生姜青枯病防治藥劑室內篩選及評價

朱志剛, 胡洪濤*, 石麗橋, 曹春霞, 姚經武, 黃大野, 龍 同, 邱正明, 陳 偉, 楊自文*

(1. 湖北省生物農藥工程研究中心, 武漢 430064; 2. 湖北省農業科學院經濟作物研究所, 武漢 430064)

生姜青枯病防治藥劑室內篩選及評價

朱志剛1, 胡洪濤1*, 石麗橋1, 曹春霞1, 姚經武1, 黃大野1, 龍 同1, 邱正明2, 陳 偉1, 楊自文1*

(1. 湖北省生物農藥工程研究中心, 武漢 430064; 2. 湖北省農業科學院經濟作物研究所, 武漢 430064)

采用比濁法測定了10種藥劑對生姜青枯菌的毒力,結果顯示乳酸環丙沙星、鹽酸環丙沙星、土霉素的毒力最強,其EC50分別為1.75、1.81和2.21 μg/L;而硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、頭孢曲松鈉、中生菌素次之,EC50分別為11.17、11.23、19.23和24.20 μg/L;姜瘟凈、硫酸多黏菌素B和大蒜油的EC50最高,分別為549.61,1 223.22和2 064.33 μg/L。通過盆栽試驗,采用藥劑浸種、先灌藥后接種病原、以及先接種病原后灌藥等處理方式評價了這10種藥劑對生姜青枯病預防和治療的潛能,結果顯示,硫酸鏈霉素和中生菌素浸種處理對生姜青枯病防效最好,分別為93.0%和75.9%;硫酸鏈霉素、硫酸多黏菌素B、姜瘟凈、大蒜油表現出較好的預防作用;除硫酸鏈霉素外,其他藥劑對青枯病治療作用差。

生姜; 姜瘟病; 青枯菌; 藥劑篩選; 硫酸鏈霉素; 大蒜油; 中生菌素

青枯病是世界性重要土傳病害之一,病原為青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum,簡稱青枯菌。該菌通常從根部侵染,然后在維管束大量繁殖、并沿維管束向上傳播,同時分泌多糖等物質,導致維管束堵塞，植株萎蔫死亡。青枯菌可侵染54科450多種植物[1],但以生姜、番茄、馬鈴薯等受害最為嚴重。生姜在我國種植歷史悠久,其根狀莖兼具食用和藥用價值,是老百姓餐桌上重要的調味料,而生姜青枯病在我國河南、山東、安徽、四川、云南、廣西、海南等地區的生姜產區均有發生[2-7],因其發病快、致死率高、無有效防治手段,經常給生姜生產帶來巨大的經濟損失,因而俗稱姜瘟病[2]。通常情況下,病原首先侵染生姜地下肉質莖,致使內部組織逐漸軟化、腐爛,最后僅剩表皮,而葉表現為黃化褪綠,邊緣卷曲、萎蔫,重病田發病率高達70%以上[3]。

生姜青枯病傳播途徑較為復雜[3],主要通過帶菌土壤傳播,此外還可通過雨水、農事操作、土壤中殘存的病殘體等進行擴散。再者,大約2%的留種生姜也帶菌,在次年分種切割時,也可通過刀具傳播。因此,相對而言,生姜青枯病防治難度更大,需要考慮種姜處理和田間防治。青枯病的防治研究已開展多年,防治技術和手段種類較多[8],以化學藥劑,如氯化苦等,進行土壤熏蒸消毒效果最佳[9],但由于熏蒸操作技術復雜、成本高,尚未大規模應用。目前,研究較多的是生物防治,通過田間噴施有益拮抗菌抑制病原菌生長并誘導植株產生抗病性[10-11],但由于防效不穩定,應用范圍受到局限。農業防治,如水旱輪作[12],也可以防治青枯病,但青枯菌在土壤中能存活長達十年之久,短期輪作效果并不理想。實踐中,采用最多的是化學藥劑灌根處理,其中以硫酸鏈霉素應用最廣,但由于其有毒，存在環境和食品安全隱患,在農業上的應用受到極大限制。因此,生產上迫切需要篩選硫酸鏈霉素替代藥劑、研究生姜青枯病的系統防治技術和措施,保證生姜產業健康可持續發展。

