CdSe量子點的合成、功能化及生物應用

鄧文清，代 蕊，江 雪，羅 虹，黃 科，熊小莉

（四川師范大學化學與材料科學學院，四川 成都 610066）

CdSe量子點的合成、功能化及生物應用

鄧文清，代 蕊，江 雪，羅 虹，黃 科，熊小莉

（四川師范大學化學與材料科學學院，四川 成都 610066）

量子點是一種新型熒光納米材料，具有獨特而優良的熒光性質，近年來受到研究者的廣泛關注。文章綜述蛋白質、抗體、肽類以及DNA等對CdSe量子點（CdSe QDs）的表面功能化作用，以及CdSe QDs在生物傳感分析中的重要研究進展。具體介紹CdSe量子點的多種合成方法（包括有機相合成、水相合成等），蛋白質、抗體、肽類、DNA利用共價鍵或靜電作用對CdSe量子點修飾方法，以及其在生物醫學標記與成像、生物傳感、藥物載送以及癌癥治療等領域的相關應用，最后針對現有研究的不足進行展望。希望通過對CdSe量子點全方位總結與概述，在一定程度上幫助科研工作者快速、準確了解其相關性質與研究進展。

量子點；合成；功能化；生物應用

0 引 言

量子點（QDs），是由幾百到幾千個原子組成的具有量子約束效應的發光半導體納米晶體，其尺寸小于波爾半徑時，會展現出顯著的量子效應。作為一種新的熒光納米材料，量子點具有許多獨特的性質，如尺寸依賴效應、窄而對稱的吸收峰、熒光壽命長以及量子產率高等[1-2]，在生物學領域中應用廣泛[3-4]。CdSe QDs是目前研究比較成熟的一類量子點，相較其他種類的量子點而言，具有顯著的優勢，如在同一波長光的照射下，隨著自身粒徑的不同，CdSe QDs的發射光譜在430～660nm范圍內可調[5]，CdSe QDs熒光量子產率高、易于檢測、合成條件溫和以及合成周期較短等。因此，CdSe量子點長期以來受到廣泛的關注與研究。本文探討了CdSe類QDs的制備及功能化方法，并對其在生物分析領域方面的應用進行了綜述和展望。

1 CdSe QDs的合成方法

半導體量子點的形貌和結構對其固有的磁、電、光性質有很大的影響，不同合成方法制備的QDs的性質不同，其用途也不同；因此，量子點的合成一直以來受到科學家們的廣泛關注。目前有機相合成和水相合成是兩類主要的合成方法。

1.1 有機相合成

有機相合成QDs是最常用的方法之一，其發展主要包括了采用有機金屬作為反應前驅體的有機金屬法和無機金屬作為反應前驅體的綠色化學法兩個階段。

有機金屬法是指在200～400℃高溫條件下將有機金屬前驅體注入配體溶液中，前驅體在高溫條件下迅速熱解并成核，核繼續生長形成量子點的一種方法[6-7]。反應中配體在QDs的表面形成疏水層，可以有效防止QDs發生聚集，因此有機金屬法能夠合成單分散并且具有高穩定性的QDs。采用此方法制備出的QDs有較好的熒光量子產率與光學性質。Bawendi等[8]采用有機合成方法制備了三辛基膦（TOP）/三辛基氧膦（TOPO）包裹的 CdSe QDs 量子點，合成的CdSe QDs具有較好的分散性和均勻的尺寸分布，但是熒光量子產率相對較低。后來研究發現，利用能帶較大的ZnS包被在能帶較小的CdSe表面能有效提高QDs的熒光量子產率，因此逐漸將提高QDs熒光量子產率的方法集中到形成CdSe/ZnS這樣的核殼結構上。Hines等[9]在TOPO/TOP溶劑中合成了熒光量子產率高、穩定性強的CdSe/ZnS QDs。但是有機金屬法也具有很多缺點，如使用的原料較貴且具有較大的毒性，合成過程較危險，易發生爆炸等，限制了此方法的進一步推廣與運用。

后來研究者提出了綠色化學合成法[10]，用穩定性高、毒性低且價格低廉的氧化鎘為原料代替二甲基鎘作為前驅體，與Se溶液混合反應，以此來制備性質優良的CdSe QDs。此方法雖然降低了反應成本，但是在反應過程中還是保留了毒性較強的有機膦溶劑的使用，因此還需尋找更綠色的合成方法。

