1的核苷酸序列一致性均為100%;樣品cp-1,cp-2和shz2-1擴增得到的ASSVd序列與登錄號為AY972082.1的核苷酸序列一致性分別為100%,99%和98%;樣品qd-1,qd-2,hb-6,hb-7和hb-8擴增獲得的ASSVd序列與登錄號為HQ326093.1的核苷酸序列一致性均為99%;樣品qd-3,qd-7,592-02,592-08,592-10,592-20,qd-8和qd-4擴增得到的ASSVd序列與登錄號為KC110860.1的核苷酸序列一致性分別為99%,99%,99%,99%,99%,99%,98%和96%;樣品592-03擴增出的ASSVd序列與登錄號為HQ840722.1的核苷酸序列一致性為98%;從樣品yt-1擴增出的ASSVd序列與登錄號為KC110858.1的核苷酸序列一致性為97%;從樣品mdj-13,592-22和qd-6擴增出的ASSVd序列與登錄號為KU507023.1的核苷酸序列一致性分別為99%,98%和96%;從樣品hb-3,hb-12,sxqy-1和sxqy-2擴增出的ASSVd序列與登錄號為KP765428.1的核苷酸序列一致性分別為98%,98%,97%和97%。以樣品編號命名上述ASSVd分離物。

以GenBank中ASSVd標準序列(NC_001340.1)為對比序列,運用Multalin在線軟件比對所有30個分離物的基因組序列,結果如圖1所示。所有30條序列及ASSVd標準序列(NC_001340.1)在蘋果銹果類病毒屬的末端保守區(TCR)及中央保守區(CCR)兩個保守區保守,只有qd-6分離物在第12位有T-A突變。變異位點集中在致病區(P區)與左末端區(TLR)交界處。進一步分析不同分離物的序列,發現分離物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12與參考序列一致性較高;分離物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22在第39位存在C-A突變,第251位存在G-A突變,第261位和第262位插入T堿基,第267位存在G-A突變,第290位存在G-T突變,第291位存在A-G突變。

2.3 系統進化分析

進化樹分析結果如圖2所示。

圖2 我國部分蘋果產區ASSVd分離物系統進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of genomic sequences of ASSVd isolates from some apple production areas in China

30個分離物按突變位點的不同聚為2組,聚集與地理來源無關。與ASSVd參考序列一致性高的分離物xa-1,xa-4,sxqy-1,sxqy-2,qd-1,qd-2,hb-3,hb-6,hb-7,hb-8,hb-12,cp-1,cp-2,shz2-1,mdj-2,mdj-11和mdj-12聚為一組;分離物yt-1,qd-3,qd-4,qd-6,qd-7,qd-8,mdj-13,509-02,509-03,509-08,509-10,509-20和509-22聚為一組。這些組與外組對照分區明顯。

3 討論

近年來,ASSVd在我國蘋果產區的發生率逐年增加,若不及時、正確地防控,將對我國蘋果產業造成嚴重危害。本研究采集我國6個蘋果產區的疑似被ASSVd侵染的蘋果果實樣品和一些無癥狀的枝條樣品35份,利用RT-PCR方法進行ASSVd檢測,結果表明,采自陜西、山東、河北、北京及黑龍江的蘋果樣品檢測到ASSVd,樣品的陽性檢出率為88.9%～100%。這些數據表明我國一些蘋果產區有ASSVd發生。將來的工作將在更廣地區采集更多樣品進一步調查我國蘋果產區的ASSVd發生情況。

本研究成功克隆了30個ASSVd分離物的基因組全序列,序列比對結果表明這些序列含有相同的保守區域(CCR和TCR)。變異位點集中在致病區域和可變區域,這與之前的研究發現類病毒RNA的缺失、插入、替換主要發生在致病區和可變區的結果一致[8]。關于變異位點對ASSVd致病性的影響尚無明確數據,需進一步研究。進化樹分析表明所有30條ASSVd序列聚集成兩組,并且分離物因相同的變異位點而分組聚類。變異位點分析表明來自同一品種的分離物亦無特異性變異,同一地理來源的分離物無特異性變異,其中黑龍江的‘山丁子’樣品和山東部分樣品存在相同的變異位點,推測這可能與苗木的調運和接穗的隨意嫁接有關。

鑒于ASSVd的發生對我國蘋果生產造成嚴重危害,并有逐年加重的趨勢,應及時采取防控措施,切斷ASSVd傳播源頭,盡早更換病樹。ASSVd的傳播途徑主要有種子[16]、帶毒枝條嫁接以及修剪工具導致的污染傳播[17]。因為目前無有效的防治藥劑,因此防控ASSVd的根本措施應以預防為主,選用無毒苗木。

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(責任編輯： 楊明麗)

DetectionandfullnucleotidesequencesanalysisofApplescarskinviroidisolatesinsomeappleproducingareasofChina

Chen Ranran, Xie Jipeng, Ye Ting, Dong Yunhao, Guo Liyun, Zhou Tao

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

In recent years, dappling, scarring and malformation on apple fruits caused byApplescarskinviroid(ASSVd) is increasing and seriously affects apple production and apple industry development in China. To understand the occurrence and variations of ASSVd in apple production regions of China, 35 samples were collected from six major apple producing areas including Shaanxi, Shandong, Shanxi, Hebei, Beijing and Heilongjiang provinces. Reverse transcription-PCR and sequence analysis showed that 30 isolates of ASSVd were obtained with genome sizes of 330-333 nucleotides, which had 96%-100% identities with sequences of ASSVd in GenBank, and had conserved terminal conserved region (TCR) and central conserved region (CCR). Mutations were found in pathogenic region and terminal left region. Interestingly, same mutation sites were found in some isolates. Phylogenetic analysis showed that these isolates clustered due to mutation sites on ASSVd genome while no relation to geographical origins.

apple;Applescarskinviroid; RT-PCR; variation analysis; phylogenesis

2016-11-22

2017-01-20

國家現代農業(蘋果)產業技術體系(nycytx-08-04-02); 國家公益性行業(農業)科研專項(201203076-02)

* 通信作者 E-mail: ppguo@cau.edu.cn;taozhoucau@cau.edu.cn

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.015