本研究通過比濁法測定了姜瘟凈、大蒜油、中生菌素等10種藥劑對生姜青枯菌的毒力,同時,通過盆栽試驗測定了他們在不同處理條件下預防和治療青枯病的潛能,明確姜瘟凈、大蒜油等生物藥劑對生姜青枯病的防治效果,為篩選硫酸鏈霉素替代藥劑、有效防治生姜青枯病奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 生姜青枯菌的制備

生姜青枯菌2016年分離自安徽銅陵生姜青枯病發生田,經測試對生姜致病性強[4]。分離菌株于25%甘油中,-80℃下保存。保存的青枯菌在TTC培養基上活化(28℃),挑取中心粉紅色、周圍白邊的單菌落于SPA液體培養基中,150 r/min、28℃振蕩培養48 h,調整菌液濃度至1×109cfu/mL,備用。

1.2 供試藥劑

硫酸鏈霉素、鹽酸環丙沙星、乳酸環丙沙星、土霉素、硫酸慶大霉素、硫酸多黏菌素B購置于武漢佰銘通科技有限公司,含量均為98%以上;頭孢曲松鈉為華北制藥生產；中生菌素(含量98%)為福建凱立生物制品有限公司生產；大蒜油(含量80%)和姜瘟凈(主要成分為黃芪多糖、小檗堿、紫草素,總含量為2.8%)為濰坊奧豐作物病害防治有限公司生產。

1.3 藥劑對青枯菌毒力測定

用分析天平(PL203,梅特勒-托利多儀器有限公司)分別稱取0.2～5.0 g藥劑,放入裝有玻璃珠的消毒具塞三角瓶(250 mL)中,用無菌水標定總重量至100.0 g,放置于搖床上,振蕩5 min使之完全溶解,成為母液。然后,根據藥劑含量,按照倍比法進行稀釋,使稀釋液濃度在50 000～0.1 μg/L范圍內,分別取1.0 mL稀釋藥液,加入裝有4.0 mL SPA培養基的試管,并加入10 μL青枯菌菌懸液,每個濃度重復3次。以不加藥液的培養基為陰性對照,以不加藥但加青枯菌為陽性對照。所有試管均放置于搖床上振蕩培養(28℃,150 r/min),待陽性對照吸光度值(OD600)為1.2左右時取出,用分光度計(752N,上海精密科學儀器有限公司)測量各藥劑處理吸光度值,計算其抑菌效果。所得數據輸入IBM SPSS Statistics軟件,計算EC50。

抑菌效果(%)=

1.4 藥劑浸種處理對青枯病的防效

健康生姜根狀莖(市購)經25℃催芽處理,待新芽長出2～4 mm,用消毒手術刀,將其按新芽分成小塊,每塊保留1～2個新芽,在藥液(藥液濃度根據前期預備性試驗結果,選取各藥劑防效最好的濃度作為測試濃度,數據沒有在本文顯示)中浸泡30 min,撈出,在陰涼通風處晾干后播入穴盤(21孔),每穴1塊根狀莖,新芽朝上并露出營養基質表面。每處理10塊根狀莖,重復3次,采用無菌水處理作為陰性對照。處理后的穴盤放置于人工溫室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h下培養。待藥劑處理24 h后,將濃度為1×109cfu/mL的青枯菌灌入穴盤,每穴20 mL。接種青枯菌后,每24 h觀測1次,待陽性對照發病率在90%上時,記錄各處理發病株數,計算校正防效,公式如下:

校正防效(%)=

1.5 藥劑灌根處理對青枯病預防效果

將供試藥劑稀釋一定倍數(藥液濃度根據前期預備性試驗結果,選取各藥劑防效最好的濃度作為測試濃度,數據沒有在本文顯示),灌入2～4葉期健康盆栽生姜苗根部,每株20 mL,每處理10株苗,重復3次。將處理后的生姜苗置于人工溫室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h條件下培養。待藥劑處理24 h后,用消毒針在莖基部周邊刺3個微孔,然后將濃度為1×109cfu/mL 青枯菌沿莖基部灌入,每株25 mL。接種青枯菌后,每24 h觀測1次,待對照發病率在90%上時,記錄各處理發病株數,按照1.4公式計算校正防效。