1.2 水相合成法

水相法制備QDs通常選用水溶性的離子作陰離子前驅體，多官能團小分子作穩定劑，通過加熱回流使QDs在水相中成核并生長熟化[11]。Chen等[12]利用L-半胱氨酸上的巰基和羧基，與納米簇表面的Cd原子形成共價鍵，制得了粒徑均一、具有較高熒光量子產率以及較好生物相容性的CdSe QDs。Wang等[13]在微波輻射的條件下，合成了檸檬酸穩定的CdSe納米粒子，檸檬酸根離子為納米粒子提供足夠的靜電穩定性，以避免納米粒子發生聚集；因此該量子點在水溶液中有較好的單分散性。水相法制備QDs克服了有機合成的缺點，但是該法也存在結晶不完善、表面缺陷多、發光性能較差等問題，故水相合成法也需要進一步的改進。

2 CdSe QDs的表面功能化

盡管CdSe QDs具有許多獨特和優異的物理化學性質與光學性質，但是它也存在一些局限，如生物兼容性低、水溶性較差以及毒性相對較大。為了克服這些缺點，需對量子點表面進行一定的包裹與修飾，近年來文獻陸續報道了各種小分子（包括硫基、聚合物、DNA等修飾劑）包裹修飾的CdSe QDs。制備出的QDs擁有良好的生物相容性，廣泛用于生物小分子的檢測、疾病的診斷與治療、生物傳感等方面，在生物醫學領域有著廣闊的應用前景。

2.1 蛋白質包裹

蛋白質包裹的QDs在生物醫學領域有很多重要的應用，因此將蛋白質作為合成QDs的常用包裹劑。通?？梢酝ㄟ^靜電吸引、共價鍵偶合等方式將蛋白質修飾到QDs表面，其中共價鍵結合是最常用的方式。共價鍵結合是利用蛋白質分子的官能團與量子點表面的官能團發生化學反應生成共價鍵的一種結合方式。由于蛋白質存在氨基與巰基，很容易與氨基、羧基修飾的QDs形成共價鍵相互偶合。使用新型蛋白（天然植物螯合肽）綁定在水溶性較差的CdSe/ZnS QDs上時，能夠增加QDs的水溶性，并且被包裹的QDs呈現出很高的膠態穩定性，在水溶液中保持很高的量子產率，能夠與不同的功能團進行生物偶聯（如圖1[14]所示）。

圖1 量子點表面活性劑與γPC3肽交換原理圖[14]

其結果表明，很多γ結構肽能夠在有硫醇結構的QDs表面進行定向綁定，這些優化的QDs能夠用于活細胞成像和斑馬魚體內成像及可視化傳感。多價態蛋白質配體與QDs的自組裝對于QDs的表面功能化已經成為了一種很重要的方法，并且在生物領域有著廣泛的應用[15-16]。如圖2所示，Xia等[17]基于熒光共振能量轉移（FRET）的原理研究了CdSe/ZnS QDs與不同幾何結構和構架的多價蛋白配體的組裝，結果表明在有限的空間下多價蛋白與QDs的綁定序列能夠緊密結合，以獲得直接、穩定的蛋白質與QDs的復合物。這一結論對于指導QDs與多價配體的設計是非常有用的，該方法也成功用于生物分子體內成像。

圖2 GCN-mCherry與谷胱甘肽包裹的CdSe/ZnS量子點發生自組裝導致熒光共振能量轉移示意圖[17]

蛋白質修飾QDs除應用于生物體內成像，也常用于離子的檢測和小分子特異性結合。如用變性的牛血清白蛋白（dBSA）合成了dBSA包裹的CdSe量子點（dBSA-CdSe），dBSA上游離的半胱氨酸殘基，能夠有效的與金屬離子螯合以及在形成穩定CdSe時起到表面鈍化作用，當Cu2+出現時，與量子點相互響應，進而猝滅量子點的熒光。這種QDs能夠高靈敏地檢測Cu2+，對Cu2+的檢出限達到5nmol/L[18]（如圖3所示）。

Snee等[19]用羅丹明哌嗪-賴氨酸-生物素（RBpip-Biotin）與CdSe/ZnS量子點進行偶聯，再用凝血素修飾，生成由凝血素包裹的QDs，并以此建立了比率傳感高靈敏檢測蛋白質的方法，其檢測限低至1 pmol/mL。Mattoussi等[20]則通過將辛硫酸包裹的CdSe/ZnS量子點與重組麥芽糖結合蛋白（MBP）進行偶聯得到QD-MBP，這種蛋白包裹的QDs既保留了QDs的光學性質又保留了麥芽糖結合蛋白的生物活性。

圖3 dBSA包裹CdSe量子點的合成與熒光猝滅的原理圖[18]