1.6 藥劑灌根處理對青枯病治療效果

選用2～4葉期健康盆栽生姜苗,用消毒針在其莖基部刺3個微孔,然后將濃度為1×109cfu/mL青枯菌沿莖基部灌入,每株25 mL。將處理后的生姜苗置于人工溫室,在(28±2)℃,L∥D=12 h∥12 h條件下培養。接種青枯菌24 h后,分別灌入20 mL所測定藥劑稀釋液(濃度見表3),每處理10株生姜苗,重復3次。處理后,每24 h觀測1次,待對照發病率在90%上時,記錄各處理發病株數,按照1.4公式計算校正防效。

1.7 方差分析

所得數據輸入Excel 2016計算校正防效,然后,使用IBM SPSS Statistics軟件采用Duncan’s方法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 藥劑對生姜青枯菌的毒力測定

采用比濁法,測試了10種藥劑對生姜青枯菌的毒力,結果表明,乳酸環丙沙星、鹽酸環丙沙星和土霉素的EC50分別為1.75、1.81和2.21 μg/L(表1),顯示這3種藥劑對生姜青枯菌的毒力最強;硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、頭孢曲松鈉、中生菌素的毒力次之,EC50分別為11.17、11.23、19.23、24.20 μg/L;姜瘟凈、硫酸多黏菌素B、大蒜油毒力最差,其EC50分別為549.61、1 223.22、2 064.33 μg/L。

表110種藥劑對生姜青枯菌的毒力測定

Table1Toxicityassayof10differentbactericidestoRalstoniasolanacearumonginger

藥劑Bactericide半最大效應濃度/μg·L-1EC50線性回歸方程Linearregressionequation決定系數(R2)Coefficientofdetermination95%置信區間/μg·L-195%Confidencelimits乳酸環丙沙星Ciprofloxacinlactate1．75y=0．2688x-0．25850．90761．44～2．13鹽酸環丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1．81y=0．3129x-0．09610．91190．74～3．47土霉素Oxytetracycline2．21y=0．3107x-0．39000．91651．78～2．75硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate11．17y=0．2005x+0．51360．89779．27～13．59硫酸鏈霉素Streptomycin11．23y=0．2091x-0．18770．92348．80～14．30頭孢曲松鈉Ceftriaxonesodium19．23y=0．2005x+0．51360．899714．17～27．10中生菌素Zhongshengmycin24．20y=0．1792x-0．11980．991019．54～30．23姜瘟凈Jiangwenjing549．61y=0．1853x+0．60270．9620420．49～1177．62硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate1223．22y=0．2759x-0．10230．9551993．64～1859．96大蒜油Garlicoil2064．33y=0．2171x+0．15780．94571739．49～2504．10

2.2 藥劑浸種處理對青枯病的防效

通過藥劑浸種評價了10種藥劑對生姜青枯病的預防能力,在接種青枯菌32 d后,陽性對照死苗率為90%～100%。硫酸鏈霉素和中生菌素對青枯菌預防效果最好,校正防效分別為93.0%和75.9%,但兩者無顯著性差異(P>0.05);硫酸多黏菌素B、頭孢曲松鈉、土霉素、硫酸慶大霉素、姜瘟凈等對青枯菌的預防能力次之,校正防效在20.7%～45.2%之間;乳酸環丙沙星、鹽酸環丙沙星和大蒜油預防能力最差,校正防效在10.4%～17.4%之間(表2)。

表210種藥劑浸種處理對青枯病的防效1)

Table2Controlefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwiltbyrhizomesoaking

藥劑Bactericide濃度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy平均值±標準誤 Average±SE顯著性分析 Statisticalanalysis硫酸鏈霉素Streptomycin1000．093．0±3．53a中生菌素Zhongshengmycin3333．375．9±3．03a硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．345．2±7．76b頭孢曲松鈉Ceftriaxonesodium1000．031．5±7．09b土霉素Oxytetracycline1000．024．4±4．44b硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate1000．024．4±4．44b姜瘟凈Jiangwenjing93．320．7±5．82b乳酸環丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．017．4±3．76c鹽酸環丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．013．7±8．76c大蒜油Garlicoil2666．710．4±5．79c

1) 表中同列字母相同者代表在0.05水平無顯著性差異。下同。

The letters in the same column represent no significant difference at the 0.05 level. The same below.

2.3 藥劑灌根處理對青枯病的預防效果

通過在接種前24 h使用藥劑澆灌2～4葉期生姜苗根部評價10種藥劑預防生姜青枯病的能力,結果見表3。接種青枯菌7 d后,以硫酸鏈霉素防效最好,為56.7%,姜瘟凈、硫酸多黏菌素B、土霉素防效次之,分別為53.3%、50%和40%,但這4種藥劑防效在統計學上無顯著差異(P>0.05);大蒜油防效為36.7%,與姜瘟凈、硫酸多黏菌素B、土霉素防效無顯著差異(P>0.05);中生菌素、硫酸慶大霉素防效分別為30%、23.3%,二者無顯著性差異(P>0.05)。乳酸環丙沙星、頭孢曲松鈉、鹽酸環丙沙星防效最差,分別為13.3%、10%和6.7%。接種10 d后,各藥劑防效均下降,以硫酸鏈霉素處理防效最好,為56.7%,顯著高于其他藥劑(P<0.05)。姜瘟凈、硫酸多黏菌素B、大蒜油防效分別為40%、36.7%、33.3%,它們的防效處于同一水平(P>0.05)。而土霉素、中生菌素、硫酸慶大霉素、鹽酸環丙沙星、乳酸環丙沙星防效最差,在10%～23.3%之間。接種13 d后,各藥劑防效繼續下降,仍以硫酸鏈霉素處理防效最好,為46.7%,顯著高于其他藥劑(P<0.05)。姜瘟凈、硫酸多黏菌素B防效次之,分別為33.3%、26.7%,它們防效處于同一水平(P>0.05)。而大蒜油、土霉素等藥劑防效均低于15%。

表310種藥劑對生姜青枯病預防效果

Table3Preventionefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwilt

藥劑Bactericide濃度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy接種后7d7dafterinoculation接種后10d10dafterinoculation接種后13d13dafterinoculation土霉素Oxytetracycline1000．0(40．0±5．77)abc(23．3±6．67)cd(13．3±6．67)c硫酸鏈霉素Streptomycin1000．0(56．7±3．33)a(56．7±3．33)a(46．7±3．33)a鹽酸環丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．0(6．7±3．33)d(13．3±3．33)d(6．7±3．33)c乳酸環丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．0(13．3±8．82)d (10．0±5．77)d (6．7±3．33)c頭孢曲松鈉Ceftriaxonesodium1000．0(10．0±5．77)d (13．3±6．67)d (10．0±0．00)c硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate1000．0(23．3±3．33)cd(16．7±3．33)d(6．7±3．33)c中生菌素Zhongshengmycin3333．3(30．0±5．77)c(20．0±0．00)cd(13．3±6．67)c硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．3(50．0±5．77)ab(36．7±3．33)b(26．7±3．33)b姜瘟凈Jiangwenjing93．3(53．3±3．33)ab(40．0±5．77)b(33．3±3．33)b大蒜油Garlicoil2666．7(36．7±3．33)bc(33．3±3．33)bc(13．3±3．33)c

2.4 藥劑灌根對青枯病治療效果

通過預先接種青枯菌,24 h后用藥劑灌根,評價藥劑對青枯病的治療效果,結果見表4。接種青枯菌5 d后,以硫酸鏈霉素防效最好,為36.7%,顯著高于其他藥劑(P<0.05)。硫酸多黏菌素B、中生菌素、姜瘟凈、土霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸環丙沙星、乳酸環丙沙星、大蒜油的防效分別為16.7%、13.3%、13.3%、10.0%、10.0%、10.0%、6.7%、6.7%,這6種藥劑防效在統計學上無顯著性差異(P>0.05)。頭孢他啶防效最差,僅為3.3%。接種青枯菌7 d后,各藥劑防效明顯下降,但仍以硫酸鏈霉素防效最好(36.7%),顯著高于其他藥劑(P<0.05)。