2.2 抗體的包裹

抗體是一種能特異性結合抗原的糖蛋白，將抗體連接在量子點上能夠使QDs上的抗體與生物體內的抗原進行特異性結合，進而能夠定性定量地檢測生物體內的生物分子。當生物體內器官發生病變時，會導致此器官內的某些分子過度表達或降低表達；因此，抗體修飾的QDs能夠在生物體內作為熒光傳感檢測腫瘤細胞?？贵w與量子點的結合方法分為非共價結合和共價結合，非共價結合多采用生物素-親和素連接方式。共價結合為抗體與量子點的表面功能基團通過1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的活化作用相互反應生成共價鍵，最常用到的結合方式為氨基與羧基、氨基與巰基、醛基與酰肼的結合[21]（如圖4所示）。Pang等[22]合成羧基化的CdSe/ZnS量子點，用EDC和N-羥基琥珀亞酰胺（NHS）作為活化劑活化QDs表面的官能團，使其能快速與MC02抗體進行偶合，利用MC02抗體修飾的QDs能夠靈敏地定量檢測C反應蛋白，在緩沖液中對C反應蛋白的檢出限為27.8 pmol/L，而在血清中檢出限為34.8pmol/L，較高的靈敏度能夠作為精確診斷細菌、病毒感染以及其他類型癌癥的判斷基礎。CdSe/ZnS與免疫球蛋白（IgG）和鏈霉素連接用來標記活細胞表面的乳腺癌腫瘤標志物Her2，對細胞質中的肌動蛋白和微管纖維進行染色，并檢測細胞核內的核抗原[23]。

2.3 肽類包裹

圖4 量子點-抗體生物偶聯的原理示意圖[21]

肽類作為常見的生物分子也常常用來修飾QDs。肽類與量子點的結合常利用肽類表面的氨基和巰基，與量子點表面的氨基和羧基以共價鍵方式結合。Willner等[24]合成了谷胱甘肽（GSH）包裹的 CdSe/ZnS量子點，用于分析酪蛋白激酶（CK2）的光學性質和堿性磷酸酶（ALP）的水解活性。Dawson等[25]利用兩性離子配體功能化CdSe/ZnS量子點與棕櫚酸結合肽偶聯，在小雞胚胎第四天時注入小雞胚胎脊髓用來傳送以及追蹤QDs的行動軌跡。類似的利用金屬與六聚組氨酸肽相互作用進行自組裝已經作為一個有效的、定點的方法來對CdSe/ZnS量子點與蛋白質進行表面修飾[26-27]。另外，利用生物仿生法合成小分子包裹QDs的方法相對簡單，也得到了廣泛推廣。Chen等[28]利用生物仿生方法使用雙功能肽合成了由肽鏈包裹的CdSe/ZnS核殼半導體晶體。這種方法對于核殼量子點的合成有非常重要的指導意義。通常，磷脂質也會被用來包裹QDs，Kim等[29]將CdSe/CdS/ZnS QDs與透明質酸（HA）合成了 HA-QD，結構穩定，尺寸可調并且可以應用于標記淋巴血管。

2.4 DNA包裹

DNA功能化的QDs在生物應用方面扮演著重要的角色，單鏈DNA能夠識別互補的DNA/RNA通過堿基互補配對形成正常的螺旋結構，因此用DNA功能化的QDs能夠檢測病毒和細菌中的DNA片段[30]以及小RNA[31]。DNA也能夠作為適配體，與目標分子有很高的親和性。這些適配體功能化的量子點能夠用來檢測離子、蛋白，或用于疾病診斷[32-33]和細胞成像[34]。

DNA包裹QDs一般采用兩種方法：1）利用生物素-鏈酶親和素的化學反應方法，其原理是用鏈酶親和素包裹的QDs在預先設計的DNA展現生物素分子的特定區域進行自組裝，形成所需要的產物；2）DNA修飾的QDs與DNA攜帶互補序列的捕獲鏈進行雜交[35]。DNA與QDs之間結合的方式有靜電吸引以及共價鍵結合[36]（如圖5所示）。

Sharma等[37]基于DNA二維陣列合成鏈酶親和素功能化CdSe量子點。Zhao等[38]則將寡核苷酸連接在3-巰基丙酸修飾的CdSe/ZnS量子點表面形成功能化的QD-DNA偶聯物，用來檢測乙型肝炎病毒的DNA和單堿基突變。

3 CdSe QDs在生物方面的應用

半導體QDs是一類重要的熒光標記物，他們擁有獨特的光學性質并且能夠與醫學和成像技術相結合而用于分子和細胞成像，包括體內與體外成像、熒光壽命成像、靶向細胞成像、藥物傳送等方面。