表410種藥劑對青枯病的治療效果

Table4Curingefficaciesof10differentbactericidesongingerbacterialwilt

藥劑Bactericide濃度/μg·L-1Concentration校正防效/% Controlefficacy接種后5d 5dafterinoculation接種后7d 7dafterinoculation土霉素Oxytetracycline1000．010．0bc6．7b硫酸鏈霉素Streptomycin1000．036．7a26．7a鹽酸環丙沙星Ciprofloxacinhydrochloride1000．010．0bc3．3b乳酸環丙沙星Ciprofloxacinlactate1000．06．7bc0．0b頭孢曲松鈉Ceftriaxonesodium1000．03．3c0．0b硫酸慶大霉素Gentamycinsulfate1000．010．0bc6．7b中生菌素Zhongshengmycin3333．013．3bc3．3b硫酸多黏菌素BPolymyxinBsulfate3333．016．7bc6．7b姜瘟凈Jiangwenjing93．313．3bc3．3b大蒜油Garlicoil2666．76．7bc3．3b

3 討論

生姜作為特色經濟作物在我國有著悠久的種植歷史，部分品種，如‘銅陵白姜’，由于營養豐富、品質優良，曾列為朝廷貢品[13]。近年來，由于市場需求上升，而產量增加有限，導致供需失衡、價格居高不下。生姜青枯病在生姜種植區普遍發生，成為生姜生產最主要限制因子。盡管針對青枯病，包括番茄青枯病、煙草青枯病等，已開展了大量室內藥劑篩選和田間評價工作[5,9-12,14]，但由于生姜青枯病傳播途徑特殊，對其防治方法和技術措施尚缺乏系統研究。本研究針對生姜青枯病的發生和傳播特點，采用藥劑浸種、灌根后接種青枯菌以及接種后再灌根的方法評價了具有防治青枯病潛能的10種藥劑，旨在為解決生姜青枯病的防治難題提供理論指導和防治依據。

測試發現,10種藥劑中乳酸環丙沙星、鹽酸環丙沙星、土霉素等對生姜青枯菌具有較強的毒力,但這幾種藥劑無論是采用浸種還是灌根處理,對青枯病防效均不理想,這可能是由于青枯病屬于維管束病害,藥劑的防效與藥劑內吸性有關。硫酸鏈霉素和中生菌素對生姜青枯菌的EC50也較低,說明安徽來源的生姜青枯菌對其敏感,但其值高于番茄或茄子青枯的EC50[5,14],提示安徽銅陵生姜青枯菌可能對這兩種藥劑存在抗藥性。

供試的10種藥劑中，硫酸鏈霉素無論是通過浸種還是灌根，其預防或治療青枯病的效果均為最好，其中以浸種效果最好，接種后32 d，防效仍高達93.0%。浸種效果較好的還有中生菌素，防效為75.9%，而且其防效明顯高于采用灌根進行預防或治療的效果，顯示這兩種藥劑浸種處理可以有效防治生姜青枯病。其他種藥劑浸種處理對生姜青枯病的防效較差，提示它們不適合作為浸種劑應用。

前人研究表明，帶菌土壤是青枯病的主要病源，預防青枯菌的侵入是防治青枯病的關鍵[6,8]。本文采用灌根后接種病原菌的方法評價了供試的10種藥劑對生姜青枯病的預防能力，結果表明接種青枯菌后7 d，硫酸鏈霉素、姜瘟凈、硫酸多粘菌素B的防效在50%以上，但它們的防效隨著時間推移顯著下降，至13 d時，僅硫酸鏈霉素防效為46.7%，其余藥劑防效均低于40%，顯示硫酸鏈霉素對生姜青枯病的殘效期最長，同時也提示，預防青枯病的防治周期應該小于7 d。生物藥劑姜瘟凈、硫酸多粘菌素B、大蒜油在接種后7 d內對生姜青枯病具有一定防效，提示這3種藥劑可部分替代硫酸鏈霉素使用，但防治周期應該相應縮短。

此外，我們還通過接種青枯菌24 h后再灌根的方法評價了供試的10種藥劑對生姜青枯病的治療作用。結果表明，接種青枯菌后5 d，除硫酸鏈霉素外，其他藥劑防效均低于20%，而接種后7 d，除硫酸鏈霉素外，其他藥劑的防效均低于10%，提示這些藥劑對青枯病的治療效果差，或者基本無效。因此，對于已發病的生姜植株，為減少經濟損失，不建議進行藥劑防治，而應該及時拔除，同時對植株周邊土壤進行消毒，防治病原進一步擴散。

綜合本研究結果，硫酸鏈霉素為防治生姜青枯病的首選藥劑，可用于浸種、灌根預防或者治療青枯病。然而，2011年6月22日，農業部辦公廳印發《第八屆全國農藥登記評審委員會第九次全體會議紀要》的通知，停止受理和批準硫酸鏈霉素的新增田間試驗、農藥登記，已批準含有硫酸鏈霉素的產品,其登記證件到期后不再辦理續展登記。因此，硫酸鏈霉素將很快被停止作為農藥使用，尋找硫酸鏈霉素替代藥劑已迫在眉睫，姜瘟凈、中生菌素、硫酸多粘菌素B以及大蒜油對生姜青枯病具有一定的預防作用，提示這些藥劑可以單用或混合使用來替代硫酸鏈霉素，但由于其防治效果較硫酸鏈霉素差，在實踐中應用時，應結合實際情況，調整用藥濃度和用藥周期。

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(責任編輯： 楊明麗)

Indoorsscreeningandevaluationofbactericidescontrollinggingerbacterialwilt

Zhu Zhigang1, Hu Hongtao1, Shi Liqiao1, Cao Chunxia1, Yao Jingwu1, Huang Daye1, Long Tong1, Qiu Zhengming2, Chen Wei1, Yang Ziwen1

(1.HubeiBiopesticideEngineeringResearchCenter,Wuhan430064,China; 2.InstituteofEconomicCrops,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430064,China)

Toxicity of 10 different bactericides onRalstoniasolanacearum, the causal agent of ginger bacterial wilt, was measured by turbidimetry method. The results showed that the toxicity of ciprofloxacin lactate, ciprofloxacin hydrochloride and oxytetracycline were the strongest with the EC50values of 1.75, 1.81 and 2.21 μg/L, respectively, followed by gentamycin sulfate, streptomycin, ceftriaxone sodium and zhongshengmycin, with the EC50values of 11.17,11.23, 19.23 and 24.20 μg/L, respectively. Jiangwenjing, polymyxin B sulfate, and garlic oil had the highest EC50value of 549.61,1 223.22 and 2 064.33 μg/L, respectively. Meantime, the preventing and curing potentials of these 10 bactericides against ginger bacterial wilt were evaluated through pot experiments in 3 different ways, including rhizome soaking with chemicals, root drenching with chemicals followed by pathogen inoculation and pathogen inoculation followed by root drenching. The results showed that the control effects of rhizome soaking with streptomycin and zhongshengmycin were the best, with the control effects of 93.0% and 75.9%, respectively. Streptomycin, polymyxin B sulfate, Jiangwenjing, garlic oil exhibited better prevention effects. Except streptomycin, others showed worse curing effects to ginger bacterial wilt.

ginger; bacterial wilt;Ralstoniasolanacearum; pesticide screening; streptomycin; garlic oil; zhongshengmycin

2017-02-10

2017-03-22

湖北省蔬菜病蟲害生物防治技術集成與產品創制(2016ABA103);湖北省農業創新團隊項目(2016-620-000-001-039)；湖北省農業科學院基金(2016NKYJJ31)

* 通信作者 E-mail:hzh0005@qq.com; 18627186188@126.com

S 432.4

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.036