3.1 生物醫學標記與成像

通常，QDs進入細胞通過4種途徑：1）通過內吞作用被細胞吸入；2）由受體調節與細胞膜相互作用并且內吞；3）物理處理促進細胞遞送；4）組合方法[39]。探討QDs進入細胞的途徑有利于促進量子點在細胞生物學方面的應用，比如靶向細胞成像和生物進程的監測。Weiss等[40]用兩種不同顏色的硅包裹的CdSe/ZnS量子點可以同時對小鼠纖維細胞實現雙色成像。使用生物分子或小分子包裹的CdSe類QDs很多都能夠進行生物成像。此外，Zhang等[41]用單域抗體（sdAbs）功能化 CdSe/ZnS量子點（sdAbs-CdSe/ZnS），根據抗原抗體特異性結合的原理，sdAbs-CdSe/ZnS能夠特異性識別并標記表皮生長因子受體（EGFR），這就使QDs能夠對EGFR表達異常的癌細胞進行生物成像。這些QDs能夠在細胞環境中穩定存在，并且抗光漂白能力強。Mulder等[42]將疏水的CdSe量子點植入聚乙二醇脂質和順磁性脂質制備了具有良好的光學性質與高弛豫效能的順磁性量子點。當與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸共軛后，此磁性量子點能夠用來對人臍靜脈內皮細胞成像。

3.2 生物傳感

圖5 生物偶合方法的示意圖

功能化的半導體QDs可以作為不同的生物傳感器，其原理是QDs直接作為熒光標記靶向生物分子，QDs上的配體鏈識別目標分子，并且QDs的熒光信號的變化可以反應目標分子的數量。熒光信號的改變通常是由QDs與臨近目標分子之間發生電荷轉移或者電子轉移造成的。由于QDs的熒光與其表面狀態關系密切，因此當目標分子連接或者替換QDs表面的物質時會導致QDs的熒光增強或者猝滅。除了目標分子的連接或替換，還有一種方式也能引起QDs的熒光變化，即量子點與目標分子之間發生FRET[43]。通常發生FRET需要滿足兩個重要的條件：1）供體的發射光譜與受體的吸收光譜之間有重疊；2）供體與受體之間有適當的有效距離（1～10nm）。對QDs表面功能化可以使QDs作為能量供體或能量受體，當目標分子出現時就可能導致能量轉移的發生或終止。圖6總結了QDs作為發光生物傳感器和能量轉移傳感器的典型的傳感機制[44]。

為監測絡氨酸酶的活性，Gill等[45]將CdSe/ZnS QDs與絡氨酸甲脂和含有絡氨酸殘基的肽偶聯，絡氨酸酶通過氧氣誘導絡氨酸氧化形成鄰-苯醌，從而猝滅QDs的熒光，因此通過QDs熒光的猝滅就能夠監測絡氨酸酶的活性。當鄰-苯醌從QDs表面移除后又會使QDs的熒光恢復，因此加入有特異性凝血酶分裂位點的肽能夠進一步監測凝血酶活性。Dubertret等[46]將CdSe/ZnS QDs包裹在磷脂嵌段共聚物膠囊中，得到尺寸均勻、形狀規則、單分散的熒光QDs膠囊，用于體內和體外成像。當QDs與DNA進行偶聯，可作為熒光探針與互補鏈進行特異性雜交。此外，將QDs膠囊注入非洲爪蟾胚胎時，可用于在胚胎形成過程中進行血統追蹤實驗?；贔RET原理，Algar等[47]用兩個供體和一個受體形成的同軸FRET傳感器用來檢測胰蛋白酶的活性，且其檢測限達到nMol水平。隨后，他們還構建了一個同軸FRET的多功能傳感器，能夠用于同時檢測蛋白酶的濃度與活性[48]（如圖 7 所示）。

圖6 不同量子點作為傳感器的傳感機理[44]

圖7 量子點作為同軸熒光共振能量轉移傳感器同時檢測凝血酶的濃度和凝血酶的活性的示意圖[48]

Huang等[49]基于FRET原理利用巰基丁二酸（MSA）修飾的CdSe/ZnS QDs和葡萄糖氧化酶定性、定量檢測葡萄糖。無葡萄糖存在時，由于葡萄糖氧化酶與QDs發生FRET，QDs的熒光明顯增強，加入葡萄糖后，葡萄糖氧化酶與葡萄糖相互發生反應，阻礙了FRET的發生，故使得QDs的熒光發生降低甚至猝滅。此方法中葡萄糖的濃度在0.2～10mmol/L與2～30mmol/L的范圍內與QDs的熒光強度呈較好的線性關系。用修飾后的QDs制備的傳感器，能夠對生物體內進行可視化檢測，并且檢出限低，反應靈敏，結果準確。

3.3 藥物載送以及癌癥治療

量子點在腫瘤標志物的傳感與成像的成功應用為早期臨床診斷、高通量篩選和視覺手術指導的進一步應用提供了基礎[50]。由于他們顯著的高熒光性、大的比表面積以及各種共軛的柔性層，致使量子點在藥物載送與釋放中扮演多重角色。此外，量子點與高容量生物相容的納米載體的結合能夠有效提高其穩定性、生物相容性以及藥物載送的能力。Minko等[51]構建量子點-黏蛋白和阿霉素（DOX）的共軛體系用于卵巢癌細胞中靶向藥物治療，量子點-黏蛋白與DOX的共軛體系的制備首先通過氨基修飾的黏蛋白與羧基修飾的量子點通過碳二酰胺反應結合；隨后量子點與DOX通過形成酸不穩定腙鍵相互結合。量子點與DOX發生熒光共振能量轉移，可以猝滅量子點的熒光。然而，癌組織的酸性溶酶體室和酸性微環境可能會瓦解QD-黏蛋白-DOX之間的腙鍵，導致DOX的釋放進而使得量子點到DOX的熒光共振能量轉移作用被終止，量子點熒光的恢復可以用來監測藥物在癌細胞中的釋放。Farokhzad等[52]展示了多功能的量子點-適配體的共軛體系同時用于癌癥成像和靶向藥物遞送。量子點-適配體的共軛通過羧基修飾的量子點與氨基修飾的適配體反應生成，量子點的功能用于體內成像和藥物載體。Park等[53]構建了量子點與免疫脂質體的共軛體系用于靶向腫瘤細胞成像與藥物載送。免疫脂質體與量子點的復合物通過將抗人表皮生長因子單克隆抗體片段連接在脂質體上，隨后與量子點相互結合。這些免疫脂質體-QD混合物能夠有效地將抗癌藥物DOX載送到人表皮生長因子過度表達的細胞，從而達到成像與藥物治療的目的。

4 結束語

CdSe QDs憑借自身突出的物理化學性能和獨特的光學性質，使其在生物傳感、疾病檢測、小分子的檢測、藥物載送等方面有著非常廣泛的應用，在生物傳感分析與生物醫學方面展示了舉足輕重的作用。但是將CdSe QDs用于生物體內還是存在很多局限性：1）生物體與環境樣本比較復雜，通常會嚴重干擾CdSe類QDs對生物分子的識別與標記而導致假陽性；2）CdSe類QDs作為傳感器難以在復雜的生物體與環境中同時鑒定與檢測多元生物分子；3）如何合成高通量和高水溶性的CdSe類QDs；4）如何降低CdSe類QDs在生物體中的毒性。隨著科學家們的不斷努力，相信CdSe QDs存在的局限都會被一一克服，并且能夠在生物領域內發揮更大的作用。

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（編輯：莫婕）

Synthesis，functionalization and bio-applications of CdSe quantum dots

DENG Wenqing， DAI Rui， JIANG Xue， LUO Hong， HUANG Ke， XIONG Xiaoli
（College of Chemistry and Materials Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610066，China）

Quantum dots， anew kind ofluminescentnanometermaterialwith uniqueand excellent fluorescent properties，have drawn much attention of researchers in recent years.In this article， the surface functionalization of proteins， antibodies， peptides and DNA on the CdSe quantum dots （CdSe QDs） and its important research progress in biosensor analysis have been reviewed in details.This article specifically introduced the various synthetic methods of CdSe QDs including organic phase synthesis， aqueous synthesis and so on， the modification of proteins，antibodies， peptides and DNA for CdSe QDs by covalent bond or electrostatic interactions， and its application in biological fields， such as biomedical labeling and imaging， biosensor， drug delivery and cancer treatment.Finally，a summary and expectation for the deficiency of related study of CdSe QDs have been made.It will be helpful for researchers to understand their related properties and research progress quickly and accurately to some extent based on all-around summary and overview for CdSe QDs.

quantum dots； synthesis； functional； bio-application

A

1674-5124（2017）11-0051-08

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.11.011

2017-03-18；

2017-05-10

國家自然科學基金（21605108）；四川師范大學實驗室及設備管理處基金（ZZYQ2016-1）

鄧文清（1992-），女，四川廣安市人，碩士研究生，專業方向為光譜分析。

黃 科（1987-），男，四川成都市人，實驗師，主要從事光譜分析研